Name: 表面拡散と酵母染色体の免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶ 出芽酵母の染色体表面拡散と免疫染色法。細胞壁除去、浸透圧ショックによる細胞溶解、蛍光顕微鏡で染色体結合タンパク質を可視化する技術を習得できます。

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この作業は、NIHのDKBへの助成金GM50936によって支援されました。

注：以下のプロトコルのいくつかのステップは、クリーンドラフト内での作業が必要です。さらに、この方法は、スフェロプラストを監視するために10X長作動距離対物レンズを装備した酵母四分子解剖顕微鏡を必要とします。顕微鏡は、事前にフード内に設定する必要があります。範囲からマイクロマニピュレータアームとプレートホルダーを外し、作業エリアから離れ、安全な場所にこれらの項目を配置します。 スフェロプラストの調製<ol><li>所望の条件下で酵母を成長させます。 OD600 1.4 = 5×10 7細胞/ mlで各試料について、約2×10 8細胞、例えば培養の4ミリリットルを使用してください。試料の即時の処理がある場合には好ましいかもしれないが、ほとんどの用途のために、細胞のアリコートを、処理される前に、8時間まで氷上で保存することができます。 </li><li>細胞をペレットに3分間5（2345 RPM / 857.5 XG）の設定で臨床遠心分離機中で15mlの遠心管とスピンに細胞懸濁液を転送します。 </lI&gt; <li>ペレットから細胞を失わないように注意しながら培地をデカント。静かに1ミリリットルのZKバッファーで細胞を再懸濁した後、40μlの1 Mジチオスレイトール（DTT）を追加します。穏やかに混合しながら2分間インキュベートします。以前のように細胞をペレット化する（ステップ1.2を参照してください）​​。 </li><li> 1ミリリットルのZKバッファで再懸濁ペレット。完全に混合されたザイモリアーゼ100Tの新たに調製した溶液5μLを加えます。細胞壁を除去し、スフェロプラストを製造するために、30℃で20〜30分間インキュベートします。 </li><li>スフェロプラストは、完全であるかどうかを決定するために顕微鏡スライド上の細胞懸濁液の10μlの液滴をアッセイ。カバーガラスなしで解剖顕微鏡下で観察した細胞。細胞が肥大化し、ラウンドではなく、わずかに楕円形に表示されますと、水20μlを添加した後溶解する必要があります。細胞が溶解するために失敗した場合、水誘導される溶解が容易に観察されるまで10分毎に、30℃にサンプルを返し、再分析。以前のように細胞をペレット化する（ステップ1.2を参照してください）​​。 </li><li>静かに再懸濁し、細胞ペレットを洗浄Inは2.5ミリリットルの冷MES /ソルビトールバッファ。以前のように細胞をペレット化する（ステップ1.2を参照してください）​​。ゆっくり300-400μlの冷MES /ソルビトール緩衝液に細胞ペレットを再懸濁します。細胞を、数時間、この段階で氷の上に保持することができます。 </li></ol>拡散2.染色体注：染色体が拡散さのいずれかのスライドやされる際にガラス表面カバースリップは、必要があります事前に用意すること。各スライドまたはカバースリップを水に沈めなければならず、その後エタノールは、その後、乾燥させ、レンズペーパーで研磨。染色体がカバーガラスに分散されます場合は、カバースリップは、スコッチテープやゴムセメントでスライドに貼付する必要があります。特に言及しない限り、プロトコルの残りはスライドまたはカバースリップ上に広げる説明します<ol><li>きれいなスライドの表面上にP20ピペッター、ピペット細胞懸濁液の20μlのを使用。 </li><li> P200ピペッターを使用して、3％PFA /スクロース溶液40μlを添加し、穏やかにsolutioを混ぜますシュリーレン線が消えるまで手でスライドを「旋回」されることによりn。顕微鏡下でスライドを置き、細胞が焦点になっていることを確認します。 PFA溶液は、使用日のドラフト内で新たに準備する必要があります。 注：目的のタンパク質は、以前の方法により検査されていない場合、それは、タンパク質の保持は、固定条件に敏感であるかどうかを決定するために2及び4％PFAを含む溶液を用いて、追加のスライドを用意することが望ましいです。 4％PFA /スクロース溶液は、それが関連付けられたチューブリンの微小管を可視化することが望ましい場合に使用されます。高い固定剤濃度の欠点は、染色体が「underspread、「2％PFAであろうこともまた「underspread」染色体を生じる傾向があります。 </li><li> P200ピペッターを使用して、できるだけ完全に溶液を混合する前のように旋回、タイマーを開始、1％Lipsolの80μlを添加します。 Lipsolが使用できない場合は、80μlの1％NP40または80μlののdH 2 Oであってもよいです置換された（代表的な結果、図2を参照）。 </li><li>慎重に細胞を見て、ゆっくりと15秒毎のスライドを旋回。細胞の約80％が溶解したら、すぐに顕微鏡からスライドを削除し、タイマーを停止PFA /スクロース溶液80μlを添加し、渦が混合する（消えました）。溶解は、タイマーを起動した後30〜90秒から発生する必要があります。 注：いくつかのスライドがほぼ同時に溶解を示した場合は、1は、最終的には、スライドの残りの微細なモニタリングを省略し、単に慎重lipsolと固定剤の最終アリコートの添加の添加の間の期間を時間を計ることができます。同じサンプルから複数のスライドを調製する場合しかし、この短いカットが唯一の信頼性があります。それは別のスライドを異なる時間に、または異なる培養物から採取した試料から調製されたときに、顕微鏡で各サンプルの溶解を監視するのが最善です。 </li><li>きれいな平らな面にスライドを置き、全体unfrosted surfac全体に液体を広げます「水たまり」のメニスカスの下にはなく、スライド自体の表面上に保持清潔、使い捨て牧草ピペットの側面を使用して、スライドの電子、 すなわち 。ピペットでスライドの表面を「熊手」はありません。サンプルの汚染を避けるために別のスライドにピペットを再使用しないでください。 </li><li>ドラフト内で一晩乾燥さスライドにしておきます。不溶性の核成分は、スライド表面上に定着し、それに結合します。大規模な実験のために、乾燥工程のためのスペースの使用を計画することが重要です。 </li><li>乾燥した後、最適な結果は、同じ日に免疫染色段階に進行することによって得られます。しかし、乾燥したスクロース溶液は、サンプルの凍結を可能にする「蜂蜜」のスプレッド染色体を埋め込む：スライド、プラスチックスライドボックスに移し、年間-20℃で保存することができます。 </li></ol> 3.免疫染色<ol><li>ディップは、30秒間0.2％のフォトフローにスライドします。蜂蜜を除去しました。上リーンスライドエッジは、エッジはペーパータオルで休んで、残留フォトフローを除去しました。 </li><li> 5分間の1×TBSでディップスライドを洗浄します。エッジでスライドを傾斜さ、過剰な液体を除去するが、それらが乾燥させてください。 </li><li>スライドのunfrosted部分全体のスライド上にスライドつや消し面を上にし、ピペット300μlのTBS / BSAを置きます。 </li><li> 15分間、室温で湿ったチャンバー内でインキュベートします。 （飽和ペーパータオルで有孔金属板やプラスチックスライドボックスの下に水飽和ペーパータオルを敷いた大きなプラスチック容器）。 </li><li>ペーパータオル上でスライドの短辺休止して（例えば、試験管ラックなど）適切なサポートに対するスライドを傾斜さスライドを排出します。表面が乾燥しないようにしてください。 </li><li>すぐに一次抗体の適切な希釈を含むTBS / BSA緩衝液80μlのを適用します。抗体が制限されている場合は、40μlの22×22ミリメートルのカバーガラスを使用しています。粗製ウサギ血清の場合、これは、典型的には1/50および1/500希釈の間です。 注意：新しい抗体調製のための滴定を行います。バックグラウンド以上の高い信号を生成する最も希薄準備が選択されています。前免疫血清で染色されるべきバックグラウンド染色のレベルを制御するために、核は適切な欠失変異株および/または重複したスライドから準備する必要があります。 </li><li>バブルを回避スライド上の洗練された22×50mmのカバースリップを置きます。一方の短辺に近い位置での長い縁に沿って親指と人差し指の間にカバーガラスを保持することによってこれを行います。それだけで「水たまり」スライドのつや消しの領域に最も近いのエッジの内側にスライド上に載るまでスライドする30度の角度でカバーガラスを保持し、指の短辺最も遠いが低下します。そして、ゆっくりとスライドタッチベンチを保持する指まで滑らかな動きでカバースリップを下げ、その後、離します。それは着地後にカバーガラスの位置を調整しようとしないでください。 注：染色体スプレッドは上に調製した場合（スライドの表面上に直接ではなく）固定されたカバーガラス、このサンプルカバースリップを染色し、洗浄工程全体にスライドに固定されたままになります。追加のカバーガラスを均一に染色した後、廃棄の際に抗体溶液を分配するために、サンプルカバースリップの上に配置されます。 </li><li>密封された湿ったチャンバー内の場所スライド、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>つや消しのエッジを保持することは、スライドガラスの染色ラックにスライドを転送し、TBSを含む染色ジャーに水没します。 </li><li>静かにカバースリップを削除するには、上下にスライドを浸します。これを行うにはあまりにも多くの力を使用しないようにしてください。 TBSに浸漬することによって、スライド2×10分間洗浄します。ラックからスライドを取り外し、ペーパータオルに端をタッチすることで、過剰な液体を排出します。表面を乾燥させないでください。 </li><li>直ちに蛍光色素結合二次抗体（または22×22ミリメートルのカバーガラス40μL）の1 /千倍希釈を含む80μlのTBS / BSAを追加し、落ち着いた光の下での作業。広告以前とDのカバースリップと暗闇の中で湿ったチャンバー内で2時間4℃でインキュベートします。 </li><li> 、以前のようにカバースリップを削除するスライドを排出し、暗所で1〜2時間空気乾燥さ表面を可能にします。以前のようにペーパータオル上リーンスライドします。 注：拡散がマウントカバースリップ上で実行された場合は、乾燥前のスライドからカバースリップを切り離します。前のステップでのスライドで説明したようにカバーガラスを乾燥されます。 </li><li>抑えた光の下での作業、DAPI（310μlの滴）を含む培地を搭載する約30μlを添加した後、慎重にカバースリップを下げます。スプレッドがカバーガラス上にある場合、スライド上に、下に清潔なスライド上に封入剤の液滴を配置し、カバーガラスを下げ、染色体側。 </li><li>まだ落ち着いた光の下では、明確なマニキュアでカバースリップの端を解決し、密封するためにカバースリップのために2分を待ちます。フラットスライドボックス内にスライドを配置します。 注：STED顕微鏡の場合は、延長ゴールドでマウントします。延長金の30μLを使用DAPIのない、一晩硬化させます。マニキュアで封止することは不要です。 </li><li> DAPIが集中するために、適切なフィルターセットを用いて、40または100倍を目的とした広視野落射蛍光顕微鏡による表示スライド。必要に応じて数週間、4℃で暗所でスライドを保存します。凍結しないでください。 </li></ol>

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<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

拡散核の出現は、固定と溶解/界面活性剤処理のバランスに大きく依存します。 上で説明したように、さまざまな細胞構造を保存するには、異なるPFA濃度を使用する必要があります。ほとんどのタンパク質では、3%PFAが最適です。ただし、スピンドルの保存には 4% PFA の使用が必要です。 試薬を1セット使用した場合でも、固定に対する溶解のタイミングも拡散核の品質に影響を与える可能性があります。 最も一貫した結果を得るには、光学顕微鏡で溶解を直接観察することにより、各スフェロプラストサンプルの溶解時間を正規化する必要があります。 訓練された目には、丸い球状体は溶解前に膨らむにつれて暗くなります。溶解後、細胞の残骸は浮遊する「幽霊」として現れます。 実験的に最適化された試薬濃度とタイミングのサンプル間標準化の組み合わせにより、一貫して十分に広がった核が得られます。 
拡散染色体を視覚化するために使用される蛍光色素と顕微鏡の選択は、目的の構造によって異なります。 一般に、広がった核は非常に薄く(約200nm以下)、可溶性タンパク質は手順によって除去されます。 したがって、共焦点または全反射蛍光(...

出芽酵母サッカロマイセス·セレビシエは、染色体の機能を制御するタンパク質の研究を含む、生物学的過程の分子機構の研究のために多くの利点を提供しています。 、遺伝的分子、および生化学的研究のために、出芽酵母のよく知られている利点があるが、細胞の核内のタンパク質の分布の細胞学的研究は、その小さなサイズによって複雑になります。典型的な酵母核は、可視光の約5倍の解像度の限界である1ミクロン未満の直径を有します。したがって、従来の免疫染色から、または緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質タグを使用することによって得ることができる核タンパク質の分布に関する情報の量が限られています。タンパク質の核内分布を特徴付けるに有用なアプローチは、拡散染色体面です。このアプローチは、細胞壁を除去し、細胞膜および核膜を破壊し、Aを含みますllowing核の不溶性内容は顕微鏡スライドの表面に安定します。これらの不溶性成分は、核マトリックスと染色体が含まれます。クロマチン結合タンパク質を検出する能力を高め、可溶性核内容物の除去を可能にすることに加えて、そのような拡散核が約3〜5μmの直径を有すること（二倍体減数分裂核のための）染色体の実質的な減圧でメソッド結果を拡散染色体と二倍体分裂核のために2〜3ミクロン。この減圧は無傷の核に解決することが比較的困難または不可能である核部分構造の検出を可能にします。 染色体拡散に明らかな欠点は、拡散手順が部分的にまたは完全に目的の構造を破壊する可能性です。特に懸念されるのは、特定の染色体に結合したタンパク質は、拡散処理の結果として失われる可能性があるということです。この潜在的な合併症の寿データを解釈する際にLDが念頭に置いておきます。拡散手順に敏感なタンパク質の一例は、β-チューブリンです。いくつかの条件の下では、主にチューブリンから構成されているスピンドルは、3を広げる時に保存されています。スピンドルの可視化は、多くの場合、目的の核をステージに便利です。しかし、チューブリンを可視化することは、高濃度の固定剤を用いた治療を必要とします。スピンドルは、以下に記載される標準的な条件の下で失われます。この例では、以前に特徴付けられていないタンパク質の分布を分析する場合、それは、タンパク質は、そのような変化に敏感であるかを決定するために、固定剤の濃度を変化させることが重要であることを示しています。染色体構造上の拡散条件の影響に関する懸念にもかかわらず、拡散方式の有用性とパワーは、多くの状況で実証されており、有糸分裂と、特に減数分裂のセル4-7の特性に広い有用性を有します。 TWO拡散方法が広く使用されてきました。ドレッサーとジルー8によって開発されたこれらの方法の第一は、洗剤の使用を回避し、DNA特異的色素DAPIについて染色したときに、比較的よく保存された染色体の形態を有するように見えるスプレッドの準備を得ることができます。しかし、この方法は、完全に比較的困難であり、スライドの一方の領域を他の領域と比較されたときにスプレッド核の品質が、劇的に変化します。この問題は、データ収集の偏りを回避するために、1つのスライドから多くの選択されていない核画像化伴う定量的アプローチを複雑にすることができます。 Loidlとクライン1によって開発された方法を、2次拡散染色体は、洗剤溶液によって促進溶解およびクロマチン解凍して、パラホルムアルデヒドによる固定をバランスすることを含みます。適切に実行すると、この方法は、ドレッサーとジルーの方法に比べて少ない地域への領域の変動と非常に再現性のある結果が得られます。このプレゼンテーションでは、modifieに焦点を当てて理由は、その信頼性とシンプルさのLoidlとクラインの方法、のDバージョン。 拡散染色体は複雑で時間のかかるではありません。最大100のスライドを一日で免疫染色のために調製することができます。また、スプレッド製剤は、免疫染色の前に年間の冷凍庫に保存することができ、したがって、ラボでは新たな生物学的疑問が生じたり、新しい染色試薬が利用可能になったときに使用することができる冷凍染色体スプレッドのリポジトリを開発することができます。 染色体拡散方法は、最も一般的に免疫染色し、広視野蛍光顕微鏡法と組み合わせて使用​​されるが、それは、誘導放出の枯渇（STED）顕微鏡法などの超解像光学顕微鏡法のためにスライドを調製することも可能です。

<table><tbody><tr><td>ジモリアーゼ</td><td>US Biological&nbsp;</td><td>Z1004</td> 2<td>%グルコースを添加した50 mM Tris pH 7.5に20 mg/mL溶液を調製します。新鮮な各実験を準備し、4°Cで保管します。使用する準備ができるまでC。</td></tr><tr><td>リップソル&nbsp;</td><td>L.I.P.株式会社&nbsp;</td><td>もはや市販されていません</td><td>水に1%(v / v)溶液を調製します。氷の上に保存します。</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>水に1%(v / v)溶液を準備します。氷の上に保存します。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>コーニング</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>標準カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td>12-544-E または 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>高解像度カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 ソリューション</td><td>コダック</td><td>P-7417</td><td>水中で 0.2% (v/v) 溶液を調製します。&nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>TBSに1%(w/v)溶液を調製します。4°Cで保存します。Cは最長1ヶ月間。</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックスライドボックス</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>乾燥スプレッドを含むスライドは、-20°Cのスロットに保管します。また、ウェットチャンバーとしてもご使用ください。</td></tr><tr><td>段ボール製スライドボックス</td><td>フィッシャー</td><td>12-587-10</td><td>染色/密封されたスライドを便利に輸送したり、4°Cで保管したりするために使用します。</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>スライドの洗面台として使用します。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

表面拡散と酵母染色体の免疫染色

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

>jove_content<出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの核のサイズが小さいため、クロマチン結合タンパク質の核内分布を分析するための光学顕微鏡の有用性が制限されます。酵母核の表面拡散は、結合タンパク質を失うことなくクロマチンの増殖をもたらします。DNA結合タンパク質の固定と界面活性剤処理のバランスをとった表面拡散法です。示された方法は、Josef LoidlとFranz Kleinによって記述された方法からわずかに修正されています1,2。この方法は、有糸分裂細胞周期のさまざまな段階で多くのクロマチン結合タンパク質の局在を特徴付けるために使用されてきましたが、減数分裂レコンビノソームやシナプトネマ複合体などの減数分裂染色体構造の研究に特に有用です。また、独自の洗剤であるLipsolを使用する必要のない変更についても説明します。これは、元の手順で求められていたが、もはや市販されていません。染色体拡散法と適合する免疫染色プロトコルも記載されている。

スプレッド核の出現は、批判的に染色体固定およびデコンパクションとの間のバランスに依存します。試薬が適切にバランスしている場合であっても、染色体の脱圧縮の程度の変化および/または別のスライド間の同じスライドの異なる領域で起こり得ます。画像が解釈される前にこのように、スライドの所定の領域に広がるの品質が評価されるべきです。 「overspreading &quot;と&quot; underspreading」の効果は、減数分裂期組換えタンパク質に対する抗体を用いて説明することができます。 図1では、減数分裂核はDAPIを用いたDNAについて染色2真核生物の鎖交換タンパク質のRad51とDMC1とカウンタについて免疫染色の二重です。最適に広がる核の2つの例は、 図1Aに示されている。 図1Bは、underspread核二包む核の図1Cの実施例の一例を示しています。注意Rad51のとDMC1の少ない病巣が正しく核を拡散するために比較を超えるとunder...

出芽酵母から染色体の表面拡散方法が提示されています。この方法は、Loidl と Klein によって以前に記述された方法から派生しています。さらに、スプレッド染色体の免疫染色の手順を実演します。

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて染色体に結合したタンパク質を可視化することです。これは、まず酵素処理によって細胞壁を除去することで達成されます。ここでは、oliseを用います。第2ステップでは、通常は界面活性剤を用いて浸透圧ショックにより細胞を溶解させ、核膜を露出させます。これは、タンパク質構造を維持するために低濃度の固定液が存在する状態で行われます。細胞の溶解後、タンパク質構造をさらに安定させるために固定液の濃度を高めます。次に、溶解した細胞を顕微鏡スライドに滴下し、核をスライド表面に沈降させます。最終ステップは、サンプルの免疫染色です。ここで実演する間接免疫染色法では、目的のタンパク質に結合する一次抗体と、その一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体を使用します。最終的に、染色体結合タンパク質の分布を調べるために免疫蛍光顕微鏡法が用いられます。これらの代表的な画像は、組み換えタンパク質であるDMC1およびRAD51を免疫染色した、展伸された有糸分裂核のものです。Mike DresserおよびCraig Deruによって導入された他の一般的な手法と比較した本手法の主な利点は、スライド表面の大部分に最適に展伸された核が存在するため、1枚のスライドから多数の展伸核の画像を容易に取得できることです。この手法は、2つのタンパク質が共局在しているか、あるいは特定の核内部分構造の形成が目的の遺伝子の機能に依存しているかなど、核内構造の研究における重要な疑問への回答に役立ちます。なお、この手法は元々Franz KleinとYosef Loleによって開発されたものであることを強調しておきます。このビデオが、我々が改良したこの技術を習得される方々の助けとなることを願っています。目的の条件下で培養した酵母細胞からスプラットを作成します。各サンプルに約2×10⁸個の細胞を使用してください。細胞懸濁液を15 mL遠心チューブに移します。臨床用遠心分離機を用いて、設定5で3分間チューブを遠心分離し、細胞をペレット化します。ペレットの細胞を紛失しないように注意しながら、培地をデカンテーションで除きます。細胞を1 mLのZK bufferで穏やかに再懸濁し、次に1 M dihiを40 µL加えます。室温で2分間、緩やかに混合しながらインキュベートします。前と同様に細胞をペレット化し、再懸濁します。各ペレットを1 mLのZKバッファーに懸濁します。十分に混合した、調製直後のzy liase 100 T溶液を5 µL添加します。30 °Cで20〜30分間インキュベートし、細胞壁を除去してスフェロプラストを生成させます。細胞懸濁液10 µLを顕微鏡下で観察し、スフェロプラスト化が完了しているか確認してください。細胞壁除去前、酵母細胞はわずかに長楕円形に見えます。スフェロプラスト細胞は、膨らんで丸い形状になるはずです。水の添加後、スフェロプラスト細胞は緩やかに再懸濁されるはずです。細胞ペレットを2.5 millilitersの冷MESオービタルバッファーで洗浄します。ペレット化した後、細胞ペレットを300 to 400 microlitersの冷MESオービタルバッファーで再び緩やかに再懸濁します。この段階の細胞は、氷上で数時間保持することが可能です。本手順では、10倍の長作動距離対物レンズを備え、ドラフトチャンバー内に設置された酵母用テトラ解剖顕微鏡が必要です。なお、マイクロダイセクション針は取り除いておいてください。染色体を広げるためのガラス面も事前に準備しておく必要があります。P 20ピペッターを使用して、細胞懸濁液 20 µLを清潔なスライドガラスの表面に分注します。次にP 200ピペッターを用いて、調製したばかりの3%パラホルムアルデヒドおよび3.4%スクロース溶液 40 µLを加え、シュリーレン線が消えるまでスライドガラスを手で円を描くように動かし、溶液を緩やかに混ぜ合わせます。スライドガラスを顕微鏡下に置き、細胞にピントが合っていることを確認します。P 200ピペッターを用いて、1% Lip Salを80 µL加え、前回と同様に溶液が十分に混ざるまで撹拌し、タイマーを開始します。Lip Salが入手できない場合は、同量の1% MP 40または蒸留水で代用可能です。その際、細胞の状態を注意深く観察しながら、15秒ごとにスライドをゆっくりと撹拌してください。このビデオクリップは、細胞の約 80 〜 90% が溶出した際に観察されるべき状態を示しています。タイマーを止め、直ちに顕微鏡からスライドを取り出してください。溶出は 30 〜 90 秒の間で起こるはずです。タイマーを始動させた後、パラホルムアルデヒド・スクロース溶液を 80 µL 加え、軽く回して混ぜ合わせます。スライドガラスを清潔で平らな面に置きます。清潔な使い捨てパステールピペットの側面を使用し、液滴の液面より下かつスライドガラスの表面より上の位置で保持しながら、液をスライドガラスの非フロスト面全体に広げます。ピペットでスライドの表面をこすらないでください。サンプルの汚染を防ぐため、スライドごとに新しいピペットを使用してください。スライドをフード内で一晩乾燥させます。これにより、染色体を含む不溶性の核成分がスライド表面に沈殿し、乾燥後に固定されます。同日に免疫染色の工程に進むことで、最適な結果が得られます。スライドを0.2% Photo flowに30秒間浸します。乾燥したスクロース溶液を除去するため、スライドを傾けて端をペーパータオルの上に置き、残ったphoto flowを拭き取ります。スライドをXTBSに5分間浸して洗浄します。スライドを端に立てて余分な液体を取り除きますが、乾燥させないように注意してください。次に、スライドのフロステッド面を上に向け、フロステッド面以外の部分にT-B-S-B-S-Aを300 microlitersずつピペットで滴下します。スライドを湿室に入れ、室温で15分間インキュベートします。15分後、各スライドの短辺をペーパータオルの上に置き、試験管ラックなどの適切な支持台に立てかけることで、液を切り落とします。表面がすぐに乾燥しないように注意してください。粗ラビット血清用に適切に希釈した一次抗体を含むT-B-S-B-S-Aバッファーを80 µL添加します。希釈倍率は通常、1:50から1:500の間です。気泡が入らないように注意しながら、研磨済み22 × 50 mmのカバースリップをスライドガラスの上に載せます。カバーガラスの長辺の一端（短辺に近い位置）を親指と人差し指で保持します。スライドガラスに対してカバーガラスを30度の角度に保ちながら、指から遠い側の短辺をゆっくりと下げ、スライドガラスの曇りガラス領域に最も近い液滴の端のすぐ内側に接地させます。カバーガラスをゆっくりと滑らかな動作で下げ、指がスライドガラスに触れたところで離します。カバーガラスが接地した後は、位置を調整しないでください。スライドを密閉された湿室に入れ、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、スライドの曇りガラス端を持って、TBSを含む染色瓶にそれぞれ浸します。浸漬させたスライドをゆっくりと上下に動かし、カバーガラスを取り除きます。この際、過度な力を加えないように注意してください。TBSに10分間ずつ2回浸漬させ、スライドを洗浄します。1回目の洗浄後、バッファーを交換します。スライドをラックから取り出し、エッジをペーパータオルに触れさせて余分な液体を除去します。表面をすぐに乾燥させないでください。各スライドに、1/1000に希釈した蛍光標識二次抗体を含むT-B-S-B-S-Aを80 µLずつ加えます。前述と同様にカバーガラスを載せ、湿潤箱の中で4 °C、暗所で2時間インキュベートします。2時間後、カバーガラスを取り除き、前述と同様に洗浄し、スライドの液を切ります。ペーパータオルに乗せて水気を切ります。弱光下で、暗所で1〜2時間、表面を自然乾燥させます。その後、dbiを含む封入剤30 µLを滴下し、ゆっくりとカバーガラスを被せます。カバーガラスが馴染むまで、減光させた状態でさらに2分間待機し、その後、カバーガラスの縁を透明なマニキュアで封印します。スライドを平らなスライドボックスに入れます。スライドは、観察準備が整うまで4 °Cの暗所で保存することが可能です。凍結させないでください。このステップで示すスライドは、2つの真核生物ストランド交換タンパク質RAD 51およびDMC1に対する二重免疫染色およびDAPIによるDNA対比染色を施した、最適に展展された減数分裂核の2つの例です。二倍体細胞において最適に展展された減数分裂核の直径は約5 µmです。展展不足の核では、RAD 51とDMC1のフォーカスが少なくしか分解能が得られず、サンプルが十分に平坦ではないため、すべての構造を単一の焦点面で観察することはできません。一方、展展しすぎた核では、構造が崩れます。固定が不十分であるか、あるいは界面活性剤が過剰であるため、RAD 51およびDMC1のフォーカスが少なくなっています。また、現在は市販されていないlip salをMP 40で代用した処理実験も行われ、RAD 51およびシナプトネマ複合体の中央領域の構成成分であるSYCP1の分裂期核染色で示されるように、十分な結果が得られました。lip salを蒸留水に置き換えた場合も、同様に良好な結果が得られました。いずれの場合においても、細胞がleptin NEAからPAAへと移行する際に起こる染色体の凝縮は、大部分が維持されていました。この展展法は、超解像顕微鏡法のような手法への適用に適しています。このSynap Neal Complexの画像において、Paki INE核はzip 1およびred 1を保持していました。刺激放出枯渇（STED）顕微鏡で観察したSynaptonemal Complexの構成要素。ここで緑色で示されているZip1抗体は、平行な線状の染色パターンからわかるように、側方要素の付近に結合している。側方要素の間隔は約100 nanometersであり、従来の顕微鏡では分解能が不足しているため識別できない。習得すれば、塗布および塗展技法はサンプル数に応じて2〜4時間で完了でき、練習次第でこの方法により最大100枚のスライドを調製することが可能です。各サンプルにつき、1枚以上の重複スライドを調製することをお勧めします。重複分は、一晩の乾燥ステップの後、-20°Cで保存して後で使用することができます。この方法で保存すれば、通常、スライドは数年間保存可能です。

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