一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム

この手順の全体的な目的は、多発性骨髄腫の原細胞における一連の化学療法剤に対する化学感受性を定量化することです。これはまず、新鮮な骨髄穿刺液から単離した多発性骨髄腫細胞を、あらかじめ培養した患者由来ストローマおよびコラーゲンと混合することで行われます。第2ステップでは、このCELミックスをマルチウェルプレートに播種します。

次に、細胞を目的の化学療法剤で処理し、プレートを電動ステージ顕微鏡のインキュベーターに移動させ、96時間の培養期間にわたって細胞の連続撮像を行います。最終的に、デジタル画像解析アルゴリズムを用いて、各薬剤および濃度ごとの生存率曲線を生成できます。既存のエンドポイント生存率アッセイと比較した本手法の主な利点は、単一の患者検体に対して複数の化学療法剤をテストできること、および、細胞をストロマやマトリックスから分離することなく、数日間にわたって患者細胞の生存率を縦断的に測定できることです。

この手法の意義は、特定の化学療法レジメンに対する臨床反応を理論的に予測できるため、造血器腫瘍の治療へと展開されます。もともとマイクロ流体スライドを使用していたものをマルチウェルプレートに置き換えることで、実験完了に要するコストと時間を大幅に削減できると考え、本プロトコルを考案しました。マルチチャンネルピペットを用いて原発性多発性骨髄腫細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の共培養を調製するには、まず細胞をRPMI 1640中で最終濃度の6倍の濃度で懸濁させることから始めます。

次に、各細胞種の50 µLを、調製したばかりのI型コラーゲンと混合し、最終容量を300 µLにします。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、細胞マトリックス混合液8 µLを384ウェルプレートの各ウェルの中央に手動で分注し、プレートを遠心分離して、すべての細胞を同一の焦点面に集中させます。

遠心後、ゲルを重合させるため、細胞培養条件下でプレートを1時間インキュベートします。次に、各ウェルに補完済み増殖培地を80 µL加え、ストローマがプレート底面に接着するようにプレートを一晩インキュベートします。ロボットピペッターを用いて多発性骨髄腫ストローマ共培養を準備するには、まず、先ほど示したように、CD 1 38陽性の多発性骨髄腫細胞300 µLとストローマ細胞300 µLを、最終希望密度の6倍のRPMI 1640培地に懸濁させます。

次に、CD 1 38 positiveとラベルを貼った1.5 milliliterチューブに両方の細胞型を混ぜ合わせ、チューブを細胞培養インキュベーターに入れます。続いて、適切な多発性骨髄腫細胞株60 microlitersと間質細胞60 microlitersを、最終希望密度の6倍のRPMI 1640培地で懸濁させ、これらをcell lineとラベルを貼った2本目の1.5 milliliterチューブに混ぜ合わせ、同様に37 degrees Celsiusでインキュベートします。ロボットピペッターに細胞播種用スクリプトファイルをロードします。

次に、200 µL ピペットチップボックスをステーションAに、マイクロタイタープレートをステーションBに、そして滅菌済みの 3 84ウェルプレートをロボットのステーションEに配置します。続いて、CD 1 38 陽性細胞混合液を、調製したばかりの CD 1 38 プレミックス培地が入ったチューブに混ぜ合わせ、得られた細胞懸濁液 1.5 mL をマイクロタイタープレートの1番ウェルに分注します。

残りの細胞を氷上に置き、プログラムを開始します。ロボットが384ウェルプレートの最初の176ウェルに播種し、一時停止します。この間に、残りのCD 1 38陽性細胞をマイクロタイタープレートの2番目のウェルに分注し、プログラムを再開してください。

ロボットはプレートの残りの144ウェルを認識し、再び一時停止します。ここで、細胞株チューブ内の細胞を、調製したばかりの細胞株プレミックスチューブと混合し、その内容物をマイクロタイタープレートの3番目のウェルに移します。その後、プログラムを再開し、ロボットに3枚の84ウェルプレートの残り64ウェルへの播種を行わせます。

最後のウェルへの播種が完了したら、細胞を遠心して回収し、コラーゲンの重合を行うために共培養プレートを細胞培養インキュベーターに移します。1時間後、メディアレイヤー用スクリプトをロボットにロードし、ステーションAに120 µLピペットチップボックスを、ステーションBに胎児牛血清、患者血漿、および抗生物質を添加したRPMI 1640培地 31 mLを入れた試薬リザーバーを、そしてステーションEにCED 3 84ウェルプレートを設置します。その後、プログラムを実行します。ロボットが各ウェルに添加済み培地 81 µLを分注します。

ロボットによる操作が完了したら、細胞をインキュベーターに戻し、ストロマが基質に overnight で接着するようにします。播種した細胞に目的の薬剤を処理するには、まずロボットピペッターのユーザーインターフェースで media layer drug plate スクリプトをロードします。次に、ステーションAに 120 µL ピペットチップボックスを、ステーションBに FPS 患者血漿および抗生物質を添加した 21 mL の RPMI 1640 が入ったリザーバーを、そしてステーションEに空の 3 84ウェルプレートを配置してプログラムを実行します。これにより、ロボットピペッターがすべてのウェルに 30 µL の培地を添加します。

3枚の84ウェルプレートを用意します。次にテンプレートに従い、コントロールウェルを含むマイクロタイタープレートの各ウェルに、最大濃度の20倍の薬液を200 µLずつ加えます。その後、FBS、患者血漿、および抗生物質を添加した培地を加えます。

次に、ステーションAに120 µLピペットチップボックスを、ステーションBに薬剤のマイクロタイタープレートを、ステーションCに培地を入れた3×84ウェルプレートを配置し、薬剤プレートプログラムをロードします。ロボットピペッターが、この図に示すように1対3の連続希釈を作成します。ここで、ステーションAに新しい120 µLピペットチップボックスを、ステーションBに希釈済み薬剤の3×84ウェルプレートを、ステーションCに細胞を播種した3×84ウェルプレートを配置し、薬剤添加プログラムを実行します。

ロボットピペッターを用いて、薬剤プレートの各ウェルから細胞プレートの対応するウェルへ、薬剤を8 µLずつ分注します。最後のウェルへの処置が完了したら、直ちに細胞プレートをデジタル顕微鏡のインキュベーターへ移します。次に、細胞のイメージングを行うため、ベンチトップインキュベーターの内部をエタノールウェットワイプで清掃し、プレートの蓋をインキュベーターの蓋に慎重に付け替えます。

次に、実験中に連続して撮影する関心領域のランドマークを追加するためのソフトウェアの手順に従ってください。最後に、5倍または10倍の対物レンズを使用し、多発性骨髄腫細胞が暗いリングに囲まれた明るいディスクとして現れ、ストローマ細胞がわずかに見えるまで細胞に焦点を合わせます。本実験では、生存している多発性骨髄腫細胞を緑色で擬似着色しましたが、最高薬物濃度で全ての多発性骨髄腫細胞が死滅した実験終了時には、ストローマ細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞に緑色のシグナルはほとんど、あるいは全く観察されませんでした。

次にロボットソフトウェアを使用して、さまざまな薬剤濃度にさらされたことによる生存率の緩やかな低下を追跡しました。イメージングプロセスを開始する前に、播種したすべてのウェルを注意深く観察することが重要です。アーティファクトが画像解析ソフトウェアを誤認させ、誤った結果を導く可能性があるためです。例えば、ここでは、間質細胞の密度が高すぎた場合、またはトリプシン処理から播種までの時間が長すぎた場合の結果を示しており、この画像に見られるように細胞の凝集が形成されています。

細胞株を高い密度で2回播種すると、複製に伴いコロニーが形成され、個々の細胞の判別が困難になるため、デジタル画像解析アルゴリズムの精度が低下します。ここでは、骨髄穿刺液から得られた多発性骨髄腫細胞数が500,000個未満の場合、播種された多発性骨髄腫細胞が少なすぎることになります。細胞を播種する前に、使用するチューブのデッドボリュームを決定し、希釈計算にこの容量を含める必要があります。この手法に習熟すれば、2〜3時間で実施することが可能です。

この手順を行う際は、細胞の準備が整う前に重合が起こるのを防ぐため、コラーゲンを含む混合済み培地を氷上で保持することが重要です。また、腫瘍負荷における化学療法感受性の不均一性が、患者の奏効率の深さと持続期間をどのように決定づけるかを探る際にも有用でした。