Name: 磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶレーザー加熱装置を用いた皮下腫瘍の局所加熱と感熱性リポソームからの薬剤放出の手法。MRIによるリアルタイム温度モニタリングが可能で、子宮頸がんモデルでの治療効果向上に貢献する。

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この研究は、カナダ衛生研究所（CIHR）からの運営助成金によってC.A.およびD.A.J.に資金提供されています。著者らは、この研究のイメージングおよび治療研究コンポーネントを可能にするSTTARR研究施設に資金を提供してくれたCanadian Foundation for InnovationとPrincess Margaret Cancer Foundationに感謝します。

1.リポソームの調製<ol><li> （カルボニル- 1,2- Dipalmitoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DPPC）、1-ステアロイル-2-ヒドロキシSN -glycero -3-ホスファチジルコリン（MSPCまたはS-リゾPC）およびN、脂質を溶解しますクロロホルム中メトキシ2000）-1,2- distearoyl- SN -glycero -3-ホスホエタノールアミン（MPEG 2000 -DSPE）。例えば、HTLCの10ミリリットルの調製のために、アンバーガラスバイアルに314.4 mgのDPPC、39.4ミリグラムのMSPC、および83.9 mgののmPEG 2000 -DSPEを量ります。その後、2mlのクロロホルム中の脂質を溶解し、60℃の水浴中で30秒間バイアルを加熱します。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去します。高圧真空O / Nの下で得られた脂質フィルムを配置します。 </li><li> HTLC 10mlのために、1時間、5 mlの0.1Nトリス緩衝液（pH7.4）で脂質膜を水和。同時に、162.4 mgの1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3-ホスホグリセロール（DPPG）、脂質および100mg CDDP粉末と水和物ワットを量りますi番目の5mLの0.1N 1時間30％エタノール液（pH7.4）を含有するTris緩衝液。 </li><li> Gd-HTLC製剤については、DPPG脂質及び10mgのCDDP粉末の同量を秤量し、（2.5ミリリットルのGd-HP-DO3A溶液（279.3 mg / mlの）プラス30％のエタノールを含有する2.5 mlの0.1Nトリス緩衝液で水和し1時間pHは7.4）。水和の際に、混合物は、琥珀色のバイアル中に維持しなければならないし、絶えず撹拌しながら70℃でホットプレート上に置き、10分ごとにボルテックスします。 </li><li>脂質混合物および脂質薬物混合物を組み合わせて、再び1時間水和。ボルテックスごとに15〜20分。 </li><li> 200 nmのポリカーボネートフィルターの2つのスタックで10-mlの押出機を組み立てます。 70℃の循環水浴に押出機のサーモを接続し、圧縮窒素タンクに押出機を接続してください。 </li><li>すぐに水分補給した後、押出機室に混合物を移します。膜を通してリポソームを押し出すために窒素流（200 PSIに設定圧力）を開きます。 liposomを収集50 mlチューブ中エス。押出プロセス中にすべての回で熱水浴（70℃）でチューブを保管してください。このプロセスを5回繰り返します。 </li><li>押出機を分解し、100 nmのポリカーボネートフィルターの2つのスタックに変更されます。押出機を再構築し、400 psiのに圧力を設定します。リポソームを10回押し出しを除き、ステップ5を繰り返し、。 15ミリリットルチューブに最終押出からサンプルを採取します。 </li><li> RTにリポソームを冷却し、不溶性のCDDPを沈殿させ、3分間1,000×gで遠心します。 </li><li>無菌条件下での15,000分子量カットオフ（MWCO）を有する透析チューブ中の0.9％生理食塩水に対してリポソームO / Nを透析します。 </li><li>蒸留水を990μlの中のリポソームの10μLを希釈します。 HTLC及びGd-HTLCのサイズ分布を測定するために、動的光散乱を使用してください。 10回それぞれに3回の測定を行います。 </li><li>蒸留水を3960μlの中のリポソームの40μLを希釈します。プラチナとガドリニウムの5-6標準溶液を作ります0.1から20μg/ mlの濃度範囲です。 3つの異なる波長で誘導結合プラズマ原子発光分析装置（ICP-AES）を用いて、白金およびガドリニウム濃度を測定します。平均の結果は、各波長での3回の測定を行います。 </li><li>示差走査熱量計（DSC）を用いて、HTLCのリポソーム製剤の液晶相転移温度 （T m）にゲルを決定します。 HTLCの負荷5〜10mgのDSCパンに基準と空パンを使用しています。 0℃から60℃まで温度をランプアップ5℃/分のスキャン速度を使用してください。 </li><li> 4°Cで露光し、店舗を防止するためにアルミホイルでリポソームを包みます。 </li></ol>リポソームからのインビトロ放出2. <ol><li>スピンカラムを準備します。 <ol><li> 3~4時間室温で400 mlの0.9％生理食塩水で50 gでゲル濾過ビーズをインキュベートします。 0.9％生理食塩水で濡れたグラスウールの一部を、ロールアップし、1 mlシリンジの先端に配置します。約0.05〜0.1ミリリットル注射器のを埋めるためにガラスウールを押します。徐々にシリンジに約1mlゲルろ過メディアを追加するガラスピペットを使用してください。 </li><li> 3分1,000×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に注射器を置きます。スピンカラムを削除し、15mlチューブにそれを置きます。 </li></ol></li><li> 8 1ドラムのガラスバイアルにサンプルHTLCまたはGdの-HTLCの400μLを、37℃または42℃のいずれかで温度制御された水浴中でインキュベートします。各時点で（ すなわち、5、15、30、60分）を1バイアルを取り出し、すぐに氷の上に置きます。 </li><li>その後、インキュベーション（コントロール）の前HTLCまたはGdの-HTLCの100μlを添加するか、スピンカラムへの水浴中でインキュベートした後、準備されたスピンカラムに0.9％生理食塩水100μlのを追加します。 3分1,000×gで遠心分離します。チューブからシリンジを取り外し、ICP-AES分析のためのチューブ内の溶液を希釈します。 </li></ol>子宮頸部の皮下異種移植片の3注入腫瘍<ol><li>すべての動物実験は、大学健康ネットワーク（UHN）の動物管理委員会によって承認された動物使用プロトコルに従って実施しました。 </li><li>安全キャビネット（BSC）内のすべての動物実験を行います。いずれの手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブ。各手術後、70％エタノールで手術器具を拭くとホットビーズ滅菌器を使用して再度滅菌します。 </li><li>安楽死のために、頸椎脱臼を行い、その後、絶縁CO 2チャンバー内に動物を配置します。 </li><li> 100％の酸素を使用して全身麻酔のために、誘導および維持のために、2％、5％イソフルランを使用しています。麻酔の深さを確保するために、動物の反応を観察するためにフットパッドの掌表面にピンセットで圧力をかけます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を塗布します。 </li><li>手術を受けた動物は、他の動物の会社のない清浄なケージに動物を配置します。十分な意識が回復されるまで監視します。 </li><li>培養アルファ最小必須培地（α-MEM）中のME-180細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充しました。 </li><li>細胞を採取し、接種前に完全培地中で細胞を維持します。血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>筋肉内（IM）ME-180（ヒト子宮頸癌細胞）腫瘍を負担する各ドナーマウスを接種します。 注：IM部位での成長は、十分に血管新生化腫瘍の発達を確保するために選択されています。社内の飼育施設からの雌SCIDマウス（6〜8歳の週、約20 g）を購入。 <ol><li>雌SCIDマウスを麻酔し、27 Gの針を用いて後肢の腓腹筋に1×10 6 ME-180細胞を注入します。 </li><li>腫瘍がその最長寸法で9〜12ミリメートルに達するまでキャリパーを用いて腫瘍サイズを測定します。腫瘍が12ミリメートルを超えた場合、または腫瘍塊が正常な動作、歩行、食品や水の摂取量を損なう場合は調査を終了します。 </li></ol></li><li>レシピエントマウスにドナーマウスからインプラント腫瘍断片。 <ol><li> 5％のイソフルランを使用して、ドナーマウスを麻酔。麻酔下で頸椎脱臼を使用して、マウスを安楽死させます。ドナーマウスからドナー腫瘍を除去します。 2〜3ミリメートル3の立方体の断片に腫瘍をカット。 </li><li> 5％のイソフルランを使用して、レシピエントマウスを麻酔。手術前にmlのメロキシカムを皮下に0.5mg /100μlのを注入します。剃毛した皮膚へのヨウ素の外科その後スクラブ液、70％エタノール、最後にヨウ素溶液を適用します。レシピエントマウスの左後肢を剃ります。皮膚のレベルで切開を行います。切開を通して一人のドナーの腫瘍片を皮下に挿入します。 1-2創傷クリップ（複数可）を使用して切開を閉じます。 </li><li> 3〜5日、移植後のクリップを削除します。皮下腫瘍は​​、レーザーベースの加熱設定を使用するために必要とされます。 </li><li>腫瘍が加熱処理前に2〜3週間成長できるようにします。 </li></ol></li></ol> 4.デザイン、ASSEMBLYとインビボ暖房等角レーザー配達照明器の校正<ol><li>光ファイバを用いた共形照明装置に結合された763ナノメートルのダイオードレーザーを用いて組織の加熱を達成します。 <ol><li>照明装置は、異種移植腫瘍の均一な表面的なレーザー照明を提供します。これは、30×20×17ミリメートルの真ん中（直径16mm）に1室と室の積分球3隣接光を含む高反射材料のブロックと両側に2小室（長さ16ミリメートルと5ミリメートルで構成されています直径）（ 図1）。 </li><li>他に1室から合格する光ためには、二つの小さな直径5mmの穴が小さい外室と、大きい中間室との間に切断しました。光は、600μmの直径の穴を通ってチャンバに渡され、レーザに接続された400μmのカット端の繊維を使用して、外側チャンバにレーザから送出されます。 </li><li>光intの性質上チャンバ壁とeractionは、小室の一つに供給される光が空間的に均質化し、それがさらに空間的に均質化する大きな室に内部ポートを通過します。光はその後、中間室に直径10mmポートを終了します。 </li></ol></li><li> NISTを使用して、レーザパワー設定値に対する照明光の供給を較正供給される電力を測定するために積分球50 mmの較正。 <ol><li>腫瘍の単純化された幾何学に基づいてモンテカルロシミュレーションを用いて腫瘍の光分布を計算します。ジャックらの多層組織における光輸送のモンテカルロ・モデリングの標準コードの商用計算ソフトウェアパッケージとベースで記述されたカスタムアルゴリズムにおけるモンテカルロコードを生成します。14。 </li><li>皮膚表面での7ミリメートルの平均腫瘍寸法に一致する直径を有するフラットスキンラインと、彼の上に横たわっている半球として腫瘍をモデル化5mmのIGHT。ランダムに球体の中心に露出した半球と直接を通じて光子を起動して、表面のモデル均質照明。 </li><li>吸収などの光学特性を使用して、μS = 10ミリメートル-1、異方性因子、G = 0.9、屈折率はn = 1.4を散乱、= 0.025ミリメートル-1μ。計算に百万光子を使用してください。 </li><li>初期校正後、それ以上の修正を加えた任意のin vivoでの加熱実験の前に、これらの測定を行います。 </li></ol></li></ol>カスタムデザインのレーザー室のセットアップを使用して腫瘍の5コンフォーマル暖房<ol><li>レーザ装置や照明装置にもう一方の端にレーザーファイバーの一方の端を接続します。 </li><li> 5％のイソフルランを用いて動物を麻酔。マウスの外側尾静脈に27 Gの注入カテーテルを挿入します。腫瘍の中心部に22 Gカテーテルを挿入します。光ファイバー温度PRを配置します温度変化を監視するための中空カテーテルにOBE。 </li><li>照明装置（ 図2）で腫瘍全体をカバーしています。まずレーザーをオンにして、温度が上昇するのを待つW. 0.8から1に電源を設定します。手動で0.1〜0.8 Wとの間のレーザパワーを調整することにより、42°Cでの腫瘍の温度を維持します</li></ol> MR温度測定によって評価6.温度分布（MRT） <ol><li>光ファイバ温度プローブの測定値と一緒に7テスラの前臨床MRイメージング・システム15上のプロトン共鳴周波数シフト（PRFシフト）MRTを介してレーザベースの加熱設定を使用して加熱された腫瘍の温度分布を測定します。 </li><li> 2D-FLASHのパルスシーケンスを用いて、10秒間隔で温度測定画像を取得（エコー時間4.5ミリ秒、繰り返し時間156.25ミリ秒）312 X 312ミクロンの面内分解能と光ファイバのレベルで単一のスライスで2mmのスライス厚で温度プロこと。 </li></ol>エージェントリリースの7 MRモニタリング<ol><li> T 1強調画像前及びGd-HTLCの投与後20分を実行します。 </li><li>移植のために第3節では、上記の方法を使用しての雌SCIDマウスのインプラント2の腫瘍、後肢のそれぞれに1つずつ、。 66.3ミリグラム/キログラムのGd-HP-DO3Aおよび1.4ミリグラム/ kgのCDDPの投与量でのGd-HTLCの注入前に42℃で5分間放置後肢上の腫瘍を予熱し、さらに20のために腫瘍を加熱ポスト噴射分。加熱処理時に注入を実行します。非加熱コントロールとして右後肢の腫瘍を使用してください。 </li><li>動的MR画像を取得する（36×20 mmの視野、200×200μmの面内分解能、2mmのスライス厚、MRシーケンスプロトコル）は全体の20分12秒間隔でのGd-HP-DO3Aの放出を監視しますGd-HTLCの投与後、注射前に30秒を開始します。 </li><li> （加熱、非加熱）腫瘍と筋肉のボリュームを輪郭。各輪郭ボリューム内のすべてのボクセルの平均MR信号を計算します。 </li></ol>

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開示はありません。

リポソームは、最初に、脂質二重層2以内にその内部の水性体積の親水性薬物及び疎水性薬物を運ぶ薬物送達媒体として1960年代に開発されました。放射性核種で標識された又はイメージング造影剤17が装填されたときに治療的適用における使用に加えて、リポソームは診断用途のために検討されています。近年では、セラノスティクスと治療・診断のペアは、画像誘導患者の層別化および薬物送達17,18の機会を提供するために追求されました。現在の研究は、MRガイド下でカスタム設計レーザーベースの暖房の設定を使用して、感熱リポソームから、トリガー薬物放出を評価するために、画像誘導薬物送達の概念に基づいています。 上記のように、水浴または加熱カテーテルは、一般的に皮下腫瘍を加熱するために使用されてきました。水浴の方法は、ホットワットで肢全体の浸漬を必要とします腫瘍部位での放出に加えて、四肢全体に非特異的な薬物放出をもたらすATER、。加熱カテーテルの使用は、腫瘍の中心で18 Gカテーテルの配置を必要とし、熱安定状態11に到達するため</sup...

ナノスケールシステムの強化された透過性および保持（EPR）で固形腫瘍の結果の病態生理。これは、全身性の副作用1を最小限にしながら 、腫瘍組織を標的とするために、この効果を利用する多くの薬物送達システムの開発につながりました。リポソーム送達技術が広く、薬物又はイメージングプローブ2ために研究されてきました。リポソームは大幅に従来の化学療法に比べて全身毒性が低下しているものの、臨床的有効性の3,4にいくつかの改良がなされています。研究は、限られた有効性は、キャリア4,5からの薬物放出の欠如によるものであることを示しています。結果として、外部刺激に応答して封入された薬剤を放出するように活性化されたリポソームの開発が注目を集めています。温熱療法は、癌患者6比較的安全な治療法として、何十年も使用されています。そこで開発外部トリガとして、熱で感熱性リポソームのメンターは、臨床翻訳のための大きな可能性を持つ論理的な組み合わせとなっています。実際、LTSL-DOXとして知られるドキソルビシンのリゾ脂質含有感熱リポソーム製剤は、現在臨床評価7に達しています 。 LTSL-DOXとの最近の臨床データは、熱の配信のためのプロトコルは重く患者の転帰8に影響を与えることができる重要な要因であることが示されています。ヒトでは、無線周波数、マイクロ波、レーザー、超音波トランスデューサは、腫瘍部位9で局所的温熱療法を適用するために使用されます。皮下腫瘍の加熱を必要とする前臨床試験では、加熱カテーテル10,11とウォーターバス12,13は、最も頻繁に使用されます。本稿では、我々は、腫瘍体積のよりコンフォーマルな加熱を可能にカスタム設計されたレーザーベースの暖房の設定を使用して、皮下腫瘍を加熱するための新しい方法を紹介します。 MR互換性のMAを使用してterials、セットアップは、レーザー加熱中に組織温度の変化のリアルタイムモニタリングを可能にすること、小動物MRイメージャの孔内に収まるほど小さいです。 MR造影剤、ガドテリドール（GD-HP-DO3A）は、Gdの-HTLCとして知らCDDP（HTLC）の感熱性リポソーム製剤にCDDPと同時カプセル化された、リアルタイムのためのMR熱のモニタリング及び評価を画像誘導 - 活性化薬物放出と加熱プロトコルの検証。我々の結果は、MRイメージングによって監視されながらレーザーベースの加熱装置を効率的のGd-HTLC製剤からカプセル化された物質の放出を活性化することを実証しています。

<table><tbody><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG</td><td>Laborota 4000</td><td></td></tr><tr><td>高圧押出機</td><td>Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>10 mlサーモバレル</td></tr><tr><td>加熱サーキュ</td><td>レーターVWRインターナショナルLLC。</td><td>11305</td>押出<td>機ポリ</td></tr><tr><td>カーボネート膜</td><td>フィルターWhatman</td><td>110605に接続されています。</td><td></td>110606</tr><tr><td>示差走査熱量計(DSC)</td><td>TA Instruments</td><td>Q100</td><td></td></tr><tr><td>誘導結合プラズマ原子発光分析装置(ICP-AES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 7300DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments Ltd.</td><td>Nano-ZS</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養器</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-5800</td><td></td></tr><tr><td>オートクリップ創傷クリップアプライヤー</td><td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>オートクリップ創傷クリップリムーバー</td><td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>創傷クリップ</td><td>ベクトン・ディッキンソン</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr><tr><td>763 nm レーザー装置</td><td>Biolitec</td><td>Ceralas CD 403 レーザー</td><td></td></tr><tr><td>レーザープローブ</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT400EMT</td><td>SMAとフラットクリーブコネクタ付き</td></tr><tr><td>Spectralon(イルミネーター)</td><td>株式会社ラブスフィア</td><td>FAST-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSTM-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td>7 テスラ プレリニア磁気共鳴 (MR) イメージング システム</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 70/30</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー温度センサー</td><td>LumaSense Technologies Inc.</td><td>Luxtron FOTラボキット</td><td></td></tr><tr><td>積分球ニュー</td><td>ポートコーポレーション</td><td>819C</td><td></td></tr><tr><td>光パワーメーター</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>1830-R</td><td></td></tr></tbody></table>

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

リポソームは、強化された透過性および全身毒性の有意な減少をもたらし保持（EPR）効果の利用を通じて固形腫瘍を標的とするために、薬物送達システムとして使用されてきました。それにもかかわらず、リポソームからの封入された薬物の不十分なリリースでは、その臨床的有効性が限定されています。温度感受性リポソームは、限定された腫瘍薬物のバイオアベイラビリティの問題を克服するために薬物の部位特異的放出を提供するように設計されています。私たちの研究室では、設計および固形腫瘍におけるCDDPのトリガされた放出を提供するために、HTLCとして知られるシスプラチンの熱活性化感熱リポソーム製剤（CDDP）を開発しました。 in vivoでの熱活性化送達は、MR温度測定（MRT）によって確認されるように、腫瘍部位でのコンフォーマル加熱パターンを提供する特注のレーザベースの加熱装置を用いて、マウスモデルにおいて達成されました。光ファイバ温度監視装置は、リアルタイムで温度を測定するために使用されましたレーザー出力を交互にすることによって、熱供給のオンライン調整を有する全加熱期間中。薬物送達は、加熱プロトコルを検証するために、腫瘍の蓄積を評価するための手段として、感熱性リポソームにCDDPと共にMR造影剤（ すなわち、ガドテリドール）の共カプセル化することにより、磁気共鳴（MR）画像ガイダンスの下で最適化しました。加熱プロトコルは、前のHTLCの投与20分の加熱後の注射5分の予熱期間からなりました。この加熱プロトコルは、非加熱腫瘍と筋肉と比較して、加熱された腫瘍で観察された最も高いMR信号変化にカプセル化された薬剤の有効放出をもたらしました。この研究は、前臨床感熱性リポソームの開発のためのレーザーベースの加熱装置と薬物送達の最適化のための加熱プロトコルのMR誘導検証の重要性の成功した適用を実証しました。

HTLCのリポソームは脂質膜形成、水和、押出成形および透析を含む一般的な方法を用いて製造されています。 CDDPは黒い堆積物の形成を介して非アクティブ化されるようにCDDPを含むステップの間に、注意は、任意のアルミ材にCDDPを公開しないように注意してください。 HTLCの図は、 図3に示されている。HTLCの物理化学的特性は、最近、 制御盤 16 のジャーナルに掲載された原稿にまとめました。 Gd-HTLC製剤のガドリニウムと白金濃度は、1.87±0.28 mg / mlで0.10±0.02 mg / mlで、それぞれ。 レーザーベースの加熱設定の照明器は、直径10mmの出口で、均一な配光（±15％）を提供する3つの小、接続チャンバーを使用しています。レーザーのパワー設定に応じて、電力が対策として、0.5〜1.7 W / cm 2の範囲内に送達されますDキャリブレーション積分球を用いました。結果は、腫瘍を通る断面として図4に示されて...

MRI互換カスタム設計レーザーベースの加熱装置は、具体的には、腫瘍領域で感熱性リポソームからの薬剤の放出を活性化するために、皮下腫瘍の局所加熱を提供するために開発されてきました。

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

この手順の全体的な目的は、熱活性化リポソーム製剤の送達のために皮下腫瘍を局所的に加熱するために使用できる、カスタムメイドのレーザー加熱装置の動作を実証することです。これは、まず脂質膜形成、水和押出、および透析を通じてHTLC製剤を調製することで達成されます。第二のステップでは、ドナーマウスに子宮頸がん細胞を接種します。4〜5週間後、腫瘍を摘出し、断片に切断して、受容マウスに個別に移植します。最終ステップとして、受容マウスの腫瘍をレーザー加熱システムを用いて局所的に42 °Cまで加熱します。このレーザー加熱装置はMR対応であるため、光照射中の組織温度の変化をモニタリングすることができ、また小型でポータブルであるため、小動物用MRのボア内で簡便かつ効果的に腫瘍を加熱することが可能です。最終的に、熱感受性HTLCの熱活性化放出は、リアルタイム磁気共鳴画像法（MRI）によってモニタリングすることが可能です。ウォーターバスや加熱カテーテルを使用する既存の手法に対する本手法の主な利点は、熱処理の開始から1〜2分以内に腫瘍へ適合的に熱を供給できる点、およびレーザー出力をリアルタイムで調整することで処置中の温度変動を最小限に抑えられる点にあります。我々は、HTLC熱感受性リポソーム製剤を用いたin vivo研究を開始した際に、初めてこの手法を考案しました。既存の手法では、皮下腫瘍の局所加熱を効率的に行うことができないことが分かりました。リポソームの調製手順については、私の研究室の博士課程学生であるmyungが実演します。リポソームを調製するには、まず調製したばかりの脂質混合物と調製したばかりの脂質薬剤混合物を混合し、脂質混合物の水和中に15～20分ごとにボルテックスを行いながら、1時間水和させます。200 nanometerのポリカーボネートフィルターを2層に重ねて10 milliliterエクストルーダーを組み立て、エクストルーダーのサーモバレルを70 °Cに設定した循環水槽に入れ、装置を圧縮窒素タンクに接続します。水和後すぐに、脂質をエクストルーダーチャンバーに移し、窒素気流を導入します。次に、200 PSIの圧力でリポソームをメンブレンに通して押し出し、70 °Cのウォーターバスに設置した50 mLコニカルチューブに回収します。リポソームを5回押し出した後、装置を分解し、100 nmポリカーボネートフィルターを2枚重ねて再組み立てします。圧力を400 PSIに設定し、先ほど実演した通りにリポソームを10回押し出します。最終的な押し出し後のリポソームを15 milliliterのコニカルチューブに回収して室温まで冷却し、その後、遠心分離によって不溶性のcisplatinを沈殿させます。次に、滅菌条件下で、分画分子量15,000の透析チューブを用い、0.9% salineに対して一晩透析を行います。子宮頸がん腫瘍ゼノグラフトを移植するため、90%コンフルエントな培養液から180個の細胞を回収し、ヘモサイトメーターを用いて生存している子宮頸がん細胞数をカウントします。サイトメーターを用いて細胞を1×10⁶ cells/100 µLに希釈する。すべての動物実験はStar Innovation Centerで実施した。メスのSCIDマウスの後肢腓腹筋に筋肉内注射により接種し、キャリパーを用いて、腫瘍の最大径が9〜12 mmに達するまで腫瘍サイズを測定した。その後、ドナーマウスから腫瘍を摘出し、2〜3 mm³の断片に細切した。次に、レシピエント動物の左後肢を剃毛し、露出した皮膚を切開します。ドナー腫瘍を1片、切開創から皮下に挿入し、植え込みの3～5日後に1～2個の皮膚クリップを用いて皮膚を閉じます。クリップを取り外し、熱処理を行うまで腫瘍を2～3週間成長させます。まず、レーザーファイバーの一端をレーザー装置に、もう一端をイルミネーターに接続します。次に、麻酔をかけたレシピエントマウスの尾側静脈に27ゲージの注入カテーテルを挿入し、続いて腫瘍の中心に22ゲージのカテーテルを挿入します。その後、温度変化をモニタリングするために中空カテーテルに光ファイバー温度プローブを挿入し、腫瘍全体をイルミネーターで覆います。以上で完了です。出力を0.8〜1 Wに設定し、レーザーを点灯させます。温度が上昇するまで待機し、治療中はレーザー出力を0.1〜0.8 Wの間で手動で調整して、腫瘍の温度を42 °Cに維持します。熱処理した腫瘍の断面図であるこの画像に示されているように、全出力を1 Wと想定すると、腫瘍内の任意の点における最大フルエンスレートは70 mW/cm²となり、皮膚深さにおける腫瘍内のフルエンスレートは最大フルエンスレートの50%であることが、プロトン共鳴周波数シフトを用いた磁気共鳴温度計測（MRT）加熱により確認されています。レーザーベースの加熱装置を使用すると、画像に示されるような比較的均一な温度分布マップが生成され、点光源による加熱前に取得した絶対ベースライン測定値からの相対的な温度変化を追跡します。磁気共鳴信号解析により、gad HTLCの投与後、加熱された腫瘍は未加熱の筋肉と比較して最も高い相対的信号増加を示し、加熱期間の終了までその信号が維持されます。この手法を習得し、適切に実施すれば、15分以内にセットアップすることが可能であり、温度感受性リポソーム製剤の前臨床評価のための有用なツールとなります。クラス4レーザーの使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は常に安全ゴーグルの着用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

頭蓋骨が露出した麻酔をかけられた人間の患者から始めます。患者は頭蓋内腫瘍と診断されます。露出した頭蓋骨にドリルで穴を開け、アクセスポイントを生成します。定位ガイダンスを使用して、レーザー拡散ファイバーまたはLDFを所定の経路に沿って挿入し、所定の位置に固定します。患者をMRIスキャナーに移し、LDFをレーザー光源に接続します。MRI画像を複数の角度からキャプチャして、ファイバーパスと腫瘍を視覚化します。これにより、LDF...

ヒト患者における頭蓋内腫瘍アブレーションのためのレーザー間質温熱療法

そこで我々は、強力な光熱療法剤機能、構造依存的な蛍光の自己消光及び光熱ユニークな特性を有するporphysomesと呼ばれる新規真性多官能ナノベシクルを開発した。我々は、高圧押し出しを使用してporphysomesを策定し、異種移植腫瘍モデルにおけるそれらの光熱治療の有効性を検討した。...

1分Porphysomesを使用してサブワンワット光熱腫瘍焼灼、真性多機能ナノベシクル

このプロトコルは、市販の材料で光応答性リポソームを統合し、金ナノ粒子のための簡単​​な製造方法を説明します。また、パルスレーザーの治療の際に合成されたリポソームのマイクロバブルキャビテーションプロセスを測定する方法を示しています。...

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。...

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

ここでは、自己集合体を介した酸化鉄ナノ粒子殻状マイクロバブル(NSM)の製造プロトコルであり、磁気高熱および光熱併用がん治療のための1つのナノ治療プラットフォームにおける磁気、音響、および光応答性を相乗化する。...

磁気温熱療法とポト温熱併用がん治療のための磁気、音響、光三重応答性マイクロバブル

このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。...

特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達

ここに提示されるのは、横紋筋肉腫マウスモデルにおいて温度感受性リポソームからの薬物放出を引き起こすために、磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波によって生成される制御された温熱療法を使用するプロトコルです。...

磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波生成温熱療法:マウス横紋筋肉腫モデルにおける実行可能な治療法

サーモプラズモニック穿刺法は、共焦点顕微鏡、光ピンセット、金ナノ粒子を統合して、細胞や巨大な単層小胞の原形質膜修復中のタンパク質応答を研究します。この技術により、迅速かつ局所的な膜穿刺が可能になり、複雑な原形質膜修復機構における重要なタンパク質とその機能的役割を同定することができます。...

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

膠芽腫は壊滅的な原発性脳腫瘍であり、レーザー間質温熱療法は、手術不能な膠芽腫に対する従来の外科的切除に代わる有望な治療法として浮上しています。このプロトコルは、治療効果またはアジュバントおよび組み合わせ治療の研究に使用できる最適化された前臨床マウスモデルについて説明しています。...

神経膠芽腫のレーザー間質性温熱療法のための免疫適格マウスモデル

このプロトコルは、固形腫瘍モデルにおける標的温熱療法に必要な技術と方法論を提示します。このアプローチは、腫瘍内に注入された金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換を利用して、腫瘍微小環境内で局所的な加熱を誘導します。...

腫瘍内金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換によるマウス腫瘍モデルにおける標的軽度温熱療法の誘導

学ぶレーザー加熱装置を用いた皮下腫瘍の局所加熱と感熱性リポソームからの薬剤放出の手法。MRIによるリアルタイム温度モニタリングが可能で、子宮頸がんモデルでの治療効果向上に貢献する。

磁気共鳴画像誘導による感熱リポソームからのシスプラチンのトリガリリースのためのカスタム設計されたレーザーベースの加熱装置

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