セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステムインビトロ
2015年8月27日
多くの哺乳類細胞は、デュロタキシスを通じてより硬いマトリックスまたは基質に向かって優先的に移動します。このプロトコルの目標は、ガラスカバースリップとインターフェースし、定義された剛性のポリジメチルシロキサン(PDMS)基質を組み込むことにより、細胞デュロタキシス挙動を研究し、操作するために使用できるシンプルなin vitroシステムを提供することです。
この手順の全体的な目標は、多くの哺乳動物細胞がより硬い基質に向かって優先的に移動する細胞デュレックスの分析のための簡素化されたシステムを提供することです。これは、最初に定義された剛性のポリメチルスボキサンまたはPDMS基質を調製することによって達成されます。次に、調製したPDMSを6ウェルプレートの各ウェルに注ぎ込み、気泡を取り除きます。
その後、Durexチャンバーは、各ウェルのPDMSの上に滅菌されたカバースリップを配置してオーバーレイを作成することで完成します。最後のステップは、他の細胞との大きな相互作用なしに細胞が移動するのに十分な余地を与える密度で、Duroの課税チャンバーに細胞を播種することです。最終的には、生細胞顕微鏡法を使用して、移動する細胞のaxxisを研究します。
ポリアクリルアミドのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、グラジエントゲルの代替品の代わりに、ソフトPDMSと硬質ガラスの間にシングルステップがあることです。また、PDMSを細胞外マトリックスでコーティング フィブロネクチンのような成分は、ポリアクリルアミドゲルに必要な化学的架橋を必要としません。最初に1つの6ウェル組織培養プレートを準備するには、50ミリリットルの円錐管で天びんを引き裂きます。
50ミリリットルのチューブに約10グラムのポリジメチルスボキサンまたはPDMSベース溶液を量ります。90対1の基質の場合、PDMSベース溶液の測定重量を90で割ります。必要な架橋剤溶液の正しい量を決定するには、計算された量のPDMS架橋剤溶液を、粘液混合したチューブA-P-D-M-Sベース架橋剤混合物に室温で5分間加えます。
この段階で小さなヘラを使用すると、混合物には少数の気泡が含まれます。卓上型遠心分離機でPDMS基質を50回、5分間遠心分離します。G.まだ気泡がある場合は、室温で気泡を取り除きます。
5分間の遠心分離後、再度1ミリリットルの90〜1PDMS基質を組織培養処理の各ウェルにピペットで移します。6ウェルプレート。PDMSに存在する残りの気泡は、この段階で21ゲージの針で気泡をはじくことで除去できます。
PDMSをウェル内で30分間広げます。次に12ミリガラスを沸騰させ、蒸留水で5分間、合計3回スリップを覆います。乾燥させたカバー片片を組織培養プレートの各ウェルに、カバーの片側にそっと触れて入れます。
PDMS溶液に滑り込ませてから、カバースリップをPDMSに落とします。カバー スリップが落ち着くと、PDMS はカバー スリップの端に侵入し始めますが、完全にはカバーされません。これにより、硬化後にPDMSとガラスとの間に界面が生成されます。
プレートを70°Cのオーブンで16時間インキュベートし、PDMSを硬化させます。最後に、プレートを細胞培養フードに入れ、10分間UV滅菌します。各デュロックスチャンバーに1ミリリットルのフィブロネクチンをリン酸緩衝生理食塩水でカルシウムとマグネシウムを含まない状態で摂氏30度で1時間コーティングします。
表面全体がPBS溶液中のフィブロネクチンに浸されていることを確認してください。0.5グラムのBSAを秤量し、PBSフィルターの50ミリリットルに溶解することにより、熱性質の1%ウシ血清アルブミンまたはBSAを調製します。ポイント22ミクロンフィルターで溶液を滅菌し、摂氏80度で12分間加熱します。
次に、フィブロネクチン溶液を吸引し、チャンバーをPBSで3回洗浄します。PBS中の1ミリリットルの熱変性BSAを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートし、トリプシンアイズで、デュレックスチャンバーが熱でブロックしている間に選択した細胞をカウントします。変性BSAは、細胞をめっきする直前にチャンバーからBSA溶液を吸引します。
2ミリリットルの容量で10, 000個の細胞をdoaxチャンバーの各ウェルにプレートします。選択した特定の細胞タイプに必要な培地を使用して、細胞を摂氏37度の加湿インキュベーターで5%CO2のシート上に4時間接着および拡散させ、倒立顕微鏡で10倍対物レンズの位相差を使用してライブセルイメージングを行います。顕微鏡には、長期間のイメージング中に摂氏37度と5%CO2の温度を制御できるように、密閉された環境加湿チャンバーを取り付ける必要があります。
イメージングは、細胞が約3.5時間広がった後、顕微鏡チャンバー内でプレートを組み立てます。サンプルをチャンバー内で30分間平衡化させます。可能な場合は、顕微鏡で自動マルチポイント訪問を設定します。
PDMSとガラスカバースリップの間のインターフェースに注目し、インターフェース全体の画像化するポイントを選択します。Durexチャンバー画像あたり平均40ポイントで、細胞は10分ごとに最大16時間、関心領域は、外側の線がカバースリップのエッジに対応し、内側の線がPDMSとカバースリップとの間の実際のインターフェースに対応する2本の線として表示されます。データを分析するには、テキスト プロトコルに示されているようなスプレッドシートを生成します。
生成された各ムービーから、PDMSからガラス表面への交差イベントの数、およびその逆の数をカウントします。交差イベントは、細胞核がPDMSとガラスの間の境界をいずれかの方向に通過することとして定義されます。Excelスプレッドシートの適切な列に交差イベントの数を記録して、複数の交差を定量化します。
セルがインターフェイスを通過した回数をカウントします。その番号は、ムービーの最後にセルが配置されていた基質に対応するExcel列に記録する必要があります。ムービー内のインターフェイスを横切るすべてのセルについて、分析を繰り返します。
イメージング中に視野外に移動する細胞を除外します。PDMS からガラス表面に移動し、Duro Texas を経た細胞の割合を計算します。そうする。
ソフトからハードへの交差イベントの数と、ハードで終了した複数の交差イベントを追加し、交差イベントの総数で割ります。複数の交差の合計を交差の総数で割ることにより、複数の交差の割合を計算し、細胞が環境内の機械的な手がかりに対応する分子メカニズムを理解し始めます。特定のタンパク質は、ここに示すようにIRNAを使用してノックダウンできます。
対照のirna処理細胞の約70%がaxxisを示しました。対照的に、RNAiを使用してCDギャップをノックダウンすると、細胞は硬い基質に移動するか柔らかい基質に移動するかについて好みがありませんでした。さらに、CDギャップノックダウン細胞は境界倍数を越えた。
一方、制御されたirna処理された細胞は、一般に、制御の代表的なトラックが境界を越えるだけです。Irna細胞は、細胞が一般に境界を越えて一度移動し、CDギャップと比較してより硬い表面に優先的に留まることを示しています。どちらの硬直性にも選好を示さず、境界を複数回越えなかった細胞をirnaで処理しました。
このビデオを見れば、PDMS基板の調製方法、デュリスチャンバーの組み立て方法、DUR税の定量化方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、哺乳類細胞が硬い基質に向かって優先的に移動する細胞デュロタキシーを研究するための簡略化されたin vitroシステムを概説しています。定義された剛性のポリジメチルシロキサン（PDMS）基質を利用することで、研究者は細胞の移動挙動を操作し観察することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- 材料科学
背景
- デュロタキシーは、細胞がより硬い基質に向かって移動する現象です。
- 細胞の移動を理解することは、組織工学とがん転移の洞察に不可欠です。
- PDMSは、様々な硬度の基質を作成するために使用される多用途な材料です。
- この研究は、基質の剛性に応じて細胞の挙動を分析するための再現可能な方法を提供することを目指しています。
研究目的
- 細胞デュロタキシーを研究するための簡単な方法を開発する。
- 基質の剛性が細胞の移動にどのように影響するかを調査する。
- 移動する細胞のライブイメージングを容易にする。
使用した方法
- 定義された剛性のPDMS基質の準備。
- PDMSを6ウェルプレートに注ぎ、気泡を取り除く。
- 滅菌したカバースリップをPDMSの上に配置する。
- 観察のためにDurotaxチャンバーに細胞を播種する。
主な結果
- 細胞はより硬いPDMS基質に向かって優先的に移動しました。
- ライブ細胞顕微鏡法は移動のダイナミクスについての洞察を提供しました。
- このシステムは、基質の剛性を制御して操作することを可能にしました。
- 結果は、様々な生物学的文脈での細胞の挙動を理解することに貢献します。
結論
- このプロトコルは、細胞デュロタキシーを研究するための信頼性の高い方法を提供します。
- 得られた洞察は、細胞の移動と組織工学の将来の研究に情報を提供します。
- PDMS基板の使用は、細胞の挙動を操作するのに効果的です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This simplified durotaxis assay enables biopharma R&D teams to evaluate cell mechanosensing and directional migration in response to substrate stiffness, a key factor in tumor invasion and stromal interactions. By providing a reproducible in vitro model with a defined rigidity interface between PDMS and glass, the system supports target validation and mechanistic de-risking of proteins involved in mechanotransduction pathways. The assay’s adaptability to various cell types and knockdown strategies enhances its utility in early discovery for identifying modulators of durotaxis as potential therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding mechanosensitive proteins like cdGAP in regulating durotaxis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking protein knockdown to loss of directional migration preference.
- Predictive Value: Generates quantitative crossing event data to assess target influence on cell migration behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized PDMS-glass interfaces suitable for high-resolution live cell imaging and migration tracking.
- Reproducibility: Eliminates need for chemical cross-linking or gradient gels, improving assay consistency across experiments.
- Scalability: Compatible with six-well plate format, enabling parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models durotaxis, a process implicated in cancer cell invasion and stromal-driven malignancy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanosensing findings to preclinical models of metastasis and tissue remodeling.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights to prioritize targets based on their role in rigidity-sensing pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking extracellular matrix mechanics to cell migration phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanosensors and GTPase regulators in durotaxis using live cell imaging readouts.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating compound or genetic effects on migration bias toward rigid substrates.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs such as crossing event counts and directional migration percentages for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanosensing data to pathophysiological contexts like tumor invasion where durotaxis plays a role.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mechanosensitive targets across oncology, fibrosis, and wound healing programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target roles within mechanotransduction networks by reducing ambiguity in migration phenotypes.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a simple, gradient-free substrate system.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic links between targets and durotaxis-driven pathological processes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on functional validation in a disease-relevant mechanosensing assay.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, live cell imaging, and RNAi or genetic perturbation techniques.
- Depends on access to inverted microscopes with environmental control for long-term phase contrast imaging.
- Necessitates standardization of PDMS preparation and coating protocols to ensure consistent substrate rigidity.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to primary cells or 3D migration models.
- Limited to 2D surface durotaxis; does not capture complex 3D matrix remodeling or proteolytic invasion mechanisms.
