アンインビトロ HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

次の実験の全体的な目標は、慢性HIV感染環境におけるマラリアに対する自然免疫応答を観察することです。これは、まず、HIV陽性で感染していない末梢血単核細胞の第2ステップとして、ヒト赤血球で生きたP偽パラム寄生虫を培養することによって達成されます。ドナーは、マラリア原虫に感染した赤血球と共培養されます。

最終的に、フローサイトメトリー解析は、HIV感染者の自然免疫細胞サイトカイン活性を、感染していない対照群と比較して評価するために使用されます。この方法は、重複感染の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。例えば、HIVのような1つの感染症の存在は、マラリアのような2番目の感染症の免疫応答にどのような影響を与えるか 寄生虫を同期させるには、寄生虫培養をスピンダウンし、栄養型血液をペレット内の37°Cのアラニン溶液19容量で溶解します 室温で15分後、RPMIゼロの細胞を2回スピンダウンします。

2回目の洗浄後、ヘマトクリット値をR-P-M-I-Aで3%に調整します。次に、フラスコにガスを注入し、栄養型が5〜10%に達するまで摂氏37度のインキュベーターに戻して、サンプルのパーシットを計算します。血液層から10マイクロリットルのサンプルをスライドガラスに分注し、血液が乾燥した後、2番目のスライドガラスを使用して血液の薄膜を作成します。

メーカーのプロトコルに従って、HEMA 3染色キットを使用してスライドを染色します。感染した赤血球の総数を計算します。光学顕微鏡で300個の細胞を数え、濃い紫色に染色された寄生赤血球の数と淡いピンク色の非感染細胞の数を比較して、ヘマトクリット値を決定します。

ヘモサイトメーターを使用して、寄生虫培養物のミリリットルあたりの赤血球数を決定します。次に、寄生虫培養物を再度スピンダウンし、細胞をR-P-M-I-Sの1ミリリットルあたり6回の寄生赤血球に再懸濁し、さらにHIV陽性またはHIV陰性のドナーから得られたヒトPBMC希薄血液サンプルを等量の冷たいDPBSで分離します。次に、室温の15ミリリットルでFialをそれぞれ50ミリリットルのチューブに入れます。

25ミリリットルの血液DPBS溶液、続いて最大25ミリリットルの血液とDPBS溶液を慎重に層状にします。滅菌プラスチックトランスファーピペットを使用して、遠心分離によって細胞を分離し、滅菌プラスチックトランスファーピペットを使用してインターフェースからPBMCを回収します。PBMCの最大20ミリリットルのアリコートを個々の50ミリリットルのチューブに移します。

次に、滅菌コールドDPBSを使用して、各チューブの総容量を最大50ミリリットルにします。次に、細胞を再度スピンダウンし、最終洗浄後にさらに2回の洗浄のために、ペレットを50ミリリットルの新鮮な滅菌DPBSに懸濁します。Reusは、カウントのために10ミリリットルのR-P-M-I-S plusで細胞を懸濁し、その後、PBMCをR-P-M-I-S plusの1ミリリットルあたり6細胞の10倍の最終濃度に調整して、同時感染を設定します。

培養は、新たに分離されたHIV陽性およびHIV陰性のPBMCを100マイクロリットルのR-P-M-I-Sプラスで1ウェルあたり24ウェルプレートに1回10〜6回播種することから始まります。各ウェルの総容量を500マイクロリットルまで、400マイクロリットルのR-P-M-I-Sに加えて、3倍にして、ウェルあたり500マイクロリットルの総容量で、6つの非感染赤血球のうちの3倍、または6つの非感染赤血球のうちの3倍10をHIV感染細胞とHIV非感染細胞に寄生します。共感染プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。

次に、適切な実験時間の後、細胞をペレット化し、それぞれから700マイクロリットルの培養上清を収集します。上清を十分に遠心分離して破片を取り除き、必要に応じてサンプルを分注します。チューブにラベルを付け、後で分析するために摂氏マイナス20度以下で凍結します。

細胞特異的サイトカイン産生解析の6〜8時間前。インキュベーションの終わりに、フェルデンあたり1000 Dの1マイクロリットルでサンプルを処理します。プレートを氷の上に15分間置きます。

次に、滅菌ピペットを使用してプレートの底から細胞を取り出し、標識されたマイクロ遠心チューブに移します。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。各サンプルが完全な抗体染色のために少なくとも1つのチューブを持つように、細胞を分割します。

蛍光染色用のチューブ1本からコントロール抗体染色1本を引いたものには、未染色のフローサイトメトリーコントロール1本も含まれています。次に、50 μLのフローサイトメトリーバッファー中の全抗体染色と蛍光マイナス1のコントロール細胞を、あらかじめ滴定した濃度のフルオロで標識します。所望の細胞表面マーカーに対する4つの標識抗体を摂氏4度で、20分後に光から保護します。

サンプルを1ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーで洗浄し、各チューブに100マイクロリットルの細胞固定サイトパーマ溶液で洗浄します。暗所で摂氏4度で20分後、細胞を1ミリリットルの浸透洗浄緩衝液で洗浄し、細胞をスピンダウンし、ペレットを100マイクロリットルの浸透洗浄液で懸濁し、予め滴定した濃度のフルオロ4標識抗体を目的の目的の細胞内マーカーに添加します。サンプルの染色。

すべてのチューブを4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。次に、チューブあたり1ミリリットルの透過洗浄バッファーでサンプルを洗浄します。最後に、ペレットを300マイクロリットルの低サイトメトリー緩衝液に固定し、15分間パラホルムアルデヒドを補充してHIVを中和し、フローサイトメトリーによる分析を行う前に、これらのグラフでは、寄生赤血球に曝露されたHIV陽性およびHIV陰性の個人におけるナチュラルキラーT細胞からのインターフェロンガンマ産生のレベル、または感染していない赤血球を制御していることが示されています。

HIV陽性のPBMCで観察されたマラル感染に対する自然免疫応答の抑制は、寄生した赤血球の存在下でのインターフェロンガンマ産生の欠如によって証明されるように、HIV陰性の個人からのPBMCによって示される強力なサイトカイン産生によって証明されます。したがって、HIVとの作業は非常に危険であり、これらのプロトコルを実行する際には、レベル2のバイオセーフティキャビネットですべての手順を実行する、適切な安全装置を着用する、ガラスの鋭利な物体や吸引器の使用を避けるなどの予防措置を行う必要があることを忘れないでください。