Name: NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶ、相同タンパク質に対する抗体の特異性向上法。分岐したタンパク質ドメインを用いた免疫化とクロマトグラフィーによる交差反応性抗体の除去により、NURR-1、Nor1、Nur77などの標的タンパク質への高特異的抗体を開発する手法です。

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この作業はNIHの助成金（NS070577およびNS084869）によって支援されました。

注：以下の引用された全ての溶液の組成は、材料/機器の表に記載されています。 1.プロテインAカラム抗体精製<ol><li>手順を開始する前に15分間室温にプロテインAスピンカラムと、必要なすべてのバッファーを平衡化します。 </li><li>結合緩衝液プロテインAのIgGと1：免疫血清1を希釈します。 （血清5mlをお勧めします）。 </li><li>静かにキャップ内に提出することができる任意の樹脂を除去するために、ベンチトップ上のタンパク質スピンカラムをタップします。トップキャップを外し、ゆっくりと底部の閉鎖をスナップオフ。 15ミリリットルのコレクションチューブにカラムを置き、ストレージソリューションを排出することができます。 </li><li>結合緩衝液プロテインAのIgGの5ミリリットルを加え、溶液を排出させます。 </li><li>カラムに希釈した免疫血清を適用し、フロースルーを収集します。最良の結果を得るために、カラムの抗体結合capacitの80％未満の抗体の濃度が含まれているサンプル容量を追加Y。 </li><li> 280 nmでの吸光度が0.1以下になるまで、プロテインAのIgG 15mlの結合緩衝液またはでカラムを洗浄します。 </li><li> 5標識されたコレクションチューブに中和緩衝液100μlを追加します。 </li><li>プロテインAカラムへのIgG溶出緩衝液5mlを加え、中和緩衝液100μlを含むチューブのそれぞれに1mlの画分を収集します。 </li><li> 0.5より大きい吸光度280 nmおよびプールの画分で各画分の吸光度を測定します。透析の準備ができるまで氷上でプールした画分を保管してください。 </li><li> IgGを溶出緩衝液8mlのを追加することで、列を再生成し、溶液がカラムを通って流れることを可能にします。 </li><li>溶離液のpHは7.4に戻るまで、プロテインAのIgG結合液でカラムを洗浄します。 </li><li>貯蔵溶液5ml（PBS中0.02％アジ化ナトリウム）を添加することにより、カラムを保存。約3mlの列、キャップ底部に残り、トップキャップを固定した場合。 4℃で列を保管してください。 </li><li>長さOを決定製造業者の指示に従って必要なF透析チューブ。 16ミリメートルに平らな直径のチューブを使用すると、透析される溶液1ml当たり、チューブの長さの5.47センチメートルを使用しています。チューブをカットし、15〜30分間のPBS（pH7.4）ですすいでください。 </li><li>倍と透析チューブの一端をクリップ、PBSのpHは7.4で平衡化した透析チューブに含有画分をプールしたIgGを転送し、もう一方の端を閉じます。 </li><li> 2時間pH7.4のPBSの200ボリュームに対して室温で透析します。 </li><li>透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、室温でさらに2時間透析。 </li><li>透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、4℃で一晩透析します。 </li><li>さらなる精製工程を続行する準備ができるまで4℃で透析した抗体溶液を保管してください。 </li><li> 280 nmでの吸光度を用いて抗体濃度と21万M -1 cm -1で12の280nmにおける抗体のモル吸光係数を評価します。 </li></ol>アミノリンクカップリング樹脂にLBDタンパク質の2カップリング<ol><li> 2列、Nur77ためNor1のための1つおよび他を準備します。両方のタンパク質のための同じプロトコルに従ってください。 </li><li>氷上で樹脂に結合するタンパク質を解凍します。 280 nmの12で、そのモル吸光係数とその吸光度を用いてタンパク質濃度を決定します。 <ol><li>あるいは、そのようなビシンコニン酸アッセイ13のようなタンパク質の決意アッセイを使用しています。タンパク質は、アミン含有緩衝透析またはカップリングバッファーに対してバッファー交換中に溶解されている場合。タンパク質は、適当な緩衝液（無遊離アミン）である場合のカップリング緩衝液で4倍に希釈します。 </li></ol></li><li>タンパク質2mgのための樹脂の2ミリリットルを使用してください。以降のすべての手順は、10ミリリットルの列に2ミリリットルの樹脂のためのものです。タンパク質の最大10 mgの（1：1スラリー1を2ml）樹脂を1mlあたり連結することができます。 </li><li>底部にフリットを押し、それを介してPBS pHが7.4を実行して、10ミリリットルのカラムを準備します。キャップT彼は塔の底部とのカップリング緩衝液2ミリリットルを追加します。 </li><li> 、カラムへのスラリーの所望の体積（樹脂の2ミリリットルを得るために4ミリリットル）を追加底部キャップを除去し、カラムの流出をしてみましょう。カップリング緩衝液の6ミリリットル（3樹脂床容積）の合計でカラムを洗浄し、カラムを排水することができます。カップリング緩衝液を排出した後、ボトムキャップを交換してください。 </li><li> （280nmでの吸光度またはビシンコニンアッセイのいずれかを使用してステップ2.11で溶出液のタンパク質濃度を比較することにより、結合効率を評価するために、タンパク質溶液のアリコートを保持）カラムへの結合緩衝液に懸濁し、タンパク質2-4 mlを加え。キャップと均一な溶液を持つように転倒混和します。 </li><li>空の1.8ミリリットルマイクロチューブを秤量し、ドラフトに移動します。慎重に予め秤量したチューブ中のNaCNBH 3（約0.05g）を転送します。チューブを閉じ、のNaCNBH 3を含むチューブの重量を量ります。フードの外管を開けないでください。 </li><li>の重量を基準にしてチューブに移しのNaCNBH 3は 、1 M NaOHを添加することによって5 M溶液を作成します。のNaCNBH 3の分子量は、62.84グラム、従って0.05グラムは、（0.05 / 62.84 = 7.96×10 -4モル）を7.96×10 -4モルに等しいです。 5 M溶液を作製するには、（7.96×10 -4 / 5）1 M NaOHを159μlを添加します。 </li><li>考慮に樹脂容量を取る反応の総容量を測定します。反応の1ml当たり5 MのNaCNBH 3の10μLを加えます。 <ol><li>たとえば、次の4ミリリットルの反応ボリュームの5 MのNaCNBH 3の40μlを添加します。樹脂1mlのコメントを追加しましたタンパク質の3ミリリットルのために、総容量を4 mlです。 </li></ol></li><li>カラムに蓋をし、転倒混和します。チューブ回転で列を固定し、反応物を4℃で一晩続けましょう。 </li><li>午前中は、化学フードに列を持参し、いくつかのガスが形成されている可能性がありますように慎重にキャップを取り外します。きれいなチューブにカラムを排水し、タンパク質コンを測定するために、溶出液を保存セント280nmの方法12またはビシンコニン酸アッセイでの吸光度を用いて、ステップ2.6で出発タンパク質濃度と比較します。 </li><li>カップリング緩衝液4mlで樹脂を洗浄し、カラムの流出をしてみましょう。 </li></ol> 3.残りのサイトをブロック<ol><li>クエンチング緩衝液4mlで樹脂を洗浄。ドレインと底部キャップを交換してください。急冷2mlの緩衝液を添加し、樹脂を中断。 </li><li>樹脂容量と消光バッファ量を測定することにより、総反応容量は、その後、反応容量1mlあたり5 MのNaCNBH 3の10μlを添加する評価します。 </li><li> 30分転倒、室温で穏やかに混合します。 30分後、ドラフト内で列をもたらします。慎重にトップを削除してから、底部キャップを除去し、廃棄物の管に、カラムの流出をしてみましょう。 </li><li>洗浄溶液の5樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。溶出液のabsoを測定することにより、残留タンパク質の存在のための洗浄を監視280nmでrbance。非結合タンパク質を、高塩濃度によって洗い流されます。 </li><li> 0.02％アジ化ナトリウムを含有する脱気したPBSのpHが7.4の6ミリリットルで樹脂を洗浄。必要になるまで4℃で列を保管してください。 </li></ol> Nurr1を特異的抗体の4精製<ol><li>すすぎNur77 LBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をして、新しい15ミリリットルのコレクションチューブに排出さNur77 LBD結合列を配置します。 </li><li> 、タンパク質5mlの精製抗のNurr1抗体を追加し、1時間4℃で回転体の列と場所をキャップ。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。 Nor1のLBD結合列に追加する直前まで、氷上に置いておきます。 </li><li>すすぎNor1のLBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をし、15 mlコレクションチューブNor1のLBD結合列を配置します。 </li><li> Nur77 LBDのクーデターからの流れを介して追加4℃で1時間回転器でのカラムと場所をキャップ、列を主導しました。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。 </li><li> 280nmでの吸光度を測定することにより抗体濃度を測定します。 </li></ol>精製抗のNurr1抗体の5 ELISAに基づく分析<ol><li> 96ウェルプレートのウェルにタンパク質を100μl（2.5μgの/ ml）を追加します。 3種類のタンパク質をテストする場合は、H4のウェルA1、H8にウェルA5へのタンパク質2を100μl、およびH12のウェルA9へのタンパク質3の100μlにタンパク質1の100μlを添加します。プレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> pH7.4のPBSのウェル当たり300μlの二回コーティングしたウェルを洗浄し、抗原全体コーティングされたウェルにELISAブロッキング緩衝液の300μlを添加し、室温で2時間インキュベートします。 </li><li>プレートは、精製された抗のNurr1抗体の所望の出発希釈を準備ブロックしているときにELISAブロッキング緩衝液中（10〜100μg/ mlの範囲）。 </li><li>ブロッキングの2時間後、全てのウェルに新鮮なELISAブロック緩衝液100μlを用いたELISAブロックバッファを交換します。 </li><li>行Aの全てのウェルに希釈した精製された抗のNurr1抗体の100μlを添加する逐次Cを行ごとにBから溶液100μlを転送することにより、続いてB列にA列からウェルに100μlの溶液を転送することにより、抗体を希釈余分な100μLを捨てる行Gのウェル中の溶液を混合した後G.行ダウン続けます。行Hのウェルは、緩衝液のみをブロックの最初の100μLを受けます。 1時間室温でインキュベートします。 </li><li> pH7.4のPBSでプレートを0.05％のTween 20のウェル当たり300μlので3回洗浄し、過剰な洗浄緩衝液を除去するためにプレートをブロット。 </li><li>ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ELISAブロック緩衝液で希釈したコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGの100μlを加える（1：8,000希釈し、典型的な範囲は、1：25,000：5,000 1）。 1時間室温でインキュベートします。 </li><li>プレート番目を洗いますREE（3）5.6倍に記載の方法。脱イオン水300μlのとそれらを充填することにより、全てのウェルを洗浄します。紙を吸収する上でプレートを反転させて余分な水分を吸い取ります。 </li><li> &#39;、5,5&#39; 3,3の100μlを添加しテトラメチルベンジジン（室温に温め）を全てのウェルに、室温で暗所で15〜30分間インキュベートします。 </li><li> SO 4を 2 NH 2の50μLを加えて反応を停止します。 </li><li> 650 nmでのバックグラウンドを差し引い450 nmの吸光度を読みます。 </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
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<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの成功は、目的のタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対して産生された抗体の特徴付けのための純粋なタンパク質の利用可能性に依存しています。それは明らかにELISAおよびウェスタンブロッティングによる有意な交差反応性があることが確立されるまで、プロテインA / Gを使用して抗体を精製する必要はありません。 本文で述べたように、このようなトリスまたはグリシンなどのアミン含有緩衝液でカラムに架橋するためにタンパク質を懸濁避けることが重要です。さらに、架橋に使用される最適なタンパク質濃度は、経験的に決定されなければなりません。少なすぎる吸着の効率を低下させるだろうが、あまりにも列に多くのタンパク質は、立体障害につながる可能性があります。したがって、それは良い考えでは2からの10mg / mlの範囲のタンパク質濃度を試験するために、得られた抗体の質を評価することです。 いくつかの要因が時に目を考慮しなければなりません技術が高度に特異的な抗体を得るために失敗しています。これらには、架橋効率、免疫反応性ドメインの喪失、および架...

転写因子のNurr1およびその同族体（Nur77およびNor1のは）核内受容体サブファミリー4A（NR4A）1に属します。それらの内因性リガンドはまだ同定されていないので、彼らはまた、オーファン受容体です。 Nurr1を最初は1992年にクローン化され、2脳内で発現することが知られているが、中脳ドーパミンニューロンの発達および維持のための重要な役割は、ノックアウトマウスの研究により明らかになった3。また、中脳ドーパミンニューロンの維持のための重要な役割は、最近、条件付きノックアウト研究4によって実証されました。による中脳ドーパミンニューロンのためのNurr1の重要な役割を示すこれらのエレガントな研究に、多くのその後の研究は、主に中脳ドーパミンニューロンおよびドーパミン関連の神経変性疾患、パーキンソン病（PD）に焦点を当ててきた5。 注目すべきは、Nurr1をは中脳ドーパミン（MDA）ニューロンにおいてだけでなく、ディだけでなく表現されていますそれは強くNurr1を、様々な脳機能に重要な役割を果たしていることを示す最近の研究によって支持されている多くの非DAの分野で機能的な役割を有し得ることを示唆している詩の脳領域2、。例については、このような学習として、メモリ誘導活性を示された、またはその他の海馬依存タスクがアップレギュレーション海馬6,7中のNurr1の発現をもたらします。また、海馬でのNurr1発現のノックダウンが強くのNurr1は、多くの脳領域で多様な役割を果たしていることを示唆し、長期記憶および/ ​​またはシナプス可塑性8-11を損なうのに十分でした。したがって、さらにNurr1をの細胞型特異的および細胞内発現を理解するためには、そのホモログNur77またはNor1のに任意の交差反応性を示さないのNurr1特異的抗体を使用することが望ましいです。本稿では、Nurr1を特異的抗体を生成し、その特異性を示す追加データを提示するために事前に吸着プロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>Nurr1、Nor 1、Nur77</td><td></td><td></td>カラム<td>保存溶液</td>からの精製リガンド結合ドメイン</tr><tr><td>AminoLinkカップリング樹脂およびキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Protein Aスピンカラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルフレートボトムプレート、ハイフランジ, 330 &mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>ミルク希釈剤/ブロッキング濃縮物&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG 溶出バッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>ウマダイコンペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'テトラメチルベンジジン</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protein A IgG Binding Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>カラム保存溶液</td><td></td><td></td><td>Phosphate Buffered0.02% アジ化ナトリウム含有生理食塩水</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 前処理透析チューブ</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ディスポーザブルカラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink カップリングバッファー</td><td></td><td></td><td>0.1M リン酸ナトリウム、0.05% NaN3、pH 7.0</td></tr><tr><td>クエンチングバッファー</td><td></td><td></td><td>1M トリス。HCI、0.05% NaN3、pH 7.4</td></tr><tr><td>洗浄液</td><td></td><td></td><td>1M NaCl、0.05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA ブロッキングバッファー</td><td></td><td></td><td>1% 正常馬血清 (NHS)、1% 正常山羊血清 (NGS) 1X KPL 牛乳希釈液</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.4 0.02% アジ化ナトリウム含有</td></tr><tr><td>マイクロピペット: 10 &mu;l;20 &mu;l;200 &mu;l;1000 &mu;L</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nurr-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、nor1のとnur77の生産

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

核内受容体サブファミリー4(NR4A)は、DNA結合ドメイン(DBD)とリガンド結合ドメイン(LBD)を共有する3つの関連タンパク質で構成されています。核内受容体関連1タンパク質(Nurr1またはNR4A2)は、ドーパミン作動系の維持に重要な役割を果たします。Nurr1遺伝子に関連するドーパミン機能障害には、パーキンソン病、統合失調症、躁うつ病などがあります。さらに、最近の証拠は、Nurr1が海馬などの他の脳領域でも発現し、学習と記憶に重要な役割を果たしていることを示しています。ファミリーの他のメンバーは、神経成長因子IB(Nur77またはNR4A1)とニューロン由来のオーファン受容体1(NOR1またはNR4A3)です。ドーパミン作動性およびその他の脳領域に関連する神経機能障害におけるNurr1の正確な機能的役割を調査するためには、Nur77およびNOR1に対する交差反応性を欠く抗体が必要でした。タンパク質はDNA結合ドメインよりもLBDの方が異なるため、精製されたLBDで免疫すると、Nur77および/またはNOR1に対する反応性が最小限に抑えられ、Nurr1に特異的な抗体が得られるはずです。抗Nurr1抗体の作製に成功しましたが、これらはファミリーの他のメンバーに対して有意な免疫反応性を示しました。固定化されたプロテインAに対するアフィニティークロマトグラフィーと、固定化されたNur77およびNOR1 LBDに対する事前吸着により、交差反応性のないNurr1特異的抗体が得られました。ここでは、最も異なる領域を持つ動物に免疫を与えた後、事前吸着により交差反応性抗体を除去することにより、高度に保存されたタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対する抗体を選択的に標的化します。このプロトコルの目標は、交差反応性抗原に対する事前吸着を通じてポリクローナル抗体の特異性を高めることです。

Nur77 LBDとNor1のLBDのカラムに通すことによって、その後のタンパク質の比較タンパク質とカラム精製の​​Nurr1に特異的な抗体精製抗Nurr1を抗体は、図1に示されている。図から分かるように、プロテインA精製の​​Nurr1抗体は強い結合を示しましたNurr1をLBDに。しかし、それはまた、Nur77 LBDへとNor1のLBDへの有意な結合を示しました。プロテインA精製のNurr1抗体はさらにNur77 LBDおよびNor1のLBDに対して精製したところ、最終的なアフィニティー精製のNurr1抗体はNur77とNor1のとの交差反応性があったことを実証し、Nur77 LBDまたはNor1のLBDに検出不可能な結合でNurr1をLBDへの特異的結合を示しました完全に除去します。 この特異性は、さらに、Nurr1を、Nor1の、またはNur77タンパク質（ 図2）をタグ付けするためにMYC融合全長を担持する発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞からの抽出物のウェスタンブロット分析によって実証さ...

ここでは、最も異なる領域を持つ動物に免疫を与え、その後、事前吸着によって交差反応性抗体を除去することにより、高度に保存されたタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対する抗体を選択的に標的としています。

NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

本手順の全体的な目的は、交差反応性抗体を除去することで、密接に関連するタンパク質に対する抗体の特異性を高めることです。これは、まず、相同タンパク質間で最も相違が大きいタンパク質ドメインを特定することによって達成されます。第二のステップは、これらのタンパク質ドメインを発現させ、精製することです。次に、これらのタンパク質ドメインをN末端またはC末端を介してクロマトグラフィーマトリックスに結合させます。本デモンストレーションではSpherosを使用しています。最終ステップでは、免疫血清を各交差反応性ドメインが結合したレジンとともにインキュベートします。最終的に、手順の有効性を評価するためにELISAおよびウェスタンブロッティングを行います。モノクローナル抗体の使用やアフィニティー精製などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、既知の交差反応性エピトープを排除しつつ、目的の標的に対する親和性を維持できることです。一般的に、この手法を初めて行う人は、研究対象とするタンパク質が不安定であるために苦労することがあります。本手順のデモンストレーションは、当研究室のポストドクターであるUri Kim博士が行います。本研究では、ニューロン由来孤立受容体（nor1）用と、NER増殖因子IB（nor77）用の2本のカラムを使用します。両方のタンパク質に同一のプロトコルが適用されるため、ここでは1本のカラムの調製のみを実演します。レジンに結合させるタンパク質を氷上で解凍し、モル吸光係数と280 nmにおける吸光度を用いてタンパク質濃度を決定します。タンパク質2 mgに対してレジン2 mLを使用してください。以降のすべての手順は、レジン2 mL分での操作となります。10 mLカラムを用意し、FRを底まで押し込み、PBS (pH 7.4)を流して調製します。カラムの底部にキャップをし、2 mLのカップリングバッファーを加えます。スラリー4 mLをカラムに加えて、2 mLのレジンを得ます。ボトムキャップを取り外し、カラム内を液切りします。カップリングバッファーを計6 mL（または樹脂ベッド容量の3倍量）でカラムを洗浄し、液切りします。カップリングバッファーの液切り後、ボトムキャップを再度取り付けます。次に、カップリング緩衝液に懸濁させたタンパク質溶液を2〜4 mL、カラムに加えます。カップリング効率を評価するため、タンパク質溶液の一部を分注して保存しておきます。その後、カラムにキャップをし、エンドオーバーエンドで混合します。均一な溶液を作成するため、レジンの体積を考慮して反応の全量を測定し、反応液1 mLあたり10 µLの5 M sodium sano boro hydrideを添加します。カラムにキャップをし、上下に反転させて混合します。カラムをチューブローテーターに固定し、一晩反応させます。翌朝、4 °Cでカラムを化学フュームフードへ移動させ、ガスが発生している可能性があるため、慎重にキャップを取り外します。カラムの中身を清潔なチューブに回収し、溶出液（elu）を保存します。溶出液のタンパク質濃度を測定し、開始時のタンパク質濃度と比較します。結合効率を評価するために、樹脂を4 mLの結合バッファーで洗浄し、カラム内の液を切り出します。リガンド結合領域（LBD）が樹脂に結合したら、次のステップとして残りの部位をブロッキングします。この手順を開始するには、樹脂を4 mLのクエンチングバッファーで洗浄して液を切り出し、底部キャップを再度取り付けます。2 mLのクエンチ緩衝液を加え、レジンを懸濁させます。レジンの量とクエンチ緩衝液の量を測定し、全反応液量を算出します。反応液量1 mLあたり10 µLの5 M ナトリウムシアノボロヒドリドを添加します。室温で30分間、緩やかに混合します。エンドオーバーエンドで回転させてください。30分後、カラムをドラフトチャンバーに移動させます。上部キャップを慎重に取り外し、次に底部キャップを取り外して、カラム内の液を廃棄チューブに排出させます。洗浄液を樹脂体積の5倍量用いてカラムを洗浄します。280 nmにおける吸光度を測定し、残留タンパク質の有無を確認しながら洗浄を行います。高塩濃度によって、結合していないタンパク質が洗い流されます。最後に、0.02%アジ化ナトリウムを含むDGAs PBS 6 mLで樹脂を洗浄し、次に使用するまでカラムを4 °Cで保存します。NORE 77 LBD結合カラムを10 mLのPBSで洗浄し、液を十分に切り、NORE 1特異的抗体の精製手順を開始します。カラムの底部にキャップをし、液を切ったNORE 77 LBD結合カラムを新しい15 mL回収チューブに入れます。5 mLのタンパク質（精製済み抗NORE 1抗体）をカラムに加え、キャップを閉めます。カラムをローテーターに設置し、4 °Cで1時間置きます。次に、上下のキャップを取り外し、フロースルーを回収します。フロースルーは、nor. One LBD結合カラムに添加するまで、氷上で保管しておきます。LBD結合カラムを10 mLのPBSで洗浄し、液を切り落とします。カラムの底部にキャップをし、LBD結合カラムを15 mLの回収チューブに入れます。NO77 LBD結合カラムからのフロースルーを加えます。カラムにキャップをし、4°Cのローターで1時間静置します。1時間後、上下のキャップを取り外し、通り抜け液を回収します。280ナノメートルにおける吸光度を測定し、抗体濃度を定量します。精製したanti nore one抗体を、続いてELISAで分析します。96ウェルプレートの各ウェルに、タンパク質を100 µLずつ加えます。3種類の異なるタンパク質をテストする場合は、タンパク質1をウェルA1〜H4に100 µLずつ、タンパク質2をウェルA5〜H8に100 µLずつ、そしてタンパク質3をウェルA9〜H12に100 µLずつ加えます。プレートを密閉し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、コーティングしたウェルを1ウェルあたり300 µLのPBSで2回洗浄します。その後、抗原をコーティングしたすべてのウェルに300 µLのELISAブロッキングバッファーを加え、室温で2時間インキュベートします。2時間のブロッキング後、各ウェルのELIZAブロッキングバッファーを100 µLの新鮮なELIZAブロッキングバッファーに交換します。行のすべてのウェルに、希釈した精製anti-EU one抗体を100 µLずつ加えます。その後、室温で1時間インキュベートします。プレートを0.05% Tween 20で3回洗浄し、3回目の洗浄後、プレートをブロットして余分な洗浄バッファーを除去します。ELISAブロッキングバッファーで希釈した、 horseradish peroxidase標識 goat anti-rabbit IgGを各ウェルに100 µLずつ加え、室温で1時間インキュベートします。1時間後、前述と同様にプレートを0.05% Tween 20で3回洗浄し、3回目の洗浄後に処理を完了します。すべてのウェルに300 µLの脱イオン水を満たして洗浄し、プレートを吸収紙の上に反転させて余分な水分を拭き取ります。室温に温めた3', 5', 5'-tetraethyl benadineを100 µLずつすべてのウェルに加え、室温・暗所で15～30分間インキュベートします。各ウェルに2 NのS uric acidを50 µL加えて反応を停止させます。最後に、450ナノメートルにおける吸光度を測定します。650ナノメートルでのバックグラウンドを差し引きます。タンパク質の比較を行います。特異的抗体を用いない精製タンパク質の測定です。精製した抗Noro 1抗体をNO77 LBDおよびNO1 LBDカラムに連続的に通過させたところ、精製した抗NO1はNO1 LBDに強力な結合を示した。また、NO77 LBDおよびNO1 LBDに対しても有意な結合を示した。抗NO1をNO77 LBDおよびNO1 LBDを用いてさらに精製したことで、この交差反応性は完全に除去された。この特異性は、Mycタグ付きのフルレングスNor 1、Nor 1およびNor 77を搭載した発現ベクターをトランスフェクトした細胞抽出液のウェスタンブロット解析によってさらに実証された。抗Myc抗体により、各フルレングスタンパク質が期待される分子量で発現していることが明らかになった。精製した抗Nor 1はフルレングスNor 1を強力に検出したが、Nor 1およびNor 77も、効率は低いものの検出した。対照的に、完全に精製されたnor one抗体は、nor oneおよびnor 77に対して検出可能な交差反応を示しませんでした。完全に精製されたnor one抗体を用いた中脳ドーパミン作動性ニューロンの免疫組織化学的解析により、nor oneの顕著な発現が確認されました。さらにチロシン水酸化酵素を用いて免疫組織化学的解析を行ったところ、nor oneは黒質領域の中脳ドーパミン作動性ニューロンの核にのみ特異的に発現していることが明らかになりました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。ナトリウムイオンまたは水素化物を取り扱う際は極めて危険であるため、この手順を行う際は常に化学ドラフト内で作業するといった予防策を講じることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、メタロペプチダーゼに対する組換え抗体の産生手順を示しています。抗体、緑色蛍光タンパク質、および抗生物質耐性の遺伝子を保有する組換えプラスミドを、リポフェクタミンで上皮細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションした細胞を選別し、培養して組換え抗体を作製します。...

メタロペプチダーゼに対する組換え抗体の作製法

近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。...

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

ここでは、Eに（P）ドメインを突出高品質のノロウイルスを発現し、精製するための方法を記載しますX線結晶学研究における使用のための大腸菌 。この方法は、他のカリシウイルスPドメイン、ならびに非構造タンパク質に適用することができる、すなわち 、ウイルスタンパク質ゲノム結合（のVPg）、プロテアーゼ、及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）。...

ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em&gt; E。大腸菌</em&gt; X線結晶用

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

我々 は異所萌出へ自己免疫性脳炎が疑われる患者の血中 NMDA 受容体に対する自己抗体を検出する抗原としてヒト胚性細胞 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質が付いた NMDA 受容体の NR1...

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA...

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

中和抗体や血清や脳脊髄液 (CSF) など、行列の人間の酵素補充療法の細胞内取り込みを妨げるその他の要因を検出する細胞ベースのフロー...

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞で発現する組換え抗体タンパク質と、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生されたモノクローナル抗体は、ブタアミノペプチダーゼN(APN)タンパク質を認識して結合することができます。...

ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

トルクメータでテザーショウジョウバエのヨートルクを測定することは実験動物の刺激の状況の神経科学者絶妙なコントロールが可能になります。一緒にショウジョウバエで利用可能なユニークな遺伝的なツールで、このパラダイムは、神経生物学研究の幅広いさまざまな目的で使用されます。...

トルクメーターでのショウジョウバエのオペラント学習

学ぶ、相同タンパク質に対する抗体の特異性向上法。分岐したタンパク質ドメインを用いた免疫化とクロマトグラフィーによる交差反応性抗体の除去により、NURR-1、Nor1、Nur77などの標的タンパク質への高特異的抗体を開発する手法です。

NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

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