胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

本実験の総合的な目的は、ゼブラボー（zebra bow）クローナル細胞解析を用いて、軟骨細胞の相互配置および伸展を可視化することです。これは、頭蓋顔面軟骨において組織特異的な組換えを実現させるため、SOX 10 ERT2 Cre ゼブラボー M ラインを作製し、クローナル解析に用いることで達成されます。次に、組換えプロセスを誘導するため、10体節期の胚にタモキシフェンを3時間パルス投与します。

次に、CRE活性の発現および強い赤色蛍光またはRFP発現が見られる胚を選択し、C頭蓋顔面軟骨のイメージングのために胚を固定します。結果は、共焦点イメージングに基づく頭蓋顔面軟骨細胞のマルチスペクトル細胞解析を示しています。S青色染色や、soおよびGFP、あるいはSOXおよびkdeなどのトランスジェニック系統といった既存の手法に対するこの技術の主な利点は、zebra bowを用いることで、器官形成に関与するクローン細胞集団を特異的に観察し、追跡できることです。

1日目の胚回収に備え、午後5時から6時の間に、分割交配タンクにsox, 10 ERT two Cree zebra bow M トランスジェニックゼブラフィッシュのオスとメスのペアを数組セットアップします。翌日、光学顕微鏡で胚が10細胞期に達していることを確認した後、RFPフィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察します。鮮やかな赤色の胚を分離し、Cre組み換えを誘導するため、新鮮なE3培地を入れた新しいペトリ皿に移します。ペトリ皿に10 µMのヒドロキシタモキシフェン溶液を加え、胚を28.5 °Cで3時間インキュベートします。

その後、タモキシフェン溶液をバイオハザード廃棄物容器にデカンテーションして廃棄し、E3を用いて胚を数回洗浄します。胚を一夜 incubation し、28〜29ソマイト期に達した後、胚をE3 PTU溶液に移してインキュベーターに戻します。完全に発達した頭蓋顔面構造を可視化するために、網膜に強い赤色シグナルと黄色いCree発現が見られる4 DPFの胚を選択します。テキストのプロトコルに従ってトリカインで胚を麻酔した後、きれいな共焦点スライド上のメチルセルロースの一滴が入ったペトリ皿に胚を移します。

新鮮なメチルセルロースを1滴滴下し、マイクロローダーチップを使用して、胚が背側を向くように配置してマウントします。この際、25 × 25のカバーガラスで胚に直接触れないよう注意してください。胚をカバーガラスで覆い、必要に応じてカバーガラスを用いて胚を操作します。胚を観察するには、20xのドライ対物レンズを使用してください。

被写体に焦点を合わせるには、顕微鏡のL 100ボタンを押し、共焦点セットアップボタンを選択します。「auto」をクリックし、チャンネル1にCFP、チャンネル2にGFP、チャンネル3にRFPまたはM cherryを選択します。その後、ウィンドウを閉じます。

インターロック解除ボタンをクリックする前に、チャンネル2と3をオンにします。次に、再生ボタンをクリックしてスキャンを開始します。設定を調整した後、目的の画像をキャプチャし、共焦点顕微鏡ソフトウェア形式およびチャンネルごとの画像処理用のTIF形式で保存します。

CFPイメージングを行うには、フォーカスエリアを変更せずにチャンネル2と3をオフにし、チャンネル1をオンにします。画像をキャプチャする前にスキャン設定を再調整し、前述の方法で画像を保存し、ここに示すPanらによって記述された方法で画像処理を行います。ホールマウントのアルシアンブルー染色による伝統的な軟骨可視化は、発達中のメッケル軟骨の観察において極めて有用であり、また、リネージトレーシングを用いて発達中の軟骨細胞を経時的にさらに分析するための最終的な細胞組織化を可視化するためによく用いられています。

SOX 10 kda トランスジェニック系統は、ゼブラフィッシュ bow M トランスジェニック系統を用いたライブイメージングにより、生体胚における細胞移動、収束および伸展を研究するために利用されてきました。頭蓋顔面骨格構造における軟骨細胞の組織化をさらに研究することで、メッケル軟骨の伸展と成長を媒介する軟骨細胞の間隙充填（インターカレーション）および伸長プロセスが明らかになります。この図は、受精後 3DPF から 5DPF の zebrafish bow M Sox 10 ERT two Cree トランスジェニック胚の下顎を示しています。

下顎は、ここに示されているように、メレス軟骨における細胞構成を明確に観察するために腹側から撮影するのが最適です。安定して維持および継承される色は、簡便な系統追跡および頭部神経堤細胞の運命マッピングを可能にします。単一の青色細胞は、隣接する細胞の間を移動し、挿入されるように見え、その後、前後軸に沿って伸長して均一な形状の軟骨部位を形成し、これにより、前方へ伸展する際のメレス軟骨の全体的な形状が維持されます。

この手法は、ゼブラフィッシュの骨格形成における軟骨を調べることで、魚類の発生分野の研究者に道を開くものです。