Name: 細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ 超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成と細胞標識法。PLGA被覆した10nmマグネタイトナノ粒子を作製し、蛍光顕微鏡で標的細胞の可視化を行う。磁気標的化による細胞分離技術を習得できる。

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著者は、欧州地域開発基金 – FNUSA-ICRC からの資金提供に感謝したいと思います。CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123)、米国心臓協会科学者開発助成金(AHA#06-35185N)、および国立衛生研究所(NIH #T32HL007111)。

マグネタイトゲルの合成1。 <ol><li>エチルアルコールが続く脱イオン水、続いて濃塩酸を使用して、すべてのガラス器具を洗ってください。好ましくは乾燥炉中で、O / Nを乾燥することができます。 注意！塩酸は危険です - ドラフト内で個人用保護具や作業を着用。エチルアルコールは有害である - 個人用保護具を着用します。 </li><li>脱ガス、脱イオンH 2 Oを 500ミリリットルを静かに30分間N 2ガ ​​スをバブリングすることによりDreschelボトルを使用してください。 </li><li>セットアップマグネタイト合成装置を化学ヒュームフード内。 <ol><li> isomantleヒーター内500mlの三口丸底フラスコを置き、クランプを使用して、中央の口を確保し、スタンド。 </li><li>丸底フラスコの側面口の1つ、残りの側の首にゴム隔壁を還流冷却器にゴム隔膜を取り付けます。連続還流冷却器を通して冷たい水を実行します。 </li><li>パンク番目N 2ガ ​​スラインに接続された針を用いて電子丸底フラスコのゴム隔壁とガス流出を可視化するためにバブラー（水とのすなわち、フラスコ）に実行されているガスラインに接続された針で還流冷却器のゴム隔膜を穿刺。 </li><li>パドルアダプタを介して丸底フラスコの中央の口にブレードパドルを取り付けます。スタンドに取り付けられたオーバーヘッドスターラーをブレードパドルのシャフトを取り付けます。 </li></ol></li><li> N 2ガ ​​スを用いた丸底フラスコをパージし、低いが検出速度で流れるN 2ガ ​​スを残します。 </li><li>丸底フラスコから還流冷却器を取り外し、塩化鉄（III）、鉄の0.6125グラム（II）塩化物水和物の1.000グラムを追加し、脱気H 2 Oの50ミリリットル 注意！塩化鉄（III）および塩化鉄（II）四水和物は、有害である - 個人用保護具を着用します。 </li><li> 50に加熱しながら還流冷却器を取り付け、1000rpmで攪拌°C。これらの条件下で攪拌すると、10 nmの直径のマグネタイトナノ粒子を生成します。 </li><li>一旦、50℃で、さらに攪拌しながら丸底フラスコにゴム隔膜を介して注入することにより、28％水酸化アンモニウム溶液10mlを加えます。 注意！水酸化アンモニウムは有害である - 個人用保護具を着用します。 注：水酸化アンモニウム溶液は、マグネタイトを沈殿させるために使用され、溶液が黒くなるべきです。 </li><li>まだ攪拌しながらアンモニアガスを沸騰する90℃に丸底フラスコと熱からゴム隔壁および N 2ガ ​​スラインを外します。 注：これは、還流冷却器のゴム隔壁を穿刺することにより、丸底フラスコに、N 2の流れを維持するために、任意である、しかし、マグヘマイトへの磁鉄鉱 ​​の酸化は、このステップの間に無視できるものです。 </li><li>いったん90℃でまだ攪拌しながら、丸底フラスコにオレイン酸の1ミリリットルを追加します。オレイン酸は、マグネタイトNA被覆するために使用されていますマグネタイトのゲルを形成するnoparticles。 注意！オレイン酸は有害である - 個人用保護具を着用します。 </li><li>丸底フラスコにゴム隔壁および N 2ガ ​​スラインを交換し、還流冷却器を取り外します。 </li><li>熱をオフにして、2時間、500rpmで攪拌​​します。 </li><li> isomantleヒーターからの丸底フラスコを取り外し、マグネタイトゲルを保持するために、フラスコの底に対して保持強力な磁石を使用している間、残りの液体をデカント。 注意！損傷または傷害を避けるために、細心の注意を持つ強力な磁石を処理します。 </li><li>空気乾燥O / N（オプション）にマグネタイトゲルを許可します。 </li></ol>マグネタイトゲルの2精製<ol><li>マグネタイトゲルを溶解させた丸底フラスコに、ヘキサン40 mlを加え 注意！ヘキサンは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。 </li><li>残留H 2 Oあちこち除去するために、脱気の H 2 O 40mLで分液漏斗を使用してくださいマグネタイト溶液メートル。 <ol><li>ゆっくりと分液漏斗内のH 2 Oにマグネタイト液を注ぎ、軽く5分間二相液体を旋回。 </li><li>外排出し、下部の水部分を破棄します。 </li><li>ゆっくりマグネタイトソリューションの下に、それが落ち着くように、分液漏斗に脱気したH 2 Oの40ミリリットルを加え、穏やかに旋回し、以前のようにドレイン。 </li><li>三度目の洗浄するために繰り返します。 </li></ol></li><li> 、三角フラスコにマグネタイト液を移し、無水硫酸ナトリウムの価値はいくつかへらを追加し、マグネタイト溶液から、残りの残留H 2 Oを除去するための渦。 </li><li>硫酸ナトリウム及び残留H 2 Oを除去するための濾過漏斗で1ミクロンの濾紙マグネタイト溶液を濾過 注：真空支援が推奨されます。 </li><li> 50ミリリットル蒸発フラスコにマグネタイト液を移し、ヘキサンを蒸発させるために、ロータリーエバポレーターを使用以下の条件で2時間：中程度の回転速度、真空度は50℃の水浴でフラスコを蒸発させ、塗布し、24℃の水が凝縮器を循環します。 注：必要に応じて、PLGAでコーティングする前にマグネタイトゲルを保存します。 </li></ol> PLGAシェルを使用したマグネタイトナノ粒子の3コーティング<ol><li> 1.5％（M / V）のソリューションを作成するために、酢酸エチル240mlの中のPLGAの3.60グラム（75/25ブレンド）を溶解します。注意：酢酸エチルは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。 </li><li> 5.0％（M / V）溶液を作成するために、磁気スターラーを用いて脱気H 2 O 500ml中のPluronic F-127の25.00グラムを溶解します。 注：プルロニックF-127は、生体適合性界面活性剤として作用する非イオン性両親媒性ブロック共重合体です。なお、ステップ3.3.2で水中油型エマルジョンを安定化するのに役立ちます。 </li><li>ミクロを使用して、重み付けされたガラスバイアル内で6 0.040グラムのアリコートにマグネタイトゲルを収集します。 PERF各アリコートについては、以下のコーティング及び洗浄工程をORM。 注：一定分量は、ステップ4で劣化する前に凍結乾燥を最小限に抑えながら、純度と収率を最大れる、効率的な処理および磁気デカンテーションを確保するために必要です。 <ol><li> 10分間超音波洗浄器で0.040グラムのマグネタイトゲルのアリコートおよびプラスチックビーカー超音波処理にPLGA溶液の40ミリリットルを追加します。 </li><li>プラスチックビーカーのプルロニック溶液80 mlを加え、すぐに水中油型エマルジョンとしてマグネタイトナノ粒子上のPLGAコーティングを形成するために7分間最高設定で実験室用ミキサーで乳化します。 </li><li>すぐに酢酸エチルを蒸発させ、化学換気フード中で1時間脱イオンH 2 O及び超音波処理を1 LにSPION溶液を希釈します。 </li><li> SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。 注：これは、断続的に、数時間攪拌する必要があるかもしれません溶液前SはSPIONsのほとんどが収集されたことを示す白っぽくなります。 </li><li>磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。 </li><li>次のようにSPIONsを3回洗浄します。 <ol><li>脱イオンH 2 O 1LにSPIONsサスペンド</li><li> 20分間SPION液を超音波処理。 </li><li> SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。これは、溶液がSPIONsの大部分が回収されたことを示す明確なターン前に断続的に数時間撹拌することが必要であり得ます。 </li><li>磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。 </li></ol></li></ol></li><li>水性懸濁液のような単一の加重ガラス瓶に6マグネタイトゲルアリコートのそれぞれから合成SPIONsを収集します。必要に応じて、必要に応じて磁気的に余分な水分をデカント。 </li></ol> 4.フリーズSPIONsの-drying <ol><li> SPIONソリューションをフリーズします。 </li><li>凍結乾燥した凍結乾燥機でSPION液O / Nに。 </li><li>凍結乾燥SPIONsを計量。細胞標識に使用するまで凍結乾燥SPIONsを-20℃で保存することができます。 注：-20°C劇的での保存は、分解速度を減少させ、貯蔵寿命を向上させます。 </li></ol> SPIONsによる細胞の5ラベリング<ol><li> 40 mg / mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中SPIONsのアリコートを一時停止し、30分間超音波処理します。 </li><li>細胞培養培地を5μl/ mlの濃度で細胞のほぼコンフルエントなフラスコにSPION溶液を加えます。静かにフラスコを揺動することにより均一な分布を確認してください。 </li><li> 37℃で16時間細胞をインキュベートします。 </li><li>穏やかに培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>磁気標識細胞を収集し、実験に使用します。 </li><li>未使用SPION溶液は​​4℃で保存することができ、米国でなければなりません数ヶ月以内にエド。各使用前に30分間超音波処理。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

任意のナノ粒子合成プロトコルと同様に、反応物質の化学物質の純度は、最小限の細胞毒性効果を持つことになり、高品質のSPIONsを達成するために重要です。これは、オレイン酸（≥99％）、塩化鉄（II）四水和物（≥99.99％）、塩化鉄（III）（≥99.99％）、酢酸エチルなどの非常に純粋な試薬を購入することが重要である（HPLCグレード、≥99.9％ ）、ヘキサン（HPLCグレード、≥97.0％）、水酸化アンモニウム（≥99.99％）、及び硫酸ナトリウム（≥99.0％）。これは、比較的高価であり、非常に純粋な、高品質のPLGAを、購入するために特に重要です。また、すべてのガラス製品は、完全に塩酸、脱イオン水、エチルアルコールで洗浄し、使用前に乾燥させなければなりません。 同様に、プロトコル内の精製工程および洗浄工程は、最終的なSPIONsが高品質であること、最小限の細胞毒性作用を持つことになります確保するために重要です。マグネタイトゲルはあってはなりませんPLGAで被覆する前に可能な限り多くの水酸化アンモニウム、水、及びヘキサン等。したがって、プロトコルの多くはマグネタイトゲルの純度...

体内の特定の部位への細胞の標的送達と捕捉は、さまざまな生物医学的応用にとって望ましいことです。 MRIガイド下集束超音波による脳への神経幹細胞の送達は、神経変性疾患、外傷性脳損傷、および脳卒中1の可能な治療選択肢として提案されています。 間葉系幹細胞は、その自然な腫瘍向性により、抗がん剤を腫瘍に送達する能力について研究されています2,3。 心筋幹細胞は、心筋梗塞の可能な治療法として心臓に送達されています4,5。 血管ステントは、循環する前駆細胞を捕捉するためにCD34抗体を用いて開発されています6。 これらの細胞ターゲティングアプローチは有望ですが、細胞特異性の欠如、一貫性のない細胞保持、オフターゲット細胞送達などの欠点があります。
現在の方法の全体的な目標は、さまざまな細胞送達および選別アプリケーションのために、細胞の磁気指向ターゲティングを可能にすることです。 磁気ターゲティングにより、特定の細胞を特定の標的部位に制御して送達することができ、オフターゲット効果は最小限に抑えられます7。 磁場は、体内の磁気標識細胞の動きを安全に方向付けるために、埋め込まれたデバイスまたは外部デバイスによって生成することができる8。 数多くの研究努力は、再生結果を改善するために、心臓9-14、網膜15、肺16、皮膚17、脊髄18,19、骨20、肝臓21、および筋肉22,23などの損傷組織に対する幹細胞の磁気指向ターゲティングに焦点を当ててきました。
細胞の磁気ターゲティングも、埋め込み型心血管デバイスを内皮化する手段として広く研究されています。 均一で完全な内皮は、デバイスと循環血液要素との間にバリアを提供し、血栓症と炎症を軽減します。 内皮細胞は、移植前に、または移植後に血管系を介してデバイスに送達することができます。 いずれの場合も、磁場を使用して細胞を装置の表面に捕捉し、血液の循環によって生じるせん断応力にさらされたときに細胞を保持します。 磁気血管ステント24〜27および血管移植片28は、両方ともこの目的のために製造され、試験されている。
磁気セルターゲティングには、磁気キャリア粒子で細胞を標識するための戦略が必要です。 これらの粒子は、抗体またはリガンド/受容体ペアを介して細胞の表面に結合するか、細胞内にエンドサイトーシスすることができます。 超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)は、生分解性、生体適合性、および様々な細胞タイプによって容易にエンドサイトーシスされる29。 これらの粒子は、磁場に応答する細胞を効果的にレンダリングし、時間の経過とともに自然に分解されます。 SPIONは、さまざまな磁気ターゲティングおよびソーティングアプリケーション向けに、培養中の細胞を磁気的に標識する簡単で安全な手段を提供します。 マグネタイト(Fe3O4)コアとポリ(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)シェルを持つSPIONを合成する方法が提供されています。 さらに、培養中の細胞をSPIONで標識する方法が提供されています。

<table><tbody><tr><td>水酸化アンモニウム溶液、28% NH3、H2O、&ge;99.99%微量金属ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用してください</td></tr><tr><td>ドレッシェルボトル、500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Acetate、CHROMASOLVR Plus、HPLC用、99.9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業</td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用</td></tr><tr><td>蒸発フラスコ、50 ml、24/40ジョイント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>ロトエバポレーターで使用するため</td></tr><tr><td>フィルターペーパー、直径3cm、グレード1</td><td>フィッシャー</td><td>09-805P</td><td>ガラスフィルター漏斗で使用するため</td></tr><tr><td>ガラスビーカー、1 L</td><td>フィッシャー</td><td>FB-101-1000</td><td>SPIONの洗浄用</td></tr><tr><td>ガラスフィルター漏斗、バキュームホースアダプター、24/40、30 mLに適合</td><td>フィッシャー</td><td>K954100-0344&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアルキャップ</td><td>フィッシャー</td><td>03-391-46</td><td>ガラスバイアル用</td></tr><tr><td>ガラスバイアル、2 ml</td><td>フィッシャー</td><td>03-391-44</td><td>マグネタイトゲルの収集用 &SPIONs</td></tr><tr><td>Hexane, CHROMASOLVR, HPLC用, &ge;97.0% (GC)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ドラフトで作業してください</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業</td></tr>する塩化<tr><td>鉄(II)四水和物、&ge;99.99%微量金属基準&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用してください</td></tr><tr><td>塩化鉄(III)無水、粉末、&ge;99.99%微量金属ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>有害な試薬 - 個人用保護具を着用</td></tr><tr><td>アイソマントルヒーター、500mL</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>ラボミキサー</td><td>シルバーソン</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラス</td><td>フィッシャー</td><td>21-401-25A</td><td>マグネタイトの移送用ゲル</td></tr><tr><td>NdFeB磁石、1インチx 1インチx 1インチ</td>ア<td>メージングマグネット</td><td>C1000H-M</td><td>非常に強力な磁石、オレイン酸のハンドル、</td></tr><tr><td>&ge;99% (GC)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>冷凍庫に保管します。有害な試薬 - 個人用保護具を着用</td></tr><tr><td>してください オーバーヘッドスターラー</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラークランプ</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>オーバーヘッドスターラー用</td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー用 Hスタンド</td><td>IKA</td><td>1412000</td><td>オーバーヘッドスターラー用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックビーカー、250 ml</td><td>フィ</td><td>ッシャー02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG(75/25ブレンド)</td><td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502Aも使用できます。冷凍庫で保存</td></tr><tr><td>プルロニックF-127粉末、BioReagent、細胞培養に適した</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PTFE拡張可能ブレードパドル、直径8 mm</td>、<td>SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>PTFE容器アダプター、24/40、直径8 mmパドルに適合</td><td>Monmouth Scientific</td><td>PTFE容器アダプターA480</td><td>PTFE拡張ブレードパドルと併用</td></tr><tr><td>再循環チラー</td><td>クラークソン</td><td>696613</td><td>回転蒸発器</td></tr><tr><td>逆流コンデンサーと併用、24/40、250 mmに適合</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td></td></tr><tr><td>ロトエバポレーター</td><td>クラークソン</td><td>216949</td><td></td></tr><tr><td>ラバーセプタム、ストッパー付き24/40</td>エー<td>スガラス</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>セパレーター漏斗、250ミリリットル</td><td>フィ</td><td>ッシャー10-438E</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ナトリウムACS試薬に適合、&ge;99.0%、無水粒粒</td>体 <td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3ネック丸底フラスコ、角度付き、24/40ジョイント、500ml</td><td>エースガラス</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機 穴あきパン</td><td>フィッシャー</td><td>15-335-20A</td><td>超音波洗浄機用</td></tr><tr><td>超音波洗浄機、2.8 L</td><td>フィッシャー</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>真空コントローラー</td><td>クラークソン</td><td>216639</td><td>回転蒸発器用 (オプション)</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>Clarkson</td><td>219959</td><td>ロトエバポレーター用</td></tr></tbody></table>

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

細胞および治療剤の標的化送達は、オフターゲット部位への悪影響を最小限に抑えながら、標的部位で治療効果を集中することにより、生物医学的用途の広い範囲に利益をもたらします。磁気細胞標的化は、効率的で、安全で、簡単な配信技術です。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）は、生体適合性、生分解性であり、および磁界に応答してレンダリングするために細胞内に取り込ませることができます。合成プロセスは、マグネタイト鉄（Fe 3 O 4）を作成することを含む、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）コーティングを形成するために、高速乳化続いナノ粒子。 PLGA-マグネタイトSPIONsは約10 nmの直径のマグネタイトコアを含む直径約120nmです。培養培地中に置かれたとき、SPIONsは、天然細胞によってエンドサイトーシスおよび細胞質エンドソーム内の小さなクラスターとして記憶されます。これらの粒子は、細胞に十分な磁気質量を与え磁場内にターゲットを可能にします。多数の細胞選別とターゲットアプリケーションは、磁場に反応する様々な細胞型をレンダリングすることで有効になっています。 SPIONsは、同様に、腫瘍の治療または組織はんだ付けのための医療用イメージング造影剤として使用する、標的薬物や遺伝子デリバリー、診断アッセイ、およびローカル温熱療法の生成を含む他の生物医学的用途の多様性を持っています。

マグネタイトナノ粒子は、50℃、1000回転（図1）での鉄（III）、塩化鉄（II）塩化物水和物の水溶液を攪拌した結果、直径が約10nmです。これらの結果は、マグネタイトナノ粒子の合成に成功を実証します。これは、最初に合成しようとすると、バッチの少量の試料から採取したマグネタイトナノ粒子のサイズおよび形状を確認することが重要です。透過型電子顕微鏡（TEM）は、これらの粒子を可視化するための好ましい方法です。バッチは破棄されるべきであり、 図1に示すように、マグネタイトナノ粒子は直径および球形で10nm程度でない場合、合成が再試行する必要があります。 120nmで（図2）の直径を有するPLGA-マグネタイトSPIONsの高速乳化剤結果を用いて、PLGAとマグネタイトナノ粒子をコーティングします。これらの結果は、成功した実証しますPLGA-マグネタイトSPIONsの合成。これは、初めて合成をしようとしたときにバッチの小さなサンプルから採取したPLGA-マグネタイトSPIONsの大きさ...

標的細胞送達は、さまざまな生物医学的応用に有用です。 このプロトコルの目標は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)を使用して細胞を標識し、それにより、細胞送達と局在化を高度に制御するための磁気細胞ターゲティングアプローチを可能にすることです。

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

本手順の全体的な目的は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を合成し、それらの粒子を用いて磁気ターゲティングおよびソート用途に細胞を標識することである。まず、直径10 nmのマグネタイトナノ粒子を合成することでこれを達成する。次のステップでは、マグネタイトナノ粒子の表面を厚さ50 nmのポリ乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）のシェルでコーティングする。次に、磁性ナノ粒子を洗浄し、凍結乾燥させます。最終ステップは、細胞標的化およびソーティングへの応用のために、磁性ナノ粒子で細胞を標識することです。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、磁場内における磁性ナノ粒子標識細胞の標的化を示します。抗体を用いた細胞標的化などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、磁気細胞標的化が極めて特異性が高く、制御可能であることです。治療用細胞を標的部位へ届けつつ、標的以外の部位への影響を回避できるため、本技術の応用範囲はさまざまな疾患の治療にまで及びます。一般的に、この手法を初めて行う方は、純度が高く高品質なナノ粒子を得るために細心の注意を払う必要があるため、習得に苦労することがあります。生体内における生細胞のターゲティングと局在化の向上を目指しました。まず、ドレスルボトルを用いて、脱イオン水 500 milliliters に窒素ガスを緩やかにバブリングし、30分間脱気します。反応装置を設置するため、500 milliliter の三口丸底フラスコをISOマントルヒーター内に配置します。次に、一方の側ネックをゴムセプタムで塞ぎ、もう一方に還流冷却器を設置します。冷却器に冷水を連続的に流し、反応のための不活性雰囲気を構築します。まず、窒素ガスラインに接続した針で、フラスコのゴムセプタムを穿刺します。次に、ガス流出を確認するために、バブラーに接続した針でコンデンサーのセプタムを穿刺します。続いて、パドルアダプターを用いてブレードペダルをセンターネックに取り付けます。反応混合物を絶えず撹拌し続けるため、ブレードシャフトをスタンドに固定したオーバーヘッドスターラーに取り付けます。フラスコ内を窒素ガスでパージし、低速ながら検出可能な速度で窒素を流し続けます。次に還流冷却器を取り外し、1 gの塩化鉄(III)、612.5 mgの塩化鉄(II)テトラ、および50 mLの脱気水を加えます。冷却器を再び取り付け、50 °Cに加熱しながら1000 RPMで反応液を撹拌します。これにより、直径10 nanometerのマグネタイト粒子が生成されます。反応温度が50 °Cに達したら、シリンジを用いて28% ammonium hydroxide 10 millilitersをフラスコのセプタムから注入します。マグネタイトが沈殿するにつれて、溶液は黒色に変化します。ゴムセプタムとガスラインを取り外し、反応液を90°Cまで加熱します。次に、ナノ粒子をコーティングしてマグネタイトゲルを形成させるため、オレイン酸を1 mLフラスコに加えます。その後、フラスコにセプタムとガスラインを再び取り付け、コンデンサーを取り外します。加熱を停止し、反応液を500 RPMで2時間攪拌します。攪拌後、強力な磁石でナノ粒子をフラスコの底に保持しながら、上澄み液をデカンテーションで除きます。精製を開始するために、まず磁性体ゲルを40 millilitersのヘキサンに溶解させます。この溶液をDegas水40 millilitersを含む分液漏斗にゆっくりと注ぎ、漏斗を5分間静かに回旋させます。回旋後、下層の水相をデカンテーションで取り除き、同様の手法でマグネタイト溶液をさらに2回、Degas水で洗浄します。次に、マグネタイト溶液をエルレンマイヤーフラスコに移します。硫酸ナトリウムをスパチュラ数杯分加え、混合液を撹拌して溶液を乾燥させます。その後、減圧します。混合液を1 µmのろ紙でろ過してください。ロータリーエバポレーターの水槽温度を50 °Cに設定し、凝縮器には24 °Cの水を循環させます。次に、ろ液を50 mLの蒸発フラスコに移し、真空条件下で適度な回転速度にてヘキサンを2時間蒸発させます。ガラスバイアルを用いて、マグネタイトゲルを40 mgずつ6つの分注量に回収します。各分注量に対して個別にコーティングと洗浄を行います。プラスチックビーカーにゲルの分注量1回分と、酢酸エチルに溶解した40 mLのPLGAを加え、混合物を10分間超音波処理します。次に、ビーカーに80 millilitersのonic F1 27を加え、すぐにミキサーの高設定で7分間乳化させます。これにより、これらのナノ粒子は超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）となります。溶液を1 literの脱イオン水で希釈し、ドラフトチャンバー内で1時間超音波処理します。その後、溶液の隣に強力な磁石を置き、溶液を穏やかに撹拌して、磁石にSPIONを回収させます。水溶液をデカンテーションし、ビーカー内にS接ぎ木体を残します。S接ぎ木体を水で3回洗浄し、その都度撹拌します。計6つの分注量すべてでコーティングと洗浄が完了した後。S scionを単一のガラスバイアルに回収します。細胞標識の準備として、spy on溶液を凍結乾燥機で一晩凍結乾燥させます。まず、pyonを40 mg/mLの濃度でPBSに懸濁し、30分間超音波処理を行います。次に、ほぼコンフルエントの状態にある細胞が入ったフラスコに、細胞培養液1 mLあたり5 µLの濃度で溶液を添加します。フラスコを揺らして溶液を均一に分散させます。細胞を16時間インキュベートします。37 °Cにて。培地を穏やかに吸引し、その後、細胞を2回洗浄します。PBSを用いて、磁気標識された細胞を実験に使用できます。塩化鉄(III)および塩化鉄(II)四水和物の水溶液を50 °C、1000 RPMで撹拌することにより、直径10 nmのマグネタイトナノ粒子を安定して作製することができます。粒子径の測定には、透過型電子顕微鏡（TEM）が推奨される手法です。高速乳化装置を用いてマグネタイトナノ粒子をPLGAでコーティングすることで、直径120 nmのPLGA-マグネタイト複合体を再現性良く得ることができます。これらの粒子の視覚化には、走査型電子顕微鏡（SEM）が用いられます。血流出内皮細胞を16時間ピオン（pyon）とともにインキュベートしTEMで観察した結果、ナノ粒子のエンドサイトーシスが確認されました。PLGA-マグネタイトナノ粒子は、細胞内または細胞質のエンドソーム内に蓄積している様子が視覚化されます。細胞内への鉄の取り込み量は、生存細胞を強磁性体植込み型医療デバイスに磁気的に捕捉させるのに十分なレベルに達しています。磁気ラベル化された内皮細胞は、非磁性ステントよりも高い割合で強磁性ステントに引き寄せられます。この手順を行う際は、ナノ粒子の純度と安全性を最大限に高めるため、その後の工程に先立ち、すべてのガラス器具および装置を徹底的に洗浄することが重要です。どの医療療法が細胞の特異的かつ制御された送達によって恩恵を受けるかといった追加の疑問に答えるために、磁気細胞標的化などの他の手法を実施することが可能です。この磁気標的化技術は、さまざまな生物医学的応用のための集中的な細胞送達の開発を可能にします。このビデオを視聴することで、超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成方法と、それらの粒子を用いて磁気標的化応用のために細胞を標識する方法について、十分に理解できるはずです。

cell-labeling-targeting-with-superparamagnetic-iron-oxide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

新しい幹細胞療法の評価のためにそれはin...

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。...

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。...

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

ここでは、強力な磁気モーメントと強い近赤外（NIR）吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。このプロトコルはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学アプリケーションのためのFc部分を介してナノ粒子への抗体結合が含まれています。...

Immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成

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細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

結核菌抗原の血清学的診断試験を改善するために、肺外結核を検出する超常磁性鉄ナノプローブを開発しました。...

超常磁性鉄酸化物ナノプローブの合成、特性解析、応用による肺外結核検出

ここで提示されるのは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおける非侵襲的間葉系幹細胞(MSC)の送達および追跡のためのプロトコルである。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、リアルタイムMRIを用いた鼻腔内送達に続くMSC標識および非侵襲的なインビボ追跡のための磁気共鳴画像(MRI)プローブとして採用されています。...

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

この研究では、特定の細胞を標的とする抗体を用いて磁性ナノ材料を生体機能化するためのプロトコルを提供します。その一例として、鉄ナノワイヤを用いてがん細胞を標的としています。...

磁性ナノ材料の生体機能化

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。...

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

学ぶ 超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成と細胞標識法。PLGA被覆した10nmマグネタイトナノ粒子を作製し、蛍光顕微鏡で標的細胞の可視化を行う。磁気標的化による細胞分離技術を習得できる。

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

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