Name: セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステムインビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶセルMechanosensingとDurotaxis評価の簡略化システム。PDMS基板を用いて哺乳類細胞の硬い基板への優先的移動を観察し、細胞生物学と組織工学の研究に活用できます。

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この作品は、NIH R01 GM47607、CA163296およびCETにNSF 1334493によってサポートされています。私たちは、原稿の重要な読書のためのターナーラボのメンバーに感謝します。このレポートに表示されるすべてのデータは、駆虫剤ら。2014年11から許可を得て再現されました。

Durotaxisチェンバースの調製<ol><li> 1つの6ウェル組織培養プレートを調製するために、50 mlのコニカルチューブとのバランスを風袋引き。 50 mlチューブ中のPDMSベース溶液約10グラムを秤量（溶液は非常に粘性があります）。 </li><li> 90：1の基板（〜1キロパスカルのコンプライアンス）、必要に応じて架橋剤溶液の正確な量を決定するために90によってチューブ内のPDMS塩基溶液の測定された重量を分割。同じチューブにPDMSの架橋剤溶液の計算された量を追加します。 例：10グラム/ 90 = 0.11グラム。 PDMSベースのソリューションへのPDMS架橋剤溶液の0.11グラムを追加します。 注：ベースと架橋剤溶液は、両方のPDMSキットで提供されています。 </li><li>精力的に小さなへらを使用して室温で5分間、PDMSベース/架橋剤混合物を混ぜます。この段階で、混合物を多数の気泡を含むであろう。 </li><li> BUBを除去するために、室温で50×gで5分間、卓上遠心機でPDMS基板を遠心BLES。残っている場合は、再び5分、遠心分離後に泡。 </li><li> 90 mlのピ​​ペット1：組織培養の各ウェルに1 PDMS基板を6ウェルプレートを処理しました。 PDMS中に存在する任意の残存する気泡が21 G針を使用してそれらをポップすることにより、この段階で除去することができます。 PDMSは、ウェル中の30分間の広がりを許可します。 </li><li>ボイル12ミリメートルのガラス＃5分間蒸留水で1カバースリップ。 2回繰り返し、蒸留水にカバースリップを格納します。 </li><li>静かにPDMS上にカバーガラスをドロップし、PDMS溶液にカバースリップの片側をタッチすることで、組織培養プレートの各ウェルに1、乾燥したカバーガラスを配置します。カバーガラスが安定するように、PDMSはカバーガラスの縁の上に侵入し始めますが、それを完全にカバーしています。これは、（ 図1A、B参照）硬化後、PDMSとガラスの間のインターフェイスを生成します。 </li><li> （硬化）PDMSを硬化させる16時間オーブンで70℃でプレートをインキュベートします。 PLATを配置細胞培養フードとUVの電子は、10分間滅菌します。 注：これは、使用の数日以内にプレートを作るのがベストです。しかし、プレートは任意のバッファなしパラフィルムで包み、品質の顕著な低下させることなく2週間まで4℃で保存することができます。 </li></ol> 2.細胞播種注：siRNA媒介ノックダウンの効果を研究する場合は、製造元の指示や選択の細胞型に最適化されたプロトコルを使用してノックダウンを行います。 <ol><li>各コートは、37°C​​で1時間、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS中10μg/ mlのフィブロネクチン1mlのチャンバdurotaxis。あるいは、フィブロネクチン、4℃で16時間、PBS中10μg/ mlのフィブロネクチンでPDMSをインキュベートすることによって、分析前に一日適用することができます。全面をPBS溶液中のフィブロネクチンに沈めていることを確認します。 </li><li>熱変性1％BSAを準備します。 0.5グラムのBSAを秤量し、PBS 50ml中に溶解します。フィルターは、12分間80℃で0.22μmのフィルターと熱を通して溶液を滅菌します。 注：前に4℃での細胞播種と店に一日、この溶液を調製します。 </li><li>フィブロネクチン溶液を吸引し、PBSで3回洗浄します。各ウェルにPBS中の熱変性BSAを1ml加え、室温で30分間インキュベートします。 </li><li> durotaxis室が熱変性BSAでブロックしている一方でトリプシン処理し、選択の細胞をカウントします。 </li><li>プレートの選択の特定の細胞型に必要なメディアを使用してdurotaxis室の各ウェルに2ミリリットルの容量で、1×10 5細胞 、。細胞が付着し、5％CO 2で37℃の加湿インキュベーター中で4時間、基板上に塗布することを許可します。 注：U2OS細胞を日常的に2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、および10 IU / mlのペニシリン、を10μg/ mlのストレプトマイシンを補充した、10％FBSを含むDMEM中で維持されています。 注：この例で使用される細胞数は、のために最適化されU2OS細胞。他の細胞型のための最適化が必要とされ得ます。この密度は、細胞を他の細胞との相互作用の重要なことなく移行するための十分なスペースを提供します。 </li></ol> 3.ライブセルイメージング<ol><li> 10倍の対物レンズとの位相差を使用して、倒立顕微鏡でライブセルイメージングを実行します。顕微鏡は、長期的画像化の間に37℃の温度を制御し、5％CO 2を可能に囲まれた環境、加湿チャンバーを装着しなければなりません。 </li><li>細胞は約3.5時間に広がった後、顕微鏡室にプレートを組み立てます。サンプル（s）は30分間チャンバー内で平衡化することを許可します。 </li><li>利用可能な場合、顕微鏡に訪問し、自動化、マルチポイントを設定します。 90との間のインターフェイスに焦点を当て：1 PDMSとカバーガラスとdurotaxis室あたり40点の平均とすべてのインターフェイスの周りに画像にポイントを選択します。画像セルまでの16時間ごとに10分。 注：再興味のある祇園は、カバーガラスのエッジとPDMSとカバーガラスとの間の実際のインタフェースに対応する内側のラインに対応する外側のラインで、二行として表示されます。 図1Bを参照してください 。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li> 表1のように 、スプレッドシートを生成します。 </li><li>生成された各ムービーからガラス表面およびその逆に、PDMSから交差イベントの数をカウントします。 Excelスプレッドシート内の適切な列に交差するイベントの数を記録します。 注：交差イベントがいずれかの方向にPDMSとガラスの間の境界を通過する細胞の核として定義されます。 </li><li>複数の交差を定量化するために、細胞を界面を越えた回数をカウントします。その数は、細胞は、映画の最後に位置された基板に対応するExcelの列に記録する必要があります。トンのインターフェイスを横断するセル毎に解析を繰り返し彼の映画。撮像中に視野の外に移動する細胞を除外します。 注：これは、細胞は、フィブロネクチンでコーティングされたPDMSとカバーガラスの表面に均等に付着することができることを、実験の開始時に細胞計数によって、検証することも重要です。 </li><li> （ すなわち、durotaxisを受けた）ガラス表面にPDMSから遊走した細胞の割合を計算します。ソフトからハードまでのイベントと交差イベントの合計数で、ハードと除算に終了した複数の交差事象を通過する数を追加します。 </li><li>交差の総数で複数の交差の数を分割して複​​数の交差の割合を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

著者には開示すべき矛盾はありません。

ここで我々は、細胞の移行にdurotaxisを研究するための単純なアッセイを説明します。このアッセイの主な強みは、PDMSを用いdurotaxisチャンバを調製する容易さです。基板の剛性を容易にアッセイにおける様々な剛性の研究を可能にするために、架橋剤にPDMSベース溶液の比率を変えることによって操作することができます。しかし、システムの潜在的な制限は、より洗練されたシステム4によって提供される剛性勾配を経験とは対照的に、細胞が唯一の基質剛性の単一の変化にさらされていることです。重要なのは、ポリアクリルアミド基質とは異なり、ECM成分は、化学的に架橋されたPDMSにする必要はありません。フィブロネクチン11に特異的な抗体で染色することによって決定されるように実際に、フィブロネクチンコーティングは、PDMSおよびガラス表面の両方にほぼ等しいです。以前の研究では、細胞は、PDMSまたはポリアクリルアミド基質のいずれかで同じように動作することを使用のOを示しているので、F PDMS基板10,12細胞でメカノを研究するとはるかに簡単にモデルを提供します。 <p class...

細胞外マトリックス（ECM）は、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む構造と架橋タンパク質の複雑な配列で構成されています。それは十分にECMは細胞組織のための重要な構造的支持を提供することが確立されているが、細胞が活発に細胞生存、分化および細胞遊走を含む多様な細胞プロセスを調節するために、それらのECM環境の物理的変化に応答することを示す証拠が増えてきています。硬い（〜25キロパスカル）の基板は骨形成分化1を促進しながら、例えば、ECMの剛性の違いは、ソフト基板（〜1キロパスカル）神経性系統を促進して、異なる系統に向けて、間葉系幹細胞を駆動することができます。同様に、間質マトリックスの剛性の増加は、周囲の組織2,3に乳腺上皮細胞の腫瘍形成および浸潤を促進することが示されています。 このmechanosignの特に興味深い点細胞がよりリジッド基板4,5の方に優先的に移行するdurotaxis、として知られているプロセスでの活動結果をaling。細胞は常に、ECMに結合するインテグリン受容体を介して、それらの細胞外環境の物理的特性を感知します。これは、順番に、接着斑または焦点コンタクト6,7として公知の接着剤構造の形成を駆動するために、それらの細胞質ドメインに、多数の構造的およびシグナル伝達タンパク質の蓄積を促進します。 インテグリンは全く固有の酵素活性を有していないので、信号がその環境変化〜8セルの応答を調整するために、これらのアクセサリータンパク質を介して、ECMから中継されます。従って、mechanosignalingとdurotaxisの調節に関与する重要なタンパク質の同定および特徴付けは、研究の重要な領域です。 様々なモデル系は 、in vitroでdurotaxisを研究するために開発されてきたが、ほとんどが持っていますコラーゲンコートポリアクリルアミド基材4を用いました。しかし、ポリアクリルアミド基質の製造は技術的に困難であることができ、これらのアッセイで使用されるコラーゲンは、 基板 9に化学的に架橋する必要があります。ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板、ポリアクリルアミド基板10に匹敵する機械的特性を示すことが示されています。しかし、PDMS基板は、単に架橋剤を塩基の比を混合することによって調製され、これらの基板は、このようにPDMS細胞挙動に対する剛性​​の影響を研究するための容易なツールを作製する、化学的架橋を必要とせずに、ECMタンパク質でコーティングすることができます。ここで、我々はソフトPDMS基板は、硬質ガラスカバースリップで一体化された単純なdurotaxis室を準備する方法について説明します。 アッセイは、以下に概説するように、durotaxisを研究するために迅速かつ簡単な方法を提供します。この研究のために、我々は、siRNA媒介と組み合わせ、人間のU2OS骨肉腫細胞を使用しましたdurotaxis 11でこの焦点接着タンパク質の役割を研究するcdGAPのノックダウン。重要なことに、このプロトコルは、容易に個々の要件に適合させることができます。他の細胞型は、U2OS細胞に置換されてもよく、任意のタンパク質をノックダウンまたはdurotaxis中の細胞の挙動に影響を決定するために過剰発現することができます。さらに、このプロトコルは、FRAPまたはFRETの手法を使用してダイナミックス及び挙動を分析するためにタグ付けされた蛍光タンパク質を組み込むように適合されてもよいです。

<table><tbody><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>ダウ コーニング</td><td>3097358-1004</td><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td></tr><tr><td>#1 カバーガラス 12 mm</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル プレート</td><td>セルトリート</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>セルグロ</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>セルグロ</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムピルビン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP356-100</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>セルグロ</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>インビトロジェン</td><td>21600-044</td><td></td></tr>ファ<tr><td>ルコンチューブセル</td><td>トリー</td><td>ト229456</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンΣ</td><td></td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

セルmechanosensingとdurotaxisを評価するための簡略化したシステム<em&gt;インビトロ</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

細胞外マトリックスの組成及び機械的特性は、組織型間で高度に可変です。この結合組織の間質の多様性に大きく影響を与える細胞の挙動細胞増殖、分化、接着シグナリングおよび方向性のある移動を含む正常および病理学的過程を調節するために。この点において、特定の細胞型の生来の能力がdurotaxisと呼ばれる堅い、以下に準拠マトリクス基板に向かって移動します。この現象は、胚発生、創傷修復及び癌細胞浸潤の間に重要な役割を果たしています。ここでは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板を用いて、in vitroで 、durotaxisを研究するための簡単なアッセイを説明します。室durotaxis記載の製造は比較的柔らかいPDMSゲルと硬質カバーガラスとの間に剛性のインターフェースを作成します。提供された例では、CDC42 / Rac1のGTPアーゼ活性化proteの役割を実証するために、これらのdurotaxis室を使用していましたcdGAP、で、mechanosensingと人間のU2OS骨肉腫細胞におけるdurotaxis規制インチこのアッセイは、他の細胞型および/またはmechanosignalingとdurotaxisにおけるそれぞれの役割を探求するための利益の他のタンパク質のノックダウンに容易に適合可能です。

durotaxisチャンバの概略図は 、図1Aに示されています。ソフトPDMS基板を、（90：ソリューションを架橋するために、PDMSベースの1混合物）を6ウェル皿に広げ、カバーガラスがそれによってインターフェースを作成し、部分的にカバーガラスの上面を覆うPDMSの上に配置されます異なるコンプライアンスの2枚の基板の間。ソフトPDMS基板の剛性は、ガラスの剛性は約1 GPaで1~2であるが、脳組織の典型的な適合性に匹敵する約1キロパスカルです。 PDMSとガラスとの界面の位相コントラスト画像は、図1Bの白い矢印で示されています。アスタリスクは難しく基板に向かって移行する二つの制御のRNAi細胞を意味します。見ることができるギザギザのエッジ（黒矢印）はカバーガラスのエッジに対応。 データを定量化するために、Microsoft Excelのスプレッドシートは 、表1のように生成する必要があります&lt;</str...

多くの哺乳類細胞は、デュロタキシスを通じてより硬いマトリックスまたは基質に向かって優先的に移動します。このプロトコルの目標は、ガラスカバースリップとインターフェースし、定義された剛性のポリジメチルシロキサン(PDMS)基質を組み込むことにより、細胞デュロタキシス挙動を研究し、操作するために使用できるシンプルなin vitroシステムを提供することです。

セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステム<em&gt;インビトロ</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

この手順の全体的な目的は、多くの哺乳類細胞がより硬い基質へと優先的に遊走する細胞デュロタキシス（cell durotaxis）を解析するための簡便なシステムを提供することです。まず、剛性を定義したポリメチルシロキサン（PDMS）基質を調製します。次に、調製したPDMSを6ウェルプレートの各ウェルに流し込み、気泡を除去します。次に、各ウェルのPDMSの上に滅菌済みのカバーガラスを配置してオーバーレイを作成し、Durexチャンバーを完成させます。最終ステップとして、他の細胞との過度な相互作用を避けつつ、細胞が遊走するための十分なスペースが確保できる密度で、Duro taxesチャンバーに細胞を播種します。最終的に、ライブセルイメージングを用いて、遊走細胞における軸を解析します。ポリアクリルアミドなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、勾配ゲルなどの代替案ではなく、柔軟なPDMSと剛性の高いガラスの間に単一のステップが存在することです。また、フィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分でPDMSをコーティングする場合、ポリアクリルアミドゲルのように化学的架橋を行う必要はありません。6ウェル組織培養プレート1枚を準備するために、まず50 milliliterコニカルチューブを用いてバランスを調整してください。50 mLチューブに、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース溶液を約10 g量り取ります。基材比を90:1にする場合は、量り取ったPDMSベース溶液の重量を90で除します。必要な架橋剤溶液の正確な量を決定し、算出された量のPDMS架橋剤溶液をチューブに加えます。PDMSベースと架橋剤の混合物を、室温で5分間激しく混合します。この段階で小型のスパチュラを使用すると、混合物の中に少量の気泡が含まれます。ベンチトップ遠心分離機を用い、PDMS基材を50×gで5分間遠心分離します。まだ気泡が残っている場合は、室温に置いて気泡を除去してください。5分間の遠心分離後、組織培養処理済み6ウェルプレートの各ウェルに、PDMS基材（90:1）を1 mLずつピペットで分注します。PDMS内に気泡が残っている場合は、この段階で21ゲージの針を用いて気泡を潰して除去します。PDMSをウェル内で30分間静置し、広げます。次に、12 mmのガラスカバーガラス（No.1）を蒸留湯で5分間煮沸し、この操作を計3回繰り返します。乾燥させたカバーガラスを、カバーの一端にそっと触れさせながら、組織培養プレートの各ウェルに1枚ずつ配置します。カバースリップをPDMS溶液に浸し、その後カバースリップをPDMSの上に落とします。カバースリップが沈むにつれて、PDMSがカバースリップの端にまではみ出しますが、完全に覆い尽くすことはありません。これにより、硬化後にPDMSとガラスの間に界面が形成されます。PDMSを硬化させるため、プレートをオーブンに入れ70 °Cで16時間インキュベートします。最後に、プレートをセルカルチャーフード内に置き、10分間UV滅菌します。各duroxチャンバーに、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で調製した1 mLのフィブロネクチンを加え、30 °Cで1時間コーティングします。表面全体がPBS溶解フィブロネクチン溶液に浸かっていることを確認します。0.5gのBSAを50mLのPBSに溶解し、0.22µmフィルターでろ過して、熱変性1%牛血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。溶液を0.22µmフィルターで滅菌した後、80°Cで12分間加熱します。次に、フィブロネクチン溶液を吸引し、チャンバーをPBSで3回洗浄します。各ウェルにPBSで熱変性させたBSAを1 mL加え、室温で30分間インキュベートし、Durexチャンバーを熱変性BSAでブロッキングしている間に、トリプシン処理を行い、目的の細胞をカウントします。細胞を播種する直前に、チャンバーからBSA溶液を吸引します。doaxチャンバーの各ウェルに、10,000個の細胞を2 mLの容量で播種します。選択した特定の細胞型に必要な培地を用い、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で4時間、細胞を基質に接着および伸展させます。その後、倒立顕微鏡を用いて、10倍対物レンズの位相差観察による生細胞イメージングを行います。顕微鏡には密閉された環境加湿チャンバーが装着されており、長期イメージング中に温度を37 °C、CO2濃度を5%に制御できる必要があります。細胞が約3.5時間かけて展展した後、プレートを顕微鏡チャンバーにセットします。サンプルをチャンバー内で30分間平衡化させます。顕微鏡に自動マルチポイントビジティング機能がある場合は、それを設定してください。PDMSとガラスカバースリップの界面に注目し、界面の周囲全体を撮像するためのポイントを選択します。Durexチャンバーの画像につき平均40ポイントで、最大16時間まで10分ごとに細胞を撮像すると、関心領域は2本の線として現れます。外側の線はカバースリップの端に、内側の線はPDMSとカバースリップの実際の界面に対応します。データを分析するには、テキストプロトコルに示されているようなスプレッドシートを作成してください。作成された各動画から、PDMSからガラス表面へ、およびその逆方向への交差イベントの回数をカウントします。交差イベントとは、細胞核がPDMSとガラスの境界をどちらの方向へも通過することを定義します。複数回の交差を定量化するため、交差イベントの回数をExcelスプレッドシートの適切な列に記録してください。細胞がインターフェースを横切った回数をカウントします。その回数を、動画の終了時に細胞が位置していた基質に対応するExcelの列に記録してください。動画内でインターフェースを横切るすべての細胞について、この解析を繰り返します。イメージング中に視野外に移動した細胞は除外します。PDMSからガラス表面に移動し、その結果デュロタキシス（durotaxis）を起こした細胞の割合を算出します。算出方法は以下の通りです。ソフトからハードへの交差イベント数と、ハードで終了した複数回の交差イベント数を加算し、それを全交差イベント数で除します。また、複数回交差の総数を全交差数で除して、複数回交差の割合を算出します。これにより、細胞が周囲環境の機械的刺激にどのように反応するかという分子メカニズムの理解を深めます。ここで示すように、shRNAを用いて特定のタンパク質をノックダウンすることが可能です。コントロールのirna処理細胞の約70%に軸索伸展（axxis）が見られました。対照的に、RNAiを用いてCD gapをノックダウンすると、細胞は硬い基質か柔らかい基質のどちらへ遊走するかという選択性を失いました。さらに、CD gapノックダウン細胞は境界を何度も横切りました。コントロールirna処理細胞は一般的に境界を一度しか越えませんが、コントロールirna細胞の代表的なトラッキング結果は、細胞が一般的に境界を一度越え、CD gapと比較してより剛性の高い表面に優先的に留まることを示しています。一方で、いずれの剛性に対しても優先性を示さなかったirna処理細胞は、境界を複数回越えていました。このビデオを視聴することで、PDMS基板の作製方法、durisチャンバーの組み立て方法、およびDUR taxesの定量方法について十分に理解することができます。

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

機械感覚に影響を与える新たな突然変異を特定するために、MARCM法によって生成された突然変異クローンのハエの剛毛の触覚刺激に対する行動反応を測定するアッセイを設計しました。これらの技術の組み合わせにより、他の方法では致命的となる機械感受性変異の同定が可能になります。...

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。...

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々...

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

メカノバイオロジー研究のための新しいツールはどのように機械的ストレスを理解に必要な生化学的経路を活性化し、生体反応を引き出します。ここでは、細胞応答の高分解能イメージングをできるようにマイクロ...

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

光シート顕微鏡とショウジョウバエの胚でビーズなし細胞力学をプローブへの実装に結合光ピンセットのセットアップを紹介します。...

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

細胞信号を分析する統合ツールキット(iTACS)プラットフォームは、接着細胞内の多種多様な化学および機械的信号を同時に測定するプロセスを自動化します。iTACSは、コミュニティ主導の開発を容易にし、研究者が学歴に関係なくすべてのプラットフォーム機能を使用できるように設計されています。...

細胞信号を解析する統合ツールキット:力、運動、形態、蛍光

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。...

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。...

ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。...

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

学ぶセルMechanosensingとDurotaxis評価の簡略化システム。PDMS基板を用いて哺乳類細胞の硬い基板への優先的移動を観察し、細胞生物学と組織工学の研究に活用できます。

セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステム

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