セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステム

この手順の全体的な目的は、多くの哺乳類細胞がより硬い基質へと優先的に遊走する細胞デュロタキシス（cell durotaxis）を解析するための簡便なシステムを提供することです。まず、剛性を定義したポリメチルシロキサン（PDMS）基質を調製します。次に、調製したPDMSを6ウェルプレートの各ウェルに流し込み、気泡を除去します。

次に、各ウェルのPDMSの上に滅菌済みのカバーガラスを配置してオーバーレイを作成し、Durexチャンバーを完成させます。最終ステップとして、他の細胞との過度な相互作用を避けつつ、細胞が遊走するための十分なスペースが確保できる密度で、Duro taxesチャンバーに細胞を播種します。最終的に、ライブセルイメージングを用いて、遊走細胞における軸を解析します。

ポリアクリルアミドなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、勾配ゲルなどの代替案ではなく、柔軟なPDMSと剛性の高いガラスの間に単一のステップが存在することです。また、フィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分でPDMSをコーティングする場合、ポリアクリルアミドゲルのように化学的架橋を行う必要はありません。6ウェル組織培養プレート1枚を準備するために、まず50 milliliterコニカルチューブを用いてバランスを調整してください。

50 mLチューブに、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース溶液を約10 g量り取ります。基材比を90:1にする場合は、量り取ったPDMSベース溶液の重量を90で除します。必要な架橋剤溶液の正確な量を決定し、算出された量のPDMS架橋剤溶液をチューブに加えます。PDMSベースと架橋剤の混合物を、室温で5分間激しく混合します。

この段階で小型のスパチュラを使用すると、混合物の中に少量の気泡が含まれます。ベンチトップ遠心分離機を用い、PDMS基材を50×gで5分間遠心分離します。まだ気泡が残っている場合は、室温に置いて気泡を除去してください。

5分間の遠心分離後、組織培養処理済み6ウェルプレートの各ウェルに、PDMS基材（90:1）を1 mLずつピペットで分注します。PDMS内に気泡が残っている場合は、この段階で21ゲージの針を用いて気泡を潰して除去します。

PDMSをウェル内で30分間静置し、広げます。次に、12 mmのガラスカバーガラス（No.1）を蒸留湯で5分間煮沸し、この操作を計3回繰り返します。乾燥させたカバーガラスを、カバーの一端にそっと触れさせながら、組織培養プレートの各ウェルに1枚ずつ配置します。

カバースリップをPDMS溶液に浸し、その後カバースリップをPDMSの上に落とします。カバースリップが沈むにつれて、PDMSがカバースリップの端にまではみ出しますが、完全に覆い尽くすことはありません。これにより、硬化後にPDMSとガラスの間に界面が形成されます。

PDMSを硬化させるため、プレートをオーブンに入れ70 °Cで16時間インキュベートします。最後に、プレートをセルカルチャーフード内に置き、10分間UV滅菌します。各duroxチャンバーに、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で調製した1 mLのフィブロネクチンを加え、30 °Cで1時間コーティングします。

表面全体がPBS溶解フィブロネクチン溶液に浸かっていることを確認します。0.5gのBSAを50mLのPBSに溶解し、0.22µmフィルターでろ過して、熱変性1%牛血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。溶液を0.22µmフィルターで滅菌した後、80°Cで12分間加熱します。

次に、フィブロネクチン溶液を吸引し、チャンバーをPBSで3回洗浄します。各ウェルにPBSで熱変性させたBSAを1 mL加え、室温で30分間インキュベートし、Durexチャンバーを熱変性BSAでブロッキングしている間に、トリプシン処理を行い、目的の細胞をカウントします。細胞を播種する直前に、チャンバーからBSA溶液を吸引します。

doaxチャンバーの各ウェルに、10,000個の細胞を2 mLの容量で播種します。選択した特定の細胞型に必要な培地を用い、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で4時間、細胞を基質に接着および伸展させます。その後、倒立顕微鏡を用いて、10倍対物レンズの位相差観察による生細胞イメージングを行います。顕微鏡には密閉された環境加湿チャンバーが装着されており、長期イメージング中に温度を37 °C、CO2濃度を5%に制御できる必要があります。

細胞が約3.5時間かけて展展した後、プレートを顕微鏡チャンバーにセットします。サンプルをチャンバー内で30分間平衡化させます。顕微鏡に自動マルチポイントビジティング機能がある場合は、それを設定してください。

PDMSとガラスカバースリップの界面に注目し、界面の周囲全体を撮像するためのポイントを選択します。Durexチャンバーの画像につき平均40ポイントで、最大16時間まで10分ごとに細胞を撮像すると、関心領域は2本の線として現れます。外側の線はカバースリップの端に、内側の線はPDMSとカバースリップの実際の界面に対応します。データを分析するには、テキストプロトコルに示されているようなスプレッドシートを作成してください。

作成された各動画から、PDMSからガラス表面へ、およびその逆方向への交差イベントの回数をカウントします。交差イベントとは、細胞核がPDMSとガラスの境界をどちらの方向へも通過することを定義します。複数回の交差を定量化するため、交差イベントの回数をExcelスプレッドシートの適切な列に記録してください。

細胞がインターフェースを横切った回数をカウントします。その回数を、動画の終了時に細胞が位置していた基質に対応するExcelの列に記録してください。動画内でインターフェースを横切るすべての細胞について、この解析を繰り返します。

イメージング中に視野外に移動した細胞は除外します。PDMSからガラス表面に移動し、その結果デュロタキシス（durotaxis）を起こした細胞の割合を算出します。算出方法は以下の通りです。

ソフトからハードへの交差イベント数と、ハードで終了した複数回の交差イベント数を加算し、それを全交差イベント数で除します。また、複数回交差の総数を全交差数で除して、複数回交差の割合を算出します。これにより、細胞が周囲環境の機械的刺激にどのように反応するかという分子メカニズムの理解を深めます。ここで示すように、shRNAを用いて特定のタンパク質をノックダウンすることが可能です。

コントロールのirna処理細胞の約70%に軸索伸展（axxis）が見られました。対照的に、RNAiを用いてCD gapをノックダウンすると、細胞は硬い基質か柔らかい基質のどちらへ遊走するかという選択性を失いました。さらに、CD gapノックダウン細胞は境界を何度も横切りました。

コントロールirna処理細胞は一般的に境界を一度しか越えませんが、コントロールirna細胞の代表的なトラッキング結果は、細胞が一般的に境界を一度越え、CD gapと比較してより剛性の高い表面に優先的に留まることを示しています。一方で、いずれの剛性に対しても優先性を示さなかったirna処理細胞は、境界を複数回越えていました。

このビデオを視聴することで、PDMS基板の作製方法、durisチャンバーの組み立て方法、およびDUR taxesの定量方法について十分に理解することができます。