胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化
2015年10月21日
頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。
次の実験の全体的な目標は、ゼブラボウクローン細胞分析を通じて軟骨細胞の相互照合と伸長を視覚化することです。これは、SOX 10 ERT two Cree zebra bow Mラインを生成して、クローン分析用の頭蓋顔面軟骨および胚の組織特異的な組換えを達成することによって達成されます。次に、胚にタモキシフェンを10でパルス化しますので、組換えプロセスを誘導するために3時間ダニの段階を過ごします。
次に、CRE活性の発現と強い赤色蛍光またはRFPの発現のために胚を選択し、C頭蓋顔面軟骨のイメージングのために胚をマウントします。結果は、共焦点イメージングに基づく頭蓋顔面軟骨細胞のマルチスペクトル細胞解析を示しています。この技術の主な利点は、青色染色のSのような既存の方法や、SOPやGFPやSOXやkdeなどのトランスジェニック系統と比較すると、ゼブラボウを使用すると、臓器形成に関与するクローン細胞集団を特異的に観察し、追跡できることです。
初日の胚収集の準備として、胚がRFPフィルター付きの蛍光顕微鏡下で胚が10セルライト段階に達したことを光学顕微鏡で確認した後、翌日の午後5時から6:00の間に分割された交配水槽にソックス、10 ERTの2つのクリーシマウマ弓Mトランスジェニックゼブラフィッシュのいくつかのオスとメスのペアを設定します。真っ赤な胚を分離し、新鮮なE 3培地で新しいシャーレに移してクリー族の組換えを誘導します。10マイクロモルのヒドロキシタモキシフェン溶液をペトリ皿に加え、胚を摂氏28.5度で3時間インキュベートします。
次に、タモキシフェン溶液を生物学的廃棄物容器にデカントし、胚を一晩インキュベートした後、E 3を使用して胚を数回洗浄します。したがって、ダニの段階で、胚をE 3 PTU溶液に移し、インキュベーターに戻します。完全に発達したC頭蓋顔面構造を視覚化するには、網膜で強い赤色信号と黄色のクリー族の発現を示す4つのDPFで胚を選択します。トリカで胚を麻酔した後、テキストプロトコルに従って、きれいな共焦点スライド上のメチルセルロースの滴を含むペトリ皿に移します。
新鮮なメチルセルロースを一滴垂らし、マイクロローダーチップを使用して、25 x 25のカバースリップで直接触れないように注意しながら、背側に配置された胚をマウントします。胚を覆い、必要に応じてカバースリップを使用して胚を操作します。胚を画像化するには、20倍ドライレンズ対物レンズを使用します。
被写体に焦点を合わせるには、顕微鏡のL 100ボタンを押してから、共焦点セットアップボタンを選択します。[auto] をクリックし、チャネル 1 の CFP を選択し、チャネル 2 の GFP、チャネル 3 の RFP または M チェリーを選択します。次に、ウィンドウを閉じます。
チャンネル2とチャンネル3をオンにしてから、インターロックの解除ボタンをクリックします。次に、[再生]をクリックしてスキャンを開始します。設定を調整した後、目的の画像をキャプチャし、共焦点ソフトウェア形式と、チャネルごとの画像処理用のTIF形式で保存します。
CFPイメージングを行うには、フォーカスエリアを変更せずにチャンネル2とチャンネル3をオフにし、チャンネル1をオンにしてください。画像をキャプチャする前にスキャン設定を再調整し、説明したように画像を保存し、ここに示すようにpanと同僚の説明に従って画像処理を実行します。マウントシアン全体の青色染色による従来の軟骨の可視化は、発達中のメケル軟骨を観察する上で非常に貴重であり、最終的な細胞組織を視覚化して、経時的な系統追跡を通じて発達中の軟骨細胞をさらに分析するために一般的に使用されています。
SOX 10 kda トランスジェニック系統を使用して、Zebra bow m トランスジェニック系統のライブイメージングを使用して、生きた胚の細胞遊走と収束および伸長を研究しています。C頭蓋顔面骨格構造における軟骨細胞の組織化をさらに研究するために、メッケル軟骨の伸長と成長を媒介する軟骨細胞の相互照合と伸長のプロセスが明らかになります。この図は、3D PFから受精後5日までのUIシマウマ弓Mソックス10ERTからの下顎を示しています。
下顎は、ここに示すように、近接軟骨の細胞組織を明確に見ることができるように、腹側に描くのが最適です。安定して維持され、受け継がれた色彩により、系統のトレースや脳神経堤細胞の運命マッピングが容易になります。単一の青い細胞は、隣接する細胞とともに移動して補間し、その後、前後軸に沿って伸長して均一な形状の軟骨部位を形成し、したがって、メレス軟骨が前方に伸びるときに全体的な形状を維持します。
この技術は、ネコの発生分野の研究者がゼブラフィッシュの骨格形成におけるコンドロを調べる道を開くものです。
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概要
この研究では、Zebrabowトランスジェニック魚を使用してゼブラフィッシュの頭蓋顔面軟骨における軟骨細胞の間挿と伸長を視覚化するプロトコルを提示します。この技術により、器官形成中の動的な細胞挙動を直接観察することができます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- 頭蓋顔面骨の組織は仮説的に想定されていますが、直接的には視覚化されていません。
- 軟骨細胞は軟骨の発達において重要な役割を果たしています。
- 細胞挙動を研究する既存の方法には限界があります。
- Zebrabow技術により、細胞集団のクローン分析が可能になります。
研究の目的
- 軟骨細胞の間挿と形態学的変化を視覚化する。
- Zebrabowが従来の方法に比べて有利であることを示す。
- この分野の研究者向けに詳細なプロトコルを提供する。
使用した方法
- 組織特異的な組み換えのためのSOX 10 ERT2 Cre Zebrabow Mラインの生成。
- 組み換えを誘導するための胚のタモキシフェンパルス。
- CRE活性とRFP発現に基づく胚の選択。
- 頭蓋顔面軟骨細胞の多波長分析のための共焦点イメージング。
主な結果
- 軟骨細胞の間挿と伸長の成功した視覚化。
- 器官形成に関与するクローン細胞集団の実証。
- Zebrabow技術と既存の方法の比較。
- 頭蓋顔面軟骨における動的な細胞挙動への洞察。
結論
- Zebrabow技術は頭蓋顔面の発達を研究するための強力なツールを提供します。
- この方法は軟骨細胞のダイナミクスの理解を深めます。
- 将来的には、発生生物学の他の分野にも応用される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte intercalation mechanisms that drive Meckel’s cartilage extension.
- Scientific Value: Supports functional validation of clonal contributions to craniofacial skeletal patterning.
- Scientific Value: Provides direct observation of cellular behaviors underlying hypoplastic mandible phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates multispectral clonal readouts for quantitative assessment of chondrocyte dynamics.
- Operational Value: Establishes a reproducible lineage-tracing platform for live imaging of cartilage morphogenesis.
- Operational Value: Enables standardized clonal analysis across developmental timepoints for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links clonal chondrocyte behavior to mandibular outgrowth, informing disease-relevant system relevance.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular basis of mandibular hypoplasia.
- Translational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of craniofacial growth pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chondrocyte-driven tissue extension mechanisms in craniofacial development.
- Screening: Delivers quantitative, multispectral clonal outputs enabling reproducible assessment of chondrocyte organization.
- Analytics: Provides clonal lineage tracing and morphological metrics that allow comparison of cellular behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects clonal chondrocyte dynamics to mandibular morphogenesis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clonal imaging platform applicable to multiple organogenesis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of chondrocyte intercalation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via inherited fluorescent clonal labeling.
- Strategic Value: Reduced biological risk in craniofacial therapeutic development via mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets affecting mandibular growth and patterning.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling and clonal lineage tracing.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure for multispectral imaging.
- Necessitates standardized tamoxifen induction protocols for consistent recombination.
- Involves adaptation considerations for applying clonal analysis to other skeletal or tissue systems.
- Limited by the need for precise embryonic staging and fluorescent selection for clonal induction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
