磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

この手順の全体的な目的は、熱活性化リポソーム製剤の送達のために皮下腫瘍を局所的に加熱するために使用できる、カスタムメイドのレーザー加熱装置の動作を実証することです。これは、まず脂質膜形成、水和押出、および透析を通じてHTLC製剤を調製することで達成されます。第二のステップでは、ドナーマウスに子宮頸がん細胞を接種します。

4〜5週間後、腫瘍を摘出し、断片に切断して、受容マウスに個別に移植します。最終ステップとして、受容マウスの腫瘍をレーザー加熱システムを用いて局所的に42 °Cまで加熱します。このレーザー加熱装置はMR対応であるため、光照射中の組織温度の変化をモニタリングすることができ、また小型でポータブルであるため、小動物用MRのボア内で簡便かつ効果的に腫瘍を加熱することが可能です。

最終的に、熱感受性HTLCの熱活性化放出は、リアルタイム磁気共鳴画像法（MRI）によってモニタリングすることが可能です。ウォーターバスや加熱カテーテルを使用する既存の手法に対する本手法の主な利点は、熱処理の開始から1〜2分以内に腫瘍へ適合的に熱を供給できる点、およびレーザー出力をリアルタイムで調整することで処置中の温度変動を最小限に抑えられる点にあります。我々は、HTLC熱感受性リポソーム製剤を用いたin vivo研究を開始した際に、初めてこの手法を考案しました。

既存の手法では、皮下腫瘍の局所加熱を効率的に行うことができないことが分かりました。リポソームの調製手順については、私の研究室の博士課程学生であるmyungが実演します。リポソームを調製するには、まず調製したばかりの脂質混合物と調製したばかりの脂質薬剤混合物を混合し、脂質混合物の水和中に15～20分ごとにボルテックスを行いながら、1時間水和させます。200 nanometerのポリカーボネートフィルターを2層に重ねて10 milliliterエクストルーダーを組み立て、エクストルーダーのサーモバレルを70 °Cに設定した循環水槽に入れ、装置を圧縮窒素タンクに接続します。

水和後すぐに、脂質をエクストルーダーチャンバーに移し、窒素気流を導入します。次に、200 PSIの圧力でリポソームをメンブレンに通して押し出し、70 °Cのウォーターバスに設置した50 mLコニカルチューブに回収します。リポソームを5回押し出した後、装置を分解し、100 nmポリカーボネートフィルターを2枚重ねて再組み立てします。

圧力を400 PSIに設定し、先ほど実演した通りにリポソームを10回押し出します。最終的な押し出し後のリポソームを15 milliliterのコニカルチューブに回収して室温まで冷却し、その後、遠心分離によって不溶性のcisplatinを沈殿させます。次に、滅菌条件下で、分画分子量15,000の透析チューブを用い、0.9% salineに対して一晩透析を行います。子宮頸がん腫瘍ゼノグラフトを移植するため、90%コンフルエントな培養液から180個の細胞を回収し、ヘモサイトメーターを用いて生存している子宮頸がん細胞数をカウントします。

サイトメーターを用いて細胞を1×10⁶ cells/100 µLに希釈する。すべての動物実験はStar Innovation Centerで実施した。メスのSCIDマウスの後肢腓腹筋に筋肉内注射により接種し、キャリパーを用いて、腫瘍の最大径が9〜12 mmに達するまで腫瘍サイズを測定した。その後、ドナーマウスから腫瘍を摘出し、2〜3 mm³の断片に細切した。

次に、レシピエント動物の左後肢を剃毛し、露出した皮膚を切開します。ドナー腫瘍を1片、切開創から皮下に挿入し、植え込みの3～5日後に1～2個の皮膚クリップを用いて皮膚を閉じます。クリップを取り外し、熱処理を行うまで腫瘍を2～3週間成長させます。

まず、レーザーファイバーの一端をレーザー装置に、もう一端をイルミネーターに接続します。次に、麻酔をかけたレシピエントマウスの尾側静脈に27ゲージの注入カテーテルを挿入し、続いて腫瘍の中心に22ゲージのカテーテルを挿入します。その後、温度変化をモニタリングするために中空カテーテルに光ファイバー温度プローブを挿入し、腫瘍全体をイルミネーターで覆います。以上で完了です。

出力を0.8〜1 Wに設定し、レーザーを点灯させます。温度が上昇するまで待機し、治療中はレーザー出力を0.1〜0.8 Wの間で手動で調整して、腫瘍の温度を42 °Cに維持します。熱処理した腫瘍の断面図であるこの画像に示されているように、全出力を1 Wと想定すると、腫瘍内の任意の点における最大フルエンスレートは70 mW/cm²となり、皮膚深さにおける腫瘍内のフルエンスレートは最大フルエンスレートの50%であることが、プロトン共鳴周波数シフトを用いた磁気共鳴温度計測（MRT）加熱により確認されています。レーザーベースの加熱装置を使用すると、画像に示されるような比較的均一な温度分布マップが生成され、点光源による加熱前に取得した絶対ベースライン測定値からの相対的な温度変化を追跡します。磁気共鳴信号解析により、gad HTLCの投与後、加熱された腫瘍は未加熱の筋肉と比較して最も高い相対的信号増加を示し、加熱期間の終了までその信号が維持されます。この手法を習得し、適切に実施すれば、15分以内にセットアップすることが可能であり、温度感受性リポソーム製剤の前臨床評価のための有用なツールとなります。

クラス4レーザーの使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は常に安全ゴーグルの着用などの予防策を講じることを忘れないでください。