上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル結核菌感染

この手順の全体的な目標は、M結核感染の研究のためのin vitro肺組織モデルを構築することです。これは、まず線維芽細胞コラーゲンマトリックスを細胞培養プレートインサートのフィルター上に重ねることによって達成されます。第2段階では、感染した免疫細胞と肺上皮細胞が線維芽細胞のコラーゲン層に座ります。

得られた3D組織モデルは、粘液の分泌と上皮の成層化を促進するために空気にさらされます。最終ステップでは、組織を採取してマウントします。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を使用して、M結核誘発性早期肉芽腫の形成を分析します。

この技術または既存の方法、例えば、細胞のインビトロ単層の主な利点は、このシステム内の細胞が3D微小環境に存在することであり、ヒト結核に似た毒性微生物による感染時に肉芽腫の形成を可能にするコラーゲン埋め込み線維芽細胞を調製するために、細胞が分離したときに肺線維芽細胞をトリプシンで10分間処理することから始める。 8ミリリットルの完全なDMEMで反応を停止し、細胞をスピンダウンします。新鮮なdmmでミリリットルあたり230, 000細胞でペレットを再懸濁し、細胞を氷の上に置きます。次に、ウェルごとに1つのインサートを6に追加します。

ウェルプレートをプレートにして、新たに調製した細胞層混合物1ミリリットルを各インサートに分注し、混合物が気泡なしでインサート全体を覆っていることを確認します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのコラーゲンと615マイクロリットルのプレミックスを氷上の滅菌円錐管に混合して、インサートあたりのコラーゲンのpHを中和します。

次に、インサートごとに58マイクロリットルの完全なdmemと327マイクロリットルの肺線維芽細胞をコラーゲン混合物に加えます。ピペッティングで上下に動かし、細胞を混合物全体に均一に分散させます。次に、各インサートの側面にある3ミリリットルの細胞層を各無細胞コラーゲン層にすばやく追加します。

気泡が入らないように注意し、プレートをさらに2時間細胞培養インキュベーターに戻します。コラーゲンの重合後、各ウェルの底に2ミリリットルの完全dmemを加え、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、清潔な鉗子を使用して、インサートを一度に1つずつ慎重に持ち上げ、それぞれの底から培地を吸引します。

次に、各ウェルの底に2ミリリットルの完全なDMMを追加し、各インサートに2ミリリットルの完全なDMMを追加します。5〜7日間、2日おきにミディアムの両方のボリュームを交換します。感染したマクロファージを調製するには、まずマクロファージ培養物を毒性のあるM結核と4時間インキュベートし、感染度が10倍になります。

インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで3回洗浄して細胞外細菌を除去し、マクロファージを2ミリモルのA DTAで摂氏37度で10分間処理します。細胞が剥離したら、抗生物質を含まない完全dmmで細胞を懸濁します。次に、線維芽細胞コラーゲンマトリックスプレートからすべての培地を吸引し、1.5ミリリットルの新鮮な抗生物質を含まない完全なDMMを外側のチャンバーに加えます。

次に、蛍光標識単球と感染したマクロファージを、インサートあたり50マイクロリットルの抗生物質を含まない完全DM EMに5対1の比率で混合します。次に、50マイクロリットルの単球マクロファージ混合物を各インサートの内側に加え、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、2ミリリットルの培養物をゆっくりと加え、細胞が外れないようにインサートの壁に培地を置き、培養物をさらに24時間インキュベートします。

肺上皮細胞を培養物に播種するには、免疫細胞線維芽細胞コラーゲンマトリックスの上に、50マイクロリットルの完全dmmに1ミリリットルあたり400万個の上皮細胞を追加します。細胞を室温で2分間インキュベートし、続いて摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、先ほど示したように、抗生物質を含まない完全なDMMを2ミリリットルのインサートに穏やかに加え、さらに3日間細胞を培養します。

播種から5日後、感染したマクロファージはプレートからすべての培地を吸引し、1.8ミリリットルの抗生物質を含まない完全なDMMを外側のチャンバーに加えます。その後、7日目にインサートに培地を追加せずに、インキュベーター内の3D組織モデルを2日間空気にさらしました。シード後。

培地をプレートから完全に取り出し、組織モデルを4%パラアルデヒドと室温で暗所で30分間混合します。次に、メスを使用して、ウェルインサートからメンブレンを分離します。次に、清潔なメスを使用して、ティッシュモデルの側面を慎重に取り外し、各組織をほぼ同じサイズの4つの正方形にスライスします。

ピースをスーパーフロストスライドガラスに移し、5分間乾かします。次に、耐退色剤とdpiを含むメディウムである蛍光マウントを使用して、ティッシュをマウントし、カバースリップで覆います。スライドを室温で暗所に置いて乾かし、カバースリップの端をマニキュアで密封します。

ラッカーが乾燥したら、スライドを70%エタノールに浸して、BSL 3施設から移送します。組織を視覚化するには、512 x 512の解像度で組織全体をカバーする5〜10の異なるフィールドの3D画像を取得し、Zackはスタック間の距離が1〜1.5ミクロンで最小20ミクロンの厚さでカバーし、細胞クラスターの3D定量化を行います。3D画像処理ソフトウェアを開き、目的の画像を読み込みます。

次に、ディスプレイ調整ツールを使用して、画像、コントラスト、明るさ、ブレンドの不透明度の各チャンネルを調整して、ボリュームレンダリングを最適化し、ノイズ干渉を最小限に抑えます。次に、組織表面を視覚化するには、赤色の単球チャネルを選択し、フィルターを使用して適切なしきい値を設定し、赤色の単球の選択を制限するか、必要に応じて背景を除外します。最後に、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートして、さらに下流の分析を行います。

7日目に、M結核後に感染した細胞播種共焦点顕微鏡検査により、感染部位に赤色単球のクラスターが見られ、これは肉芽腫3Dとして知られるヒト結核の病変を模倣する緑色細菌の存在によって認められます。視覚化により、いくつかの特徴を相互作用、調査、および定量化する柔軟性が得られます。たとえば、これらの画像では、結核の部位に単球のクラスターを描いた3D画像。

緑色の細菌と赤色の単球クラスターの空間配置は、頂端図、回転図、および側面図から観察できます。予想通り、これらのクラスターは感染していない組織では観察されませんでした。単球、細胞クラスター、および結核Mに感染した組織のサイズと数を定量化したところ、非感染組織モデルと比較して、細胞クラスターのサイズが拡大し、個々の単球の数が減少することが明らかになりました。

この肺組織モデルの潜在的なユーザーには、結核におけるさまざまな免疫細胞と組織免疫の役割の研究、マイコバクテリアの表現型の研究、肉芽腫内のマイコバクテリアを殺す薬剤候補の試験が含まれます。