商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、
September 18th, 2015
マウスの仔の脳をカットするために、複数の角度を使用して、我々は主要な聴覚中脳と前脳構造のほとんどの間の接続をキャプチャ前述の急性脳スライスを改善。
この手順の全体的な目標は、下眼窩、聴覚視床、視床網核の聴覚部分、および聴覚皮質の 4 つの主要な聴覚構造を持つ Calot Thal 皮質スライスを準備することです。これは、最初にマウスから脳を取り除くことによって達成されます。2番目のステップは、スライスの準備として脳をブロックすることです。
次に、脳を切開して、Calotの皮質結合を含むスライスを取得します。最後のステップは、フラビンタンパク質イメージングを使用して接続性を評価することです。最終的に、頸動脈皮質接続部を含む脳スライスは、中脳および4脳の聴覚領域における情報処理をよりよく理解するための様々な実験に用いることができる。 これは、無傷の投影を取得するための鍵です。
この技術を実演するのは、私の研究室の大学院生であるBJスレーターで、スライス用の切断ステージを準備するために、脳のバックストップとして使用するために約1立方センチメートルの3%オーガーの小片をカットし、下コリキュラスを支えるためのバンプとして使用するために1.5センチメートル×1.5ミリメートル×3ミリメートルの別のピースをカットします。次に、バックストップをシアノアクリレート接着剤でステージに接着し、バックストップの右側にあるバンプを接着して、左上から右下まで90度の2本の線と17度の対角線でマークされたスライドに80度の角度を形成するように、2本の線の交差点に脳の背側を上にして配置します。かみそりの刃を使用して、脳の吻側端の2〜4ミリメートルを取り除き、平らな表面を作成します。
次に、新しく作成した平らな面にブレインコドル面を上にして置きます。脳の背側表面を水平線に合わせ、脳の正中線をスライドにマークされた垂直線に合わせます。次に、かみそりの刃を17度の線に合わせます。
かみそりを30度の角度で傾け、右皮質の約3ミリメートルを二重の斜めのカットで取り除き、脳をビブラートステージに取り付けます。脳の腹側に小さな濾紙を置き、長辺が正中線に対して垂直になるようにします。バックストップの前の領域とバンプの左側に少量のシアノアクリレート接着剤を慎重に塗布します。
続いて、斜めに切った二重の脳側を接着剤の上に置き、脳の甘えん坊部分と後脳が隆起に支えられ、脳の右側がバックストップに当たるようにします。この手順では、カッティングステージをビブラートにすばやく配置し、カッティングソリューションでステージを構築します。次に、ブレードを脳の上部に合わせます。
脳の上部から1〜1.5ミリメートルを取り除きます。次に、300〜500マイクロメートルのスライスをさらにスライスして削除し、さらに深く移動します。下丘、内側の食体、および外側のICT核がすべて見える場合、歯状回はC字型に現れ、構造は整列しているはずです。
600マイクロメートルのスライスを約2つ入手します。これらは頸動脈皮質スライスです。その後、摂氏32度の保持室に移します。
Flavoprotein Autofluorescence画像を取得するには、4ヘルツで105秒間画像を収集します。470〜490ナノメートルの青色光で組織を照らし、515ナノメートル以上でキャプチャし、画像が暗すぎたり白飛びしたりしないようにします。次に、電気刺激を使用して組織を活性化し、カルシウム画像を取得します。
10 ヘルツで 25 秒間画像を収集します。365ナノメートルの光で組織を照らし、510ナノメートル以上の蛍光を捕捉します。繰り返しになりますが、画像が暗すぎたり、白飛びしたりしないようにします。
次に、電気刺激を使用して細胞を活性化します。この画像は、Flavoprotein Autofluorescenceによる脳切片の頸動脈皮質接続の確認を示しています。0.05ヘルツで下矩腸に与える電気刺激を4ヘルツで画像化し、その刺激での力を示すために4ヘルツを処理しました。
周波数、視床、視床、網様体、核、および聴覚皮質がシナプス的に活性化されます。次に、接続されていないスライスを示します。活性化を伴う下結腸への電気刺激は、視床聴部でのみ見られました。
経路全体が捉えられなかったのは、切り傷の1つがわずかに平面から外れていたためと思われる。アラム皮質突起付き。この画像は、聴覚皮質の非定型的な活性化を示しています。
下眼皮質への電気刺激は、目に見える信号なしに聴覚皮質を活性化しました。視床では、視床はまだ活性化されていた可能性がありますが、画像表面にはありませんでした。このビデオを見れば、AAL視床皮質スライスの入手方法と、その接続性の評価方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、マウスの脳の主な聴覚構造に焦点を当てて、Calot Thal 皮質スライスを準備する方法を提示します。この技術は聴覚領域における接続性の理解を向上させます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 聴覚処理
- 脳スライシング技術
背景
- この研究はマウスの脳における聴覚処理を調査することを目的としています。
- 下丘、聴覚丘、視床網様核、聴覚皮質という4つの主要な聴覚構造に焦点を当てています。
- これらの接続を理解することは聴覚領域における情報処理の探求に不可欠です。
- この方法には脳構造を保存するための複雑なスライシング技術が含まれています。
研究の目的
- 聴覚接続の完全性を維持する脳スライスを準備すること。
- 聴覚情報処理の理解を向上させる実験を容易にすること。
- 脳スライスの準備における精密な切断技術の重要性を示すこと。
使用された方法
- スライスのためのマウス脳の除去。
- スライスの準備のために脳をブロッキングすること。
- スライスを得るために二重角度カットを行うこと。
- フラボプロテインイメージングを使用してスライス内の接続性を評価すること。
主要な結果
- この方法は主要な聴覚構造間の接続を成功裏に捉えました。
- フラボプロテインイメージングは聴覚経路の完全性を明らかにしました。
- 二重角度カットが投射を保存する効果を示しました。
- 将来の聴覚処理実験のための信頼できる技術を提供しました。
結論
- この研究は聴覚脳スライスを準備するための洗練された方法を提示します。
- 神経科学研究における精密な切断技術の重要性を強調しています。
- この発見は聴覚情報処理のより良い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
