Name: アンインビトロ HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶHIVとマラリアの重感染における免疫応答解析法。Plasmodium falciparum培養と末梢血単核球の共培養により、HIV陽性者の自然免疫細胞サイトカイン活性をフローサイトメトリーで評価します。重感染治療戦略の開発に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.A.M.F.とL.S.は、プロトコールの設計、データの取得と分析、および記事の起草に参加しました。 
著者は、Dr. Kain、Dr. Loutfy、Dr. Wasmuth、Dr. Ayiの貢献に感謝したいと思います。
C.F.は、CTN/Ontario HIV Treatment Network（OHTN）のポスドクフェローシップによって支援されました。L.S.は、OHTN Junior Investigator Development Awardによって支援されています。本研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)の運営助成金(MOP-13721および115160)とCIHR New Investigator Catalyst助成金の支援を受けました。

<ol><li>Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+consequences+of+coinfection%3A+cytokines+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large.</a> Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).</li>
<li>French, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+rates+of+malarial+fever+with+deteriorating+immune+status+in+HIV-1-infected+Ugandan+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults.</a> AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).</li>
<li>Hoffman, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+HIV-1+RNA+blood+plasma+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration.</a> AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).</li>
<li>Kamya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+infection+on+antimalarial+treatment+outcomes+in+Uganda%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study.</a> The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).</li>
<li>Kublin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).</li>
<li>Mermin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+co-trimoxazole+prophylaxis%2C+antiretroviral+therapy%2C+and+insecticide-treated+bednets+on+the+frequency+of+malaria+in+HIV-1-infected+adults+in+Uganda%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study.</a> Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).</li>
<li>Patnaik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HIV-1+serostatus%2C+HIV-1+RNA+concentration%2C+and+CD4+cell+count+on+the+incidence+of+malaria+infection+in+a+cohort+of+adults+in+rural+Malawi%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi.</a> The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).</li>
<li>Whitworth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+and+increasing+immunosuppression+on+malaria+parasitaemia+and+clinical+episodes+in+adults+in+rural+Uganda%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study.</a> Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).</li>
<li>Francesconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV%2C+malaria+parasites%2C+and+acute+febrile+episodes+in+Ugandan+adults%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study.</a> AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+Tim-3+expression+on+innate+cells%3A+combination+antiretroviral+therapy+results+in+partial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+acquired+immune+deficiency+syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration.</a> Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+innate+immunity+to+malaria+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).</li>
<li>Ljungstrom, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLjungstrom%2C+I+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx">http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx</a> (2013).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html">http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html</a> (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-DDCT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hensmann, M., Kwiatkowski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+early+cytokine+response+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum.</a> Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).</li>
<li>Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+malaria%3A+rapid+induction+of+IFN-gamma+from+human+NK+cells+by+live+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+parasitology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li>
<li>Ludlow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+inhibits+phagocytosis+and+inflammatory+cytokine+responses+of+human+monocyte-derived+macrophages+to+P.+falciparum+infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes.</a> PloS one. 7 (2), e32102(2012).</li>
<li>Weinberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+functional+activity+of+cryopreserved+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).</li>
<li>Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+method+for+evaluating+the+cryopreservation+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).</li>
<li>Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+responses+in+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+kinetics+of+cell+viability%2C+cellular+subsets%2C+proliferation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production.</a> Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).</li>
<li>Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+expression+of+Th1+and+Th2+cytokines+in+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+different+cytokine+profiles%2C+analysed+with+three+common+assays%3A+an+overall+decrease+of+interleukin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4.</a> Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+of+immune+responses.+XI.+Heightened+secretion+of+tumor+necrosis+factor-alpha+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells.</a> Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+immune+responses.+X.+Decrease+in+interleukin-12+production+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+by+the+endogenously+hypersecreted+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10.</a> Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+ACTG+Immunology+Advanced.+Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials.</a> The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々のプロトコルは、最も現実的に、インビトロでの HIV-マラリア同時感染を研究するために最適化されています。まず、新鮮なヒト赤血球と血清はマラリア原虫の培養に必要とされます。これは、マラリア原虫の健常者集団を得ることが不可欠です。サイトカイン産生をはるかに迅速かつ強烈であるとしてライブPを使用したとき寄生虫溶解物は、ライブ寄生虫の代わりに使用することはできません熱帯熱マラリア原虫は 、RBC（PfRBC）17,18を感染させました。また、NK細胞のような細胞型の活性化は、全体PfRBCsを必要とし、寄生虫の溶解物を効率的に動作しません。これはPfRBCと白血球との間の直接接触の必要性であり得るか、または細胞表面受容体18と相互作用寄生虫由来のリガンドの不安定な性質に起因し得ます。マラリアPfRBCの培養もよく、実験前に（プロトコル4）を同期させる必要があります。同期PfRBCsは、実験データの再現性を向上させます。このプロトコルが、デ律共培養のための栄養型の段階PfRBCの使用は、それが簡単にリングステージPfRBCの研...

同時感染、複数の同時感染症の感染は、自然環境では標準です。同時感染は、疾患の病理学上の各感染の臨床管理に大きな影響を持つことができます。同時感染、ワクチン及び薬物の有効性、ならびに診断試験の文脈では、悪影響を受けることができる（1に概説）。しかし、その重要性にもかかわらず、病原体研究の大半は、単一の感染を考慮します。 マラリアおよびHIV-1（HIV）は世界的に罹患率と死亡率の原因をリードしています。 10 -マラリアやHIVの地方的流行の領域は同時感染のリスクが何百万人もの人々を入れ、その結果、より重度の臨床疾患2のリスクが、広い地理的なオーバーラップを共有しています。 2疾患は否定的に相互作用します。 HIVに感染した個体は、より高いHIVウイルス負荷およびCD4 + T細胞数の一時的な減少をしながら、マラリア感染の間に見ることができますマラリア原虫の負担と臨床および重症マラリアのリスクが同時感染した個体2,3,5,7,8,10に高くなっています。 HIVは、マラリアの重症度を増加するメカニズムは完全に理解し、さらなる調査を保証されていません。 ここでは、マラリア、HIV同時感染をインビトロで研究することができる方法を記載している。具体的には、この方法は、HIV感染の文脈におけるマラリア特異的免疫応答の検査が可能になります。我々のプロトコルは、培養されたP.慢性的にHIVに感染したドナーからインビトロで単離新たに単離した末梢血単核細胞を用いた汎用性の高い共培養系（のPBMC）について説明熱帯熱マラリア原虫は赤血球（PfRBC）を寄生しました。これらの応答のHIV抗レトロウイルス療法の影響はまた、HIV（+）ドナー前および治療後からプロスペクティブに収集したPBMCを使用して検査することができます。 我々は、HIV感染の影響を調査するためにこのシステムを使用していますマラリア固有の自然免疫応答の11,12、およびNK細胞で損なわれることマラリア固有のIFNγおよびTNF応答を決定することができました、HIV（+）ドナー前後のHIV抗レトロウイルス療法からNKT細胞、γδT細胞。さらに、当社は、単球の機能はまた、HIV（+）ドナーにおいて減損が、後のHIV抗レトロウイルス療法を回復していると判断する。このシステムを使用することができました。

<table><tbody><tr><td>アラニン</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>抗体 (他の表を参照)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>には、ブレフェルジン A、Cytofix/Cytoperm バッファー、パーマ/洗浄バッファー</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Solution A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer ヘパリンナトリウム</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr> が含まれます。<tr><td>DPBS (カルシウム、マグネシウムなし)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>heat inactivated before use</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>gentamycin (10 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 Staining Set</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>Σ</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>Σ</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (10 mM)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Σ</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 粉末</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 L-グルタミンと HEPES</td><td>サーモScientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (粉末、細胞培養)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843、552845</td><td>は使用される抗体に依存します</td></tr><tr><td>寄生虫ガス混合物</td><td>特注</td><td></td>で<td>3%CO2、1%O2、バランスN2</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956;mフィルターユニット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mlチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラグを抜いた パスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラグを差し込んだパスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌トランスファーピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター (3レーザー)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>フローサイトメトリーに使用される抗体</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンチTNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC(蛍光色素)
2 &#956;l</td></tr><tr><td>アンチIFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE(蛍光色素)
20 &#956;l</td></tr><tr><td>抗CD8</td><td>バイオレジェンド</td><td>300914</td><td>PE-Cy7(蛍光色素)
1 &#956;l</td></tr><tr><td>抗CD14</td><td>バイオレジェンド;BDバイオサイエンス</td><td>325624;551487</td><td>ビオチン(蛍光色素)
0.5 &#956;l
ストレプタビンPE-TR(蛍光色素)
0.1 &#956;l</td></tr><tr><td>抗CD56</td><td>バイオレジェンド</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5(蛍光色素)
5 &#956;l</td></tr><tr><td>アンチ-&#947;&#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC(蛍光色素分子)
5 &#956;l</td></tr><tr><td>抗CD3</td><td>バイオレジェンド</td><td>300426</td><td>APC-Cy7(蛍光色素)
5 &#956;l</td></tr><tr><td>抗CD4</td><td>バイオレジェンド</td><td>317424</td><td>パシフィックブルー(蛍光色素)
1 &#956;L</td></tr></tbody></table>

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; hiv重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

マラリアとHIVの同時感染は、健康上の優先事項としてますます高まっています。しかし、マラリアやHIVに関するほとんどの研究は、現在、それぞれの感染に個別に焦点を当てています。これらの病原体それぞれの疾患動態を独立して理解することは重要ですが、これらの病原体間の相互作用を調査し理解することも重要です。
私たちは、HIV感染の状況におけるマラリアに対する宿主の免疫反応を研究するために、HIV-マラリア同時感染の多用途のin vitroモデルを開発しました。私たちのモデルでは、細胞上清、細胞表面および細胞内タンパク質マーカー、およびRNA発現レベル中の分泌因子の研究が可能です。実験デザインと使用した方法は、ばらつきを制限し、データの信頼性と再現性を促進します。
このモデルで使用されるすべての病原体は、自然界のヒト病原体(熱帯熱マラリア原虫とHIV-1)であり、すべての感染細胞は自然に感染し、新鮮に使用されます。熱帯熱マラリア原虫に寄生したヒト赤血球をin vitroで連続培養して使用しています。私たちは、慢性的なHIV感染のボランティアから新たに分離された末梢血単核細胞を入手します。使用されるすべての条件には適切なコントロールがあり(熱帯熱マラリア原虫寄生菌と正常な赤血球)、すべてのHIV感染ドナーはHIV非感染コントロールを持っており、そこから細胞が同じ日に採取されます。このモデルは、HIV感染の状況におけるマラリア原虫とヒト免疫細胞との間の相互作用を研究するための現実的な環境を提供します。

グラフは、NKT細胞の集団を得るためにCD56 + CD3 +γδ-ゲートを使用して、NKT細胞からのIFNγ産生（ 図2）のレベルを示している（データは示さず）。細胞は染色前に72時間培養しました。一度染色100,000 CD3 +細胞は、NK、NKTおよびγδ細胞（目的の細胞）の十分な大きさの集団を得るために、フローサイトメーターで得ました。 5600 NKT細胞の最小値を各グラフに表示されます。 TNF産生は、同様の方法で得られた（データは示さず）。 （ - ）PfRBCに曝露された個体のグラフは明らかにIFNγ産生がHIVに比べて、HIV（+）個体由来の細胞では低くなっていることを示しています。 フローサイトメトリー分析は非常に主観的です。これは、各実験のためのすべての適切な制御を有することが不可欠である（ 図2参照）。バックグラウンドレベルは、サイトカイン染色の真の表現を可能にするFMOサンプルを用いて計算されます。PMA /イオノマイシンで刺激された細胞は、陽性対照として使用した（データは示さず）。 P...

ヒトの同時感染はin vitroで再現するのが困難です。しかし、ヒトマラリア原虫は、新たに分離されたヒト末梢血単核細胞がHIVに自然に感染したのと同様に、in vitroで容易に培養することができます。これは、HIVの同時感染の文脈でマラリア原虫に対する初期の免疫応答を研究するための優れたモデルを提供します。

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

本実験の全体的な目的は、慢性HIV感染状態におけるマラリアへの自然免疫応答を観察することである。まず、ヒト赤血球を用いて生きたP. falciparum原虫を培養し、次に、HIV陽性および非感染のドナーから得られた末梢血単核細胞を、マラリア原虫に感染した赤血球と共培養することでこれを達成する。最終的に、フローサイトメトリー解析を用いて、HIV陽性者の自然免疫細胞によるサイトカイン活性を非感染対照群と比較評価します。この手法は、共感染分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、HIVのような感染症の存在が、マラリアのような第二の感染症に対する免疫応答にどのような影響を与えるかといった点です。寄生虫を同期させるため、寄生虫培養液を遠心分離し、ペレット中のトロフォゾイト期の寄生虫を、室温で37 °Cのアラニン溶液19倍量を用いて溶解します。15分後、細胞をRPMIで2回遠心分離します。2回目の洗浄後、R-P-M-I-Aを用いてヘマトクリット値を3%に調整します。その後、フラスコ内にガスを充填し、トロフォゾイトが5%から10%の寄生率に達するまで37 °Cのインキュベーターに戻し、サンプルの寄生率を算出します。血層から10 µLのサンプルをガラススライド上に分注し、血液が乾燥した後、2枚目のガラススライドを用いて血液の薄膜を作成します。メーカーのプロトコルに従い、HEMA 3色染色キットを用いてスライドを染色します。感染赤血球の総数を算出するため、光学顕微鏡で300個の細胞を計数し、濃い紫色に染色された寄生赤血球の数と、淡いピンク色の非感染細胞の数を比較してヘマトクリット値を決定します。ヘモサイトメーターを用いて、寄生虫培養液1ミリリットルあたりの赤血球数を測定します。次に、寄生虫培養液を再度遠心分離し、R-P-M-I-S plusを用いて、寄生虫感染赤血球数が6 × 10⁶個/mLとなるように細胞を再懸濁します。HIV陽性またはHIV陰性のドナーから得られた血液サンプルを、同量の冷DPBSで希釈してヒトPBMCを分離します。次に、それぞれのサンプルに対し、室温のFicoll 15mLを50mLチューブに加えます。25 mLの血液DPBS溶液を加え、続いて血液およびDPBS溶液を最大25 mLまで慎重に重層させます。滅菌プラスチック転送ピペットを用いて遠心分離により細胞を分離し、その後、滅菌プラスチック転送ピペットを使用して界面からPBMCを回収します。回収したPBMCを最大20 mLずつ分注し、個別の50 mLチューブに移します。次に、滅菌した冷たいDPBSを用いて、各チューブの全量を50 millilitersまで合わせます。再度細胞を遠心分離し、最終洗浄後の2回の洗浄として、ペレットを50 millilitersの新鮮な滅菌DPBSに再懸濁します。細胞を10 millilitersのR-P-M-I-S plusに再懸濁して計数し、その後、共感染のセットアップのために、PBMCの最終濃度をR-P-M-I-S plus中で10 times 10 to the six cells per milliliterに調整します。まず、分取したばかりのHIV陽性およびHIV陰性のPBMCを1×10⁶個ずつ、R-P-M-I-S plus 100 µLと共に24ウェルプレートの各ウェルに播種します。次に、R-P-M-I-S plus 400 µLを加えて各ウェルの全量を500 µLにします。その後、非感染赤血球または寄生赤血球を3×10⁶個、全量500 µLで3連（triplicate）にて、HIV感染細胞および非感染細胞に加えます。この共感染プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。その後、適切な実験時間を経過させた後、細胞をペレット化し、各ウェルから700 µLの培養上清を回収します。上清を遠心分離してデブリを除去し、必要に応じてサンプルを分注します。チューブにラベルを貼り、後で分析できるよう-20 °C以下で冷凍保存します。細胞特異的なサイトカイン産生分析の6〜8時間前に、インキュベーションの終了時に、各ウェルに1000 D per feldenを1 µLずつ加えてサンプルを処理します。プレートを氷上に15分間置きます。次に、滅菌ピペットを用いてプレート底面から細胞を回収し、ラベル付きのマイクロ遠心チューブに移します。その後、細胞を遠心分離し、ペレットを500 microlitersのフローサイトメトリー用バッファーで再懸濁します。各サンプルについて、完全抗体染色用のチューブが少なくとも1本確保されるように細胞を分注します。フルオロクロムマイナスワン（FMO）コントロール抗体染色のためのチューブ1本に加え、未染色のフローサイトメトリーコントロールも1本用意します。次に、全抗体染色およびFMOコントロール細胞を、あらかじめ滴定した濃度の4種類のフルオロクロム標識抗体（目的の細胞表面マーカーに対するもの）を含む50 µLのフローサイトメトリーバッファーで、4 °C、遮光下にて20分間標識します。サンプルを1 mLのフローサイトメトリーバッファーで洗浄し、各チューブに100 µLのcyto fixed cyto perm溶液を加えます。4 °Cの暗所で20分間静置した後、細胞を1 mLの透過洗浄バッファーで洗浄し、遠心して細胞を回収し、ペレットを100 µLの透過洗浄バッファーに再懸濁させます。そこに、目的の細胞内マーカーに対する適切にタイトレーションした濃度のFluoro 4結合抗体を加えます。これで染色サンプルが完成します。すべてのチューブを、遮光した状態で4 °Cで30分間インキュベートします。次に、1本あたり1 mLの透過性洗浄バッファーでサンプルを洗浄します。最後に、フローサイトメトリーによる分析前にHIVを不活化させるため、1%パラホルムアルデヒドを添加した300 µLの低サイトメトリーバッファーでペレットを15分間固定します。これらのグラフには、寄生赤血球または対照の非感染赤血球に曝露させたHIV陽性者およびHIV陰性者のナチュラルキラーT細胞からのインターフェロンγ産生レベルが示されています。HIV陽性PBMCでは、寄生赤血球の存在下でインターフェロンガンマの産生が認められず、HIV陰性個体由来のPBMCが示す強力なサイトカイン産生と比較して、マラリア感染に対する自然免疫応答が抑制されていることに注意してください。したがって、HIVの取り扱いは極めて危険であり、これらのプロトコルを実施する際は、すべての工程をバイオセーフティキャビネット（レベル2）内で行い、適切な安全装備を着用し、ガラス製の鋭利な物体やアスピレーターの使用を避けるなどの予防措置を講じることを忘れないでください。

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス1型、HIV-1によるヒト子宮粘膜組織の生体外感染と、ゼラチンスポンジの上での気液界面でのそれらの維持を示しています。この方法により、ヒト組織内でのHIV-1の複製と病因のモニタリングが可能になります。...

ex vivo条件でのHIV病因を研究するためのヒト子宮頸部粘膜感染モデル

マラリア-HIV同時感染のin vitro細胞培養モデルの生成

このビデオは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化マウスモデルを生成する技術を示しています。ヒト胎児胸腺組織と人工造血幹細胞(HSC)を、重度の免疫不全マウスの腎臓嚢に移植します。HIVに対してキメラ抗原受容体(CAR)を発現する造血幹細胞は、ゼラチン状のタンパク質混合物に混合され、胸腺組織との共局在を促進します。処置後、HSCはさまざまなヒト免疫細胞に分化し、HIVに対する機能的なヒト免疫システムを備えたヒト化マウスモデルが開発されます。...

HIVに対する遺伝子操作免疫を持つヒト化マウスモデルの構築

我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。...

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。...

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

マラリア原虫が侵入し、赤血球内で複製する。メロゾイトの侵入および寄生虫の正確な評価は、マラリア感染の経過を評価するので、非常に重要です。ここでは、マラリアのマウスモデルにおいて、これらのパラメータを測定するためのフローサイトメトリーベースのプロトコルを説明する。...

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

このプロトコルは、HIV感染に対する幹細胞ベースの操作免疫を持つヒト化骨髄/肝臓/胸腺マウスモデルを構築する方法を説明しています。...

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

このプロトコルの全体的な目標は、自然に 熱帯熱マラリア原虫...

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

ここでは、感染の血液期における マラリア原虫 に対する細胞性免疫のメカニズムを解明するのに役立つ新しい方法について説明します。これは、細胞傷害性リンパ球による感染した赤血球の死滅を測定する in vitro...

インビトロ 細胞傷害性リンパ球による マラリア原虫感染赤血球殺傷のアッセイ

学ぶHIVとマラリアの重感染における免疫応答解析法。Plasmodium falciparum培養と末梢血単核球の共培養により、HIV陽性者の自然免疫細胞サイトカイン活性をフローサイトメトリーで評価します。重感染治療戦略の開発に有用です。

アン

さらに動画を探す