上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル

本手順の全体的な目的は、M tuberculosis感染の研究に向けたin vitro肺組織モデルを構築することです。まず、細胞培養プレートインサートのフィルター上に線維芽細胞コラーゲンマトリックスを層状に形成します。次に、感染させた免疫細胞および肺上皮細胞を、この線維芽細胞コラーゲン層の上に播種します。

得られた3D組織モデルを気空にさらすことで、粘液分泌と上皮の層形成を促進させます。最終ステップとして、組織を回収し、スライドに固定します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、M tuberculosisによって誘導された初期肉芽腫の形成を解析します。

この手法の主な利点は、in vitroの細胞単層などの既存の方法とは異なり、このシステム内の細胞が3D微小環境に存在するため、病原性マイコバクテリウムに感染した際にヒトの結核に類似した肉芽腫が形成されることです。コラーゲン埋入線維芽細胞を調製するには、まず肺線維芽細胞を37 °Cで10分間トリプシン処理します。細胞が剥離したら、8 mLの完全DMEMで反応を停止させ、細胞を遠心分離します。ペレットを新鮮なDMEMを用いて230,000 cells/mLに再懸濁し、細胞を氷上に置きます。次に、6ウェルプレートの各ウェルにインサートを1つずつ入れます。

ウェルプレートを用意し、新鮮に調製した細胞層混合液を各インサートに1 mLずつ分注し、気泡が入らないように混合液がインサート全体を覆っていることを確認します。次に、プレートを37 °Cのインキュベーターで30分間静置します。インキュベーション終了後、インサート1個あたりのコラーゲンのpHを中和させるため、氷上の滅菌コニカルチューブ内でコラーゲン2 mLとプレミックス615 µLを混合します。

次に、コラーゲン混合液に完全dmem 58 µLと肺線維芽細胞 327 µLをインサートあたり加えます。ピペッティングを行い、細胞を混合液全体に均一に分散させます。その後、細胞層 3 mLを各インサートの壁面に沿って、非細胞性コラーゲン層の上に速やかに加えます。

気泡が入らないように注意しながら、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、さらに2時間静置します。コラーゲンの重合後、各ウェルの底に完全dmemを2 mLずつ加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、清潔なピンセットを使用してインサートを一つずつ慎重に持ち上げ、それぞれの底から培養液を吸引します。

次に、各ウェルの底に2 mLの完全DMMを、各インサートに2 mLの完全DMMを加えます。培地の両方の容量を2日ごとに、5〜7日間交換します。感染マクロファージを調製するには、まずマクロファージ培養液に、感染多重度（MOI）10で強毒性M tuberculosisを加え、4時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、細胞をPBSで3回洗浄して細胞外の細菌を除去し、マクロファージを2 mMのDTAで37 °Cで10分間処理します。細胞が剥離したら、抗生物質を含まない完全DMMに再懸濁します。次に、線維芽細胞コラーゲンマトリックスプレートから培地をすべて吸引し、外側チャンバーに新鮮な抗生物質を含まない完全DMMを1.5 mL加えます。

次に、蛍光標識した単球と感染マクロファージを5:1の比率で、インサート1個あたり50 µLの抗生物質を含まない完全DMEM中で混合します。その後、単球とマクロファージの混合液50 µLを各インサートの内側に加え、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、細胞が剥がれるのを避けるため、インサートの壁面に沿って培養液2 mLをゆっくりと加え、さらに24時間培養します。

肺上皮細胞を播種するには、免疫細胞線維芽細胞コラーゲンマトリックスの上に、完全dmm 50 µLで調製した1 mLあたり4 million個の上皮細胞を添加します。細胞を室温で2分間インキュベートした後、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、先ほど示したように、抗生物質を含まない完全DMM 2 mLをインサートに緩やかに加え、さらに3日間細胞を培養します。

感染させたマクロファージを播種してから5日後、プレートからすべての培地を吸引し、外側チャンバーに抗生物質を含まない完全DMMを1.8 milliliters添加します。その後、播種後7日目にインサートに培地を添加せず、インキュベーター内で3D組織モデルを2日間空気に曝露させます。

プレートから培地を完全に除去し、組織モデルを4%パラアルデヒドで室温・暗所にて30分間混合します。次に、メスを用いて、ウェルインサートからメンブレンを分離させます。続いて、清潔なメスを使用し、組織モデルの端を慎重に取り除き、各組織をほぼ等しい大きさの正方形に4等分します。

組織片をスーパーフロストガラススライドに載せ、5分間乾燥させます。次に、抗退色剤およびDAPIを含む蛍光封入剤を用いて組織を封入し、カバーガラスで覆います。スライドを室温の暗所で乾燥するまで放置し、その後、カバーガラスの縁をマニキュアで封止します。

ラッカーが乾燥したら、BSL3施設から搬出するため、スライドを70% ethanolに浸漬させます。組織を可視化するため、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、細胞クラスターの3D定量化に向け、組織全体をカバーするように5〜10箇所の異なる領域から、解像度512 × 512で3D画像を取得します。この際、Z-stackの厚みを最低20 micronとし、スタック間の間隔を1〜1.5 micronに設定してください。3D画像処理ソフトウェアを開き、目的の画像を読み込みます。

次に、ディスプレイ調整ツールを使用して、各チャネルの画像、コントラスト、明るさ、およびブレンド不透明度を調整し、ボリュームレンダリングを最適化してノイズ干渉を最小限に抑えます。続いて、組織表面を可視化するために、赤色単球チャネルを選択し、フィルターを用いて適切な閾値を設定することで、赤色単球の選択範囲を制限するか、必要に応じて背景を除外します。最後に、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートし、以降の下流解析に使用します。

M tuberculosis感染細胞を播種して7日後、共焦点顕微鏡観察により、緑色の細菌の存在で示される感染部位に赤色の単球が集積していることが分かります。これは、ヒトの結核に見られる肉芽腫として知られる病変を模した3D構造です。可視化することで、いくつかの特徴について相互作用、検証、および定量化を行う柔軟性が得られます。例えば、これらの画像における3D画像では、M tuberculosisの感染部位における単球のクラスターが描出されています。

緑色の細菌と赤色の単球クラスターの空間的配置は、頂点方向、回転方向、および側面方向から観察することができます。予想通り、これらのクラスターは非感染組織では観察されませんでした。単球、細胞クラスター、および M tuberculosis 感染組織のサイズと数の定量化により、非感染組織モデルと比較して、細胞クラスターのサイズが増大し、一方で個々の単球の数は減少していることが明らかになりました。

この肺組織モデルの潜在的な利用用途としては、結核における異なる免疫細胞の役割や組織免疫の研究、マイコバクテリアの表現型の研究、および肉芽腫内のマイコバクテリアを殺傷する薬剤候補の試験などが挙げられます。