Name: 上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル結核菌感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ3Dヒト肺組織モデルを用いた結核菌感染の動態解析。線維芽細胞コラーゲン基質と免疫細胞を用いて肉芽腫形成を再現し、結核の病態理解と治療薬開発に貢献する革新的なin vitro系です。

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著者は、リンシェーピング大学健康科学部の顕微鏡コア施設が高度なイメージングシステムへのアクセスを提供してくれたことを認めています。リンショーピング大学臨床実験医学部のカール・エリック・マグヌッソン(名誉科学者)は、Imaris 3D/4D画像処理ソフトウェア(Bitplane、スイス)へのアクセスを提供してくれました。S.ブライアンは、肺の模型漫画に協力してくれました。この研究は、スウェーデン研究評議会(動物研究の代替案、2012-1951)およびスウェーデン研究評議会(2012-3349)からM.L.およびスウェーデン戦略研究財団への資金提供によって支援されました。SBは、カロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデン国際開発協力庁(Sida)、スウェーデン民間危機管理庁(MSB)、およびスウェーデン心肺財団(HLF)から助成金を受けています。M.S.は、カロリンスカ研究所とストックホルム郡議会から助成金を受け取りました。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

感染部位で組織化された細胞クラスターを動員して形成する能力は、ヒト結核の特徴です 11。結核肉芽腫として知られるこれらの動的構造は、主に免疫細胞(マクロファージ、単球、T細胞、B細胞)と結 核菌を取り巻く多核巨細胞で構成されています。肉芽腫の役割は、感染を遮断し、細菌の局所的な拡散を防ぐことが長い間考えられてきました。しかし、より最近の研究では、肉芽腫の形成が細菌の早期生存、増殖、播種に重要であることが示されています 12。新しい研究の戦略は、肉芽腫形成および/または結核播種における細胞遊走を阻害するために効率的に標的にすることができる分子または経路を特定することです。 
結核に関する新しい研究の注意点は、ヒトの結核を再現するモデルが不足していることです。最も広く使用されている実験動物は、 結核菌 感染時に真の肉芽腫を形成しないため、結核 13-16 の研究には適切な選択肢ではありません。ヒト以外の霊長類はヒトの結核に最も近い 17 ですが、高い運用コストと倫理的問題のため、好ましい選択ではありません。ヒト結核は複雑な免疫学的プロセスであり、 in vitroでモデル化することは困難です。単層または共培養の細胞培養には、3D環境と組織応答が欠けています。したがって、ヒト初代免疫細胞およびヒト肺特異的細胞株に基づく革新的な肺組織モデルを開発しました 8,9。このモデルは、マクロファージが均一に組み込まれた上皮、細胞外マトリックスの形成、層状上皮、粘液分泌など、ヒト肺組織の特徴的な特徴を示します 9。 
3Dヒト肺組織モデルには、組織培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種された in vitro 単一培養または共培養に比べていくつかの利点があります。第一に、ヒト肺特異的細胞(線維芽細胞および上皮細胞)は、 一般的にin vitro 単一培養または共培養には含まれません。第二に、免疫細胞と肺特異的細胞は、3D生理学的文脈(コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス製品)に埋め込まれています。刺激/感染に対する細胞の反応と、肉芽腫の形成などの細胞の移動行動は、2D 環境と 3D 環境で大きく異なります。さらに、説明されている方法により、空間分布と複雑な細胞相互作用に関する極めて重要な情報を提供する 3D 視覚化と堅牢な 3D 定量分析が可能になります。 
結核菌によるモデル組織における実験的感染は、初期の結核肉芽腫を彷彿とさせる、感染部位でのマクロファージのクラスター化をもたらしました(図2および3)。我々は最近、病原性因子ESAT-6を分泌する能力に欠陥のある変異株 ESAT-6またはESAT-6を欠くウシ菌BCGは、病原性の結核菌とは対照的に、単球のクラスター化を誘導しなかった(早期肉芽腫なし)。これらのデータは、Mycobacterium marinumに感染したゼブラフィッシュ胚から行われた観察と一致しており、その透明性により肉芽腫形成のエレガントなライブイメージングが可能になります12。結核のゴールドスタンダードモデルがないため、結核患者から外科的に切除された組織生検を利用して、方法9を検証しました。私たちの in vitro 組織モデルは、肉芽腫におけるマクロファージの凝集、細胞内および細胞外細菌の両方の存在 18、壊死の誘導など、結核患者の肺およびリンパ節生検といくつかの特徴を共有しています 11。
記載されているモデルはヒト結核と生理学的関連性があり、他の in vitro モデルに比べていくつかの利点がありますが、いくつかの制限があります。たとえば、ヒトで同定された20以上のコラーゲンタンパク質のうち、細胞外マトリックスを模倣するためにモデルに含まれているのはタイプIのみです。しかし、I型コラーゲンは細胞外マトリックス産物の複雑な混合物であり、人体に最も豊富なコラーゲンです。さらに、組織モデルの上皮細胞や線維芽細胞によって産生されるコラーゲンIVとトロポエラスチン、ビメンチン、ラミニンなどのいくつかの細胞外マトリックスタンパク質の存在を実証し、新しいコラーゲン 8の合成を示しています。現在、肺組織モデルには、肺特異的細胞の他に単球とマクロファージしかありません。肉芽腫にも存在することが知られている好中球とリンパ球が欠けています。驚くべきことに、このモデルは追加の免疫細胞の導入に限定されず、それらがヒト結核の複雑な細胞相互作用にどのように寄与するかを調査するのに興味深いものです。初代肺胞マクロファージ、皮膚特異的細胞、および肺癌細胞の移植は、モデルですでにテストされています。私たちの目的は、ヒト結核によく似たモデルを使用することであったため、マウス細胞の導入は試みられていません。
要約すると、肺組織モデルは、基本的な機構研究と応用研究の両方に影響を及ぼします。肺モデルの潜在的な用途には、自然免疫の研究、食体成熟、オートファジー、サイトカイン、ケモカイン、抗菌ペプチドの産生などの宿主防御のメカニズム的側面の調査、および個々の細胞型の機能特性評価が含まれます。驚くべきことに、 in vitro 組織モデルは、1つまたは複数の細胞型の操作を可能にし、結核の研究だけでなく、肺に影響を与えるさまざまな感染症および非感染性疾患に関連する組織微小環境を提供します。

ヒトでは、感染症、組織炎症、細胞の動員、組織リモデリングおよび組織の恒常性の調節に応答が異なる細胞型が関与する複雑な事象です。したがって、これらの方法は、最高の局所組織環境において研究されています。以前は、これは、主に実験動物モデルを使用して可能でした。彼らはしばしば、人間とは異なる方法で病原体に対応し、また、疾患1の別のコースを表示しかし、広く使用されている実験動物は、多くの制限を保持します。 インビトロの肺組織モデル中のヒトはヒト肺で特異的免疫応答を研究するための可能性を保持しています。 ヒト結核感染（TB）は、主に肺に影響を与える病気である。 結核菌 （ 結核菌 ）、結核の原因物質は、細菌が肺dendriに飲み込まれている肺胞腔に輸送されるエアロゾル液滴を経由して肺に達します感染2,3に対する自然免疫応答の一部として、チック細胞や肺胞マクロファージ。病原体の食作用はファゴソーム内のバグの区画化につながる、理想的には食細胞による中和および病原体を死滅させることになります。 Mに曝露された個体の50％まで結核は、先天性免疫応答4を介して感染をクリアすることができると考えられています。感染の他の結果は後の段階で適応免疫系によるクリアランス、潜伏感染またはアクティブな疾患5慢性最悪のケースです。 以前は人間の結核の研究のために何のインビトロ組織モデルは存在していません。ヒトマクロファージまたは他の末梢血細胞の単一細胞培養物は、多くの場合、6,7を使用されています。このアプローチの欠点は、Mに露出し、肺組織内で一緒に動作して、異なる細胞型の動態を反映することができないことです結核 </eM&gt;。したがって、TB上の機能とメカニズムの研究を行うことができるようにするインビトロモデルが必要とされています。セル・ベースのここで説明する体外ヒト肺組織モデルでは、もともとの樹状細胞の機能8の研究のために私たちのグループによって設立されました。私たちは、結核の研究のために、この方法を適応しています。 ここに提示されたヒト肺組織モデルは、組織特異的な上皮細胞および線維芽細胞8から成ります。これらの細胞は、トランスウェルインサート中の多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養され、フォーム構造は、正常なヒトの肺組織（ 図1）に似ています。空気にさらされると細胞は頂端側8に粘液を分泌し始めます。 M.に感染したヒト初代マクロファージを注入することにより、モデルへの結核 、我々は、免疫細胞が組織に移行し、結核性肉芽腫9の初期段階を形成する方法を観察しています。これは最初のヒト組織モデルDESCRです結核ibed、それが結核と肺の他の疾患に対する自然免疫応答を研究するための有望なツールをもたらします。これまでに、我々は、モデルにおいて免疫細胞としてのみ単球およびマクロファージを使用しているが、複雑さのレベルは、追加の関連する細胞型を含めることによって増加させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> 肺組織モデルの概略1.概略図。 （A）モデルM.、ヒト肺特異的上皮細胞で構成されています結核は、初代マクロファージをに感染し、赤色の色素ラベルされた単球をトランスウェルフィルター上に作製したコラーゲン埋め込 ​​まれた線維芽細胞上に播種。空気への組織モデルの露出は、上皮によって細胞外マトリックスタンパク質の産生、粘液分泌と層化を開始します。こうして開発された3次元組織モデルは 、M を研究するための便利なツールですCLO環境における結核感染SELYヒトの肺。（B）組織モデルの製造における様々なステップの代表的な顕微鏡像。（C）肺モデル組織切片の完全な構造に似ています。スケール- 。100ミクロン<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>細胞培養インサート</td><td>BD Falcon</td><td>353092</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5細胞、肺線維芽細胞</td><td></td><td></td><td>ATCC#CCL-171</td></tr><tr><td>16HBE細胞、肺上皮細胞</td><td></td><td></td><td>Dieter Gruenert博士からの贈り物、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、米国、マウント・ザイオンがんセンター&nbsp;</td></tr><tr><td>5 x ダルベッコ修正されたイーグル」s medium (5 x DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>粉末から作られていますが、水の添加量が 5 倍少なくなっています。pHを7.3に調整し、0.2&microを使用してろ過します。mフィルター。</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」s Medium with Glucose (DMEM) 1x</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle's 塩</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液、100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr>ピル<td>ビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td><td></td><td></td><td>社内で調製</td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>熱を 30 分間、56 °C;C</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 緩衝液 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン(連鎖球菌ペン)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>超高純度 0.5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ウシコラーゲン PA 処理済み (500 ml)</td><td>器官形成</td><td>200-055</td><td></td></tr><tr><td>ピュアコール精製ウシコラーゲン溶液 (100 ml)</td><td>アドバンスドバイオマトリックス</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチン (1 mg)</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>初代ヒト単球/マクロファージ</td><td></td><td></td><td>ヒト全血またはバフィーコートから単離。</td></tr><tr><td>PKH26赤色蛍光細胞リンカーSigma</td><td></td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>結核菌H37Rvを発現する緑色蛍光タンパク質</td><td></td><td></td><td>M.結核菌H37Rv野生型を、GFPを構成的に発現するpFPV2プラスミドで形質転換した。</td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H9 ミディアム&nbsp;</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL ミドルブルック ADC エンリッチメント</td><td>BBL</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン B 硫酸塩 (20 & micro;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>B5264</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold anti=-fade 試薬と DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン -EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMaris Scientific 3D/4D画像処理ソフトウェア、バージョン7.6.8</td><td>Bitplane AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

上の機能的研究のための3dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

結核（TB）は依然として世界の人々の健康に大きな脅威を保持し、私たちは病気のメカニズムを理解し、新たな治療選択肢の発見を進める手助けするためのコスト効率に優れたが、信頼性の高いモデルの必要性がある。単層のインビトロ細胞培養または共培養は、三次元（3D）環境および組織応答を欠いています。ここで、我々は結核菌 （ 結核菌 ）の感染の間に起こる複雑な事象を研究するための有効なツールであることが期待されているヒト肺組織のインビトロモデルで革新的なについて説明します。 3次元組織モデルは、多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養された組織特異的上皮細胞および線維芽細胞からなります。空気暴露されると、上皮細胞層別化し、頂端側の粘液を分泌します。 M.に感染したヒト初代マクロファージを導入することにより組織モードに結核lは、我々は、免疫細胞が感染組織中に移動し、TBの肉芽腫の初期段階を形成することが示されています。これらの構造は根本的に異なるか、一般的に広く使用されている実験動物モデルにおいて観察されていない人間の結核、肉芽腫の明確な特徴を再現。この器官培養法は、宿主細胞病原体相互作用の空間的および時間的機能に関する重要な情報を提供する3次元可視化と堅牢な定量分析を可能にします。まとめると、肺組織モデルは、結核の研究のための生理学的に関連する組織の微小環境を提供します。従って、肺組織モデルは、基本的な機構的および応用研究の両方のための潜在的な意味を持ちます。重要なことには、モデルは、それによって、肺に影響を与える感染症の様々なモデル化するためのその使用が広がり、個々の細胞型の添加または操作を可能にします。

ヒトの結核のための3D肺組織モデルは、効果的にMの宿主-病原体相互作用を研究するために使用することができ結核感染 。この方法の基本的な手順は、異なるステップ及び組織切片の全体的な微細構造の代表的な顕微鏡写真を図1に概説されている。このモデルは肺線維芽細胞、気管支上皮細胞および初代単球/マクロファージを含むヒト肺組織のいくつかの構成要素を有しています3D組織環境内に埋め込まれました。ヒト肺組織の構成要素を組み込むだけでなく、モデルは、生理的条件に上皮および粘液分泌のすなわち成層に似ています。 TB感染の監視に肺組織モデルの使用の例は、図2に示されている。M.を視覚化するため結核 -immune細胞遊走との相互作用は、我々 は 、Mに感染したマクロファージを導入しましたGFPを発現する結核組織モデル（核について染色ブルー、DAPI）に合わせて新たに単離したPKH26標識単球（赤）と（緑）。 Mの 7日後の追加について組織モデルに結核に感染した細胞は、共焦点顕微鏡は、人間の結核9の特徴的な病変を模倣感染（緑）のサイト（ 図2）、で赤単球のクラスターを明らかにしています。 Mの 3次元可視化のための代表的な一連の画像結核は、細胞クラスターの組織モデルと定量化は、図3に示されているに感染し。3Dビジュアライゼーションは、3D画像にいくつかの機能を、対話調べ、定量化するため、ユーザーの柔軟性を提供します。 M.部位で単球のクラスターを明らかに図3Bに示すように、緑と赤の細菌単球クラスタの空間的配置は、頂端の回転及び側面図から分かるよう結核。クラスター OBませんでした感染していない組織 （ 図3A）で提供しています。個々の単球の数がMに（p &lt;0.01）減少し、我々は、単球細胞集団のサイズと数を定量した （p &lt;0.001）、細胞塊の大きさ（体積）が増強されることを見出しました結核は感染していない組織モデル（ 図3Cおよび3D）と比較して組織を感染させました。このデータは、Mの初期の肉芽腫形成の我々の以前の発見を検証します結核感染は、2D組織切片9で分析肺組織モデルで観察しました。 我々のデータは、組織モデルは、M細胞-複雑なホストを調査するために自然な立体生息地を提供していることを示唆しています結核の通信ネットワーク。また、3次元可視化と定量分析は、組織モデル（ 図3）の機能を研究するための優れたツールであることがわかりました。細胞塊の定量化（例えば、肉芽腫）、多くの場合、ストレッチ<html>いくつかの細胞層のHESとは完全に3次元定量分析によって捕捉することができます。また、モデル内の個々の細胞や細菌の正確な空間的および時間的特徴の可視化は、指定された実験室でのライブイメージング、移動および追跡調査を可能にします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> 病原性M.周囲の組織モデルクラスター図2.単球結核。感染していないと、Mの代表的な共焦点画像結核に感染した組織モデルが提示されています。感染していない組織と比較して、パネルの緑色から（M. tuberculosis- GFP）、赤（PKH26標識単球）、青（DAPI染色核）と合併チャネルが感染組織における単球の動員を示します。スケール - 100μmです。large.jpg &quot;スタイル=&quot;フォントサイズ：14px;行の高さ：28px; &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> 図3. 3次元可視化と組織モデルの定量分析は、有用な情報を提供しています。全体の組織モデル（A）非感染組織の3次元可視化の代表的な画像、（B）に感染したM.結核、IMARIS画像処理ソフトウェア（バージョン7.6.8）によりツァイスLSM700共焦点顕微鏡および定量分析を用いた光学セクショニングを介し。これらの画像は20X倍率で取得された、頂端、回転水平、回転、垂直および側面図（AとB）からの可視化を可能にする、1.5μmの間隔で19.5ミクロンの組織の厚さをカバーする14のzスタック。（C）QUA単球細胞クラスターのntitative分析はM.後早期肉芽腫クラスタの増強した（p &lt;0.0001）のサイズを明らかに感染組織で複数のクラスタを繰り返し強調、感染していない組織と比較して、感染の不在に比べ結核感染 。（D）単球数の定量は、感染組織の減少した（p &lt;0.01）を示しました。グリーン- M.結核 -GFP、レッド- PKH26標識単球、ブルー-細胞核、スケール- 。100ミクロン<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ヒト結核感染は複雑なプロセスであり、in vitroでモデル化することは困難です。ここでは、免疫細胞の移動や生理学的環境での早期肉芽腫形成など、感染中に発生するダイナミクスを再現する新しい3Dヒト肺組織モデルについて説明します。

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

本手順の全体的な目的は、M tuberculosis感染の研究に向けたin vitro肺組織モデルを構築することです。まず、細胞培養プレートインサートのフィルター上に線維芽細胞コラーゲンマトリックスを層状に形成します。次に、感染させた免疫細胞および肺上皮細胞を、この線維芽細胞コラーゲン層の上に播種します。得られた3D組織モデルを気空にさらすことで、粘液分泌と上皮の層形成を促進させます。最終ステップとして、組織を回収し、スライドに固定します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、M tuberculosisによって誘導された初期肉芽腫の形成を解析します。この手法の主な利点は、in vitroの細胞単層などの既存の方法とは異なり、このシステム内の細胞が3D微小環境に存在するため、病原性マイコバクテリウムに感染した際にヒトの結核に類似した肉芽腫が形成されることです。コラーゲン埋入線維芽細胞を調製するには、まず肺線維芽細胞を37 °Cで10分間トリプシン処理します。細胞が剥離したら、8 mLの完全DMEMで反応を停止させ、細胞を遠心分離します。ペレットを新鮮なDMEMを用いて230,000 cells/mLに再懸濁し、細胞を氷上に置きます。次に、6ウェルプレートの各ウェルにインサートを1つずつ入れます。ウェルプレートを用意し、新鮮に調製した細胞層混合液を各インサートに1 mLずつ分注し、気泡が入らないように混合液がインサート全体を覆っていることを確認します。次に、プレートを37 °Cのインキュベーターで30分間静置します。インキュベーション終了後、インサート1個あたりのコラーゲンのpHを中和させるため、氷上の滅菌コニカルチューブ内でコラーゲン2 mLとプレミックス615 µLを混合します。次に、コラーゲン混合液に完全dmem 58 µLと肺線維芽細胞 327 µLをインサートあたり加えます。ピペッティングを行い、細胞を混合液全体に均一に分散させます。その後、細胞層 3 mLを各インサートの壁面に沿って、非細胞性コラーゲン層の上に速やかに加えます。気泡が入らないように注意しながら、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、さらに2時間静置します。コラーゲンの重合後、各ウェルの底に完全dmemを2 mLずつ加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、清潔なピンセットを使用してインサートを一つずつ慎重に持ち上げ、それぞれの底から培養液を吸引します。次に、各ウェルの底に2 mLの完全DMMを、各インサートに2 mLの完全DMMを加えます。培地の両方の容量を2日ごとに、5〜7日間交換します。感染マクロファージを調製するには、まずマクロファージ培養液に、感染多重度（MOI）10で強毒性M tuberculosisを加え、4時間インキュベートします。インキュベーション終了後、細胞をPBSで3回洗浄して細胞外の細菌を除去し、マクロファージを2 mMのDTAで37 °Cで10分間処理します。細胞が剥離したら、抗生物質を含まない完全DMMに再懸濁します。次に、線維芽細胞コラーゲンマトリックスプレートから培地をすべて吸引し、外側チャンバーに新鮮な抗生物質を含まない完全DMMを1.5 mL加えます。次に、蛍光標識した単球と感染マクロファージを5:1の比率で、インサート1個あたり50 µLの抗生物質を含まない完全DMEM中で混合します。その後、単球とマクロファージの混合液50 µLを各インサートの内側に加え、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、細胞が剥がれるのを避けるため、インサートの壁面に沿って培養液2 mLをゆっくりと加え、さらに24時間培養します。肺上皮細胞を播種するには、免疫細胞線維芽細胞コラーゲンマトリックスの上に、完全dmm 50 µLで調製した1 mLあたり4 million個の上皮細胞を添加します。細胞を室温で2分間インキュベートした後、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、先ほど示したように、抗生物質を含まない完全DMM 2 mLをインサートに緩やかに加え、さらに3日間細胞を培養します。感染させたマクロファージを播種してから5日後、プレートからすべての培地を吸引し、外側チャンバーに抗生物質を含まない完全DMMを1.8 milliliters添加します。その後、播種後7日目にインサートに培地を添加せず、インキュベーター内で3D組織モデルを2日間空気に曝露させます。プレートから培地を完全に除去し、組織モデルを4%パラアルデヒドで室温・暗所にて30分間混合します。次に、メスを用いて、ウェルインサートからメンブレンを分離させます。続いて、清潔なメスを使用し、組織モデルの端を慎重に取り除き、各組織をほぼ等しい大きさの正方形に4等分します。組織片をスーパーフロストガラススライドに載せ、5分間乾燥させます。次に、抗退色剤およびDAPIを含む蛍光封入剤を用いて組織を封入し、カバーガラスで覆います。スライドを室温の暗所で乾燥するまで放置し、その後、カバーガラスの縁をマニキュアで封止します。ラッカーが乾燥したら、BSL3施設から搬出するため、スライドを70% ethanolに浸漬させます。組織を可視化するため、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、細胞クラスターの3D定量化に向け、組織全体をカバーするように5〜10箇所の異なる領域から、解像度512 × 512で3D画像を取得します。この際、Z-stackの厚みを最低20 micronとし、スタック間の間隔を1〜1.5 micronに設定してください。3D画像処理ソフトウェアを開き、目的の画像を読み込みます。次に、ディスプレイ調整ツールを使用して、各チャネルの画像、コントラスト、明るさ、およびブレンド不透明度を調整し、ボリュームレンダリングを最適化してノイズ干渉を最小限に抑えます。続いて、組織表面を可視化するために、赤色単球チャネルを選択し、フィルターを用いて適切な閾値を設定することで、赤色単球の選択範囲を制限するか、必要に応じて背景を除外します。最後に、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートし、以降の下流解析に使用します。M tuberculosis感染細胞を播種して7日後、共焦点顕微鏡観察により、緑色の細菌の存在で示される感染部位に赤色の単球が集積していることが分かります。これは、ヒトの結核に見られる肉芽腫として知られる病変を模した3D構造です。可視化することで、いくつかの特徴について相互作用、検証、および定量化を行う柔軟性が得られます。例えば、これらの画像における3D画像では、M tuberculosisの感染部位における単球のクラスターが描出されています。緑色の細菌と赤色の単球クラスターの空間的配置は、頂点方向、回転方向、および側面方向から観察することができます。予想通り、これらのクラスターは非感染組織では観察されませんでした。単球、細胞クラスター、および M tuberculosis 感染組織のサイズと数の定量化により、非感染組織モデルと比較して、細胞クラスターのサイズが増大し、一方で個々の単球の数は減少していることが明らかになりました。この肺組織モデルの潜在的な利用用途としては、結核における異なる免疫細胞の役割や組織免疫の研究、マイコバクテリアの表現型の研究、および肉芽腫内のマイコバクテリアを殺傷する薬剤候補の試験などが挙げられます。

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Research

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Immunology and Infection

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上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル

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