Name: 前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶ前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析の簡易ワークフロー。レーザー捕捉顕微鏡解剖とリアルタイムPCR、in situハイブリダイゼーションを用いて、miRNAの定量化と局在解析を行う方法です。

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私たちは、原稿の準備と彼のサポートと支援のための博士ロジャーエリクソンに感謝します。 この作品は、 国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました （認可番号RO1CA177984; RO1CA138642）、前立腺癌（BX001604）のVAプログラムプロジェクト。

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または新鮮な凍結前立腺癌試料はSFVAMCから得ました。サンプルはSFVAMCで根治的前立腺切除術を受けた前立腺癌患者からのものでした。書面によるインフォームドコンセントがすべての患者から得られたものであり、研究はヒト研究に関するUCSF委員会により承認されました。代替的に、前立腺癌組織マイクロアレイは、商業的供給源から入手し、miRNAはISHによって分析のために使用しました。分析前立腺癌患者のための臨床病理学的およびフォローアップ情報を収集しました。 1.組織サンプル<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってH＆Eとのミクロトームや染色を用いて10μmの切片に前立腺癌組織サンプルをカットします。 </li><li>前立腺がん病巣の同定のための染色スライドだけでなく、隣接する正常な腺上皮を確認します。 注意：ボード認定病理医は、H＆E染色スライドとミリアンペアを確認する必要があります腫瘍および正常領域に対するRK。 miRNAのための後続のセクションのガイドが通常のエリア対腫瘍から分析するとマークされたスライドを使用してください。 </li></ol>定量的リアルタイムPCRによる2 miRNA発現解析注意：レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、（miRNAおよびmRNAを含む）全RNAを単離し、次のセクションで説明するようにTaqMan（登録商標）マイクロRNA発現アッセイを用いて、成熟miRNAのアッセイ：このワークフローは、以下の工程を含みます。 <ol><li> RNA抽出<ol><li>前立腺癌FFPE組織からのmiRNAの単離<ol><li>レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） 注：化学ヒュームフードの手順2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4を実行します。 <ol><li> LCMのための組織スライド（10μmのセクション）を準備します。 10分ごとに、（2×）キシレンに浸してDeparrafinize組織切片を、蒸留に続く段階的エタノール（100％、95％、90％、80％、70％）で各5分間、スライドをインキュベートすることにより組織を再水和水（5分）。 </li><li>再水和後、30秒間ヘマトキシリン​​で染色のセクションでは、続いて水。 </li><li>段階的なエタノール（70％、95％、90％、80％、70％）（各5分）およびキシレン（5分）に入れ組織。 </li><li>その後、ドライヒュームフード内スライドとは、顕微解剖用のLCM器に置きます。 </li><li>製造元の指示24に従ってLCMシステムとmicrodissectionsを実行します。病理医が前立腺がん病巣だけでなく、隣接する正常組織の同定のためのガイドとしてスライドをマークアップされた使用します。 70〜90ミリワットの電力で10〜20ミクロンの直径のパルスのレーザービームを使用してください。 </li><li> LCMキャップ上に赤外線レーザーパルスで関心領域をキャプチャします。サンプルあたりのmiRNA抽出に2-5キャップから細胞を組み合わせます。抽出したRNAの完全性を確保するために、すぐにmiRNAの抽出のために捕獲された細胞を処理します。 </li><li>代替的に、miRNAの抽出緩衝液中の溶解細胞（メーカーのプロトコールに従って）およびSTO-80ºCで溶解物の再。 </li></ol></li><li> LCMマイクロダイセクション組織からのmiRNA抽出と分析<ol><li>製造者の指示に従って市販のキットを使用して、顕微解剖FFPE組織から全RNAを抽出します。 注：レーザーキャプチャーmiscrodissectionからのRNAの収量は、典型的には低いです。したがって、RNAは、少量（20〜30μL）中に溶出し、製造業者の指示に従ってタックマンマイクロRNA発現アッセイを用いた発現プロファイリング（また、セクション2.2に記載されている）のために使用されます。成熟miRNAのリアルタイムPCR検出のための入力RNAの最適化は、溶出されたRNAの5マイクロリットルを各miRNA特異的逆転写反応のために最適であることを示唆しています。内因性の対照として、RNU48 / RNU24が使用されます。コントロール反応のために、溶出されたRNAの2μlの逆転写反応に使用されます。 </li></ol></li></ol></li><li>前立腺癌凍結組織からのmiRNAの単離<ol><li> Homoge乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で組織を粉砕することにより凍結切除した前立腺組織をnize。冷却されたスパチュラを用いてマイクロチューブにホモジナイズした組織を転送します。組織は簡単に転送することができるように均質化し、液体窒素中に浸漬することにより、同じ温度で、乳鉢/乳棒とへらを維持します。 </li><li>ホモジナイズした組織に商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬（組織を1ml / 0.1 g）を加え、室温で5分間インキュベートします。 注：商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬中でホモジナイズした組織は、数ヶ月間-80ºCで保存することができます。 </li><li>ホモジネート（0.2ミリリットルのクロロホルム/ mlの）にクロロホルムを加え、30秒間激しく振ります。 4ºCで20分間10,000×gで遠心分離し、3〜5分間、室温でサンプルをインキュベートします。 </li><li>新しい滅菌RNaseフリー1.5mlチューブに上部の水相を転送します。 </li><li>イソプロピルアルコールを等量加えます。 10マイルのために混合し、インキュベートnはRTでRNAをペレットに4ºCで20分間12,000×gで遠心分離しました。 </li><li>上清を吸引し、70％エタノール1mLでRNAペレットを洗浄します。 4ºCで10分間12,000×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を吸引。 5〜10分間室温で乾燥RNAペレット。 50〜100μlのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶解します。 </li><li>ナノドロップ分光光度計を用いてRNAの定量化を行い、バイオアナライザーとRNAの完全性を決定します。 10 NG /μlにRNA濃度を調整します。 PCR分析リアルタイム（2.2節）に続いてmiRNA-特異的cDNA反応のために10〜50 ngのRNAを使用してください。 </li></ol></li></ol></li><li> miRNA発現解析のための定量的リアルタイムPCR 注：以下に記載されるように、二段階RT-PCRプロトコルを用いて成熟miRNAをアッセイ。 <ol><li>逆転写（RT） <ol><li>製造者の指示に従い、miRNAの逆転写キットを用いてRNAからcDNAを逆転写。マイクロRNAアッセイおよびRTキットからのmiRNA特異的プライマーを用いて全RNAの10〜50 ngのを使用してください。コントロールとしてRNU48 / RNU24 / RNU6Bを使用してください。 （分析miRNAの豊富さに応じて）1:10 5次のステップで説明するように、リアルタイムPCR検出に使用します。cDNAの1を希釈します。 </li></ol></li><li>成熟miRNAの検出のためのリアルタイムPCR <ol><li>製造者の指示に従い、高速ユニバーサルマスターミックスを用いてマイクロRNAアッセイを用いてcDNA試料からPCR産物を増幅します。 RNU48 / RNU24 / RNU6Bコントロールにサンプルを正規化します。高速リアルタイムPCRシステム上の遺伝子発現の相対的変化を計算するために、比較Ct（閾値サイクル）メソッドを使用します。三連で各サンプルを分析します。 </li></ol></li></ol></li></ol> in situハイブリダイゼーション （ISH） では 3. miRNA発現解析<ol><li>組織の前処理<ol><li>ミクロトームを用いてFFPE前立腺癌組織ブロックから5μmの切片をカットします。 </li><li&gt;は1時間56℃でスライドをインキュベートすることにより、組織切片を固定してください。 注：スライドは、miRNA分析のために数週間室温で保存することができます。 </li><li> 15分ごとに、キシレン（2×）でスライドを浸すことによって、組織をDeparrafinize。 </li><li>蒸留水（5分間）、続いて段階的なエタノール（100％（2倍）、95％、90％、80％、70％）中で5分間ずつスライドをインキュベートすることにより組織を再水和します。 </li><li>室温で20分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>それぞれ5分間、室温でPBS（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>予熱したプロテイナーゼKバッファー中で10分間（5 mMのトリス塩酸pH7.4の、1mMのEDTA、1 mMのNaCl）で、37ºCで10 / mlのプロテ​​イナーゼKでスライドを扱います。 </li><li>プロテイナーゼK処理後、30秒間、PBS中0.2％グリシンを有するスライドをすすぎます。 </li><li> 5分間室温でPBS（1×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 15分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。 </li><li>スライドをすすぎで5分間、PBS。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーション<ol><li>加湿チャンバー内55ºCで3〜4時間、プレハイブリダイゼーション溶液でスライドをプレハイブリダイズします。加湿チャンバーを維持するために、50％ホルムアミド/ 50％5×SSCに浸した組織ラボワイプを使用してください。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液中の20〜50 nMの濃度で5 &#39;ジゴキシゲニン標識プローブを使用してください。 、miRNA特異的プローブ（20〜50 nM）を、小さな核RNA U6コントロールプローブ（20 nM）を希釈して4分間90ºCでの熱、氷の上に置き、冷ハイブリダイゼーション緩衝液（2-4 NG /μLを氷に追加）。 </li><li>プローブ特異的ハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベート、ハイブリダイゼーション溶液（プローブ+ハイブリダイゼーション緩衝液、スライドあたり100μl）を追加し、プレハイブリダイゼーション溶液を除去（ハイブリダイゼーション温度= Tmのプローブ-21ºC）。加湿チャンバー（50％ホルムアミド/ 50％5×SSC）でハイブリダイゼーションを行います。 </li></ol></li><li>洗浄工程<ol><li> 45ºCで10分間の2×SSCでスライドを洗浄します。 </li><li>ウォッシュトン彼は45ºCで10分間1.5×SSCでスライドします。 </li><li> 20分ごとに37ºCで0.2×SSCの（2×）でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で1〜2時間、1×ブロッキング溶液でスライドをインキュベート</li></ol></li><li>発見<ol><li> 1でスライドをインキュベート：100 PBSを1-4時間、または一晩、4ºCでAP結合抗ジゴキシゲニン抗体を希釈しました。 </li><li> 10分ごとに、室温でPBS（3×）でスライドを洗浄します。 </li><li> 5分ごとに室温でアルカリホスファターゼバッファー（100 mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）とスライド（2×）で洗浄します。 </li><li> 1-20時間室温で暗所でのBMパープルAP基質でスライドをインキュベートします。 </li><li> PBSは、水中0.1％のTween-20および洗浄（2回）を含むでスライドを洗浄します。 </li><li>メディアのマウント水溶液を使用してスライドをマウントし、顕微鏡で調べます。 </li></ol></li></ol>

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著者らは財務上の開示を行っていない。

本稿では、アーカイブされたFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床組織中のmiRNA発現プロファイリングのための単純化されたワークフローについて説明します。前立腺癌では、いくつかの研究は、前立腺癌の開始、進行および転移におけるマイクロRNAの重要な役割を示唆しています。しかし、矛盾する結果は、多くの場合、miRNAを抽出するので、特定のmiRNA 22で得られると方法は広く異なって分析されています。前立腺癌の予後、診断および治療のための代替的な前立腺癌のバイオマーカーとしてのmiRNAの潜在的なアプリケーションをサポートする新たな証拠を考慮して、正確な臨床組織におけるmiRNA発現プロファイルを定量する必要があります。 我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーションにおける前立腺癌の臨床検体の分析。このワークフローの中で、我々はmiRNAの抽出のための既存の方法を最適化し、表現は、Taqによって分析しますRT-PCRおよびISHベースの男プライマーは、LNAプローブによって分析します。ワ...

前立腺がんは男性の癌関連死亡率の主要な原因の一つである一般的に診断男性悪性腫瘍です。米国では、推定220800新たな症例と27540人の死亡は2015年1に報告されます。 前立腺癌は、腫瘍が無痛または非常に積極的であることができcourse-非常に可変性疾患を有する不均質な疾患です。前立腺癌の臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療​​2のために現在使用されている方法/バイオマーカーの不足によってもたらされています。現在のスクリーニング方法は、前立腺生検3に続く前立腺特異抗原（PSA）試験及び直腸指診（DRE）が挙げられます。前立腺特異抗原（PSA）は、有意に臨床管理及び改善された生存率4に革命をもたらした最も広く使用されている前立腺癌のバイオマーカーです。しかし、LACを含むPSAの固有の制限のために特異性、PSAに基づくスクリーニングのkは診断の上、および疾患の治療の上につながっています。このビューでは、集中的な取り組みは、特に疾患の攻撃を予測し、より良い治療法の決定に4,5を駆動することができる、別の前立腺癌バイオマーカーの探索に向けられています。過去数年にわたり、マイクロRNA（miRNA）は、有望な代替前立腺癌バイオマーカーとして浮上しています。 マイクロRNA（miRNA）は、同族のmRNA標的の3 &#39;非翻訳領域（UTR）との配列特異的相互作用を介して転写後の遺伝子発現を抑制する小さな非コードRNAの進化的に保存されたクラスを構成します。これは、mRNAの&gt; 60％が6のmiRNAの標的を保存していると推定されます。 miRNA遺伝子は、遺伝子間領域内またはタンパク質/非タンパク質コード遺伝子のイントロン7またはエクソン内に位置しています。これらの遺伝子は優先的プリマに、RNAポリメラーゼIIによって転写されますヘアピン状のステムループ二次構造を形成RYのmiRNA（数キロベースの長いPRI-miRNAは、）。これらのpri-miRNAは、細胞質に輸送し、さらに成熟miRNA（18〜25ヌクレオチド長）8-10に加工された前駆体のmiRNA（プレmiRNAは、60〜75ヌクレオチド長）に加工されています。 miRNAは、増殖、発生、分化およびアポトーシスを11などの主要な細胞プロセスを調節します。研究では、前立腺癌12-15を含む種々のヒト悪性腫瘍におけるmiRNA発現プロファイルの広範な調節不全を示唆しています。 miRNA発現プロファイルは、広く原発性および転移性前立腺癌において異常調節されることが報告されています。改変されたmiRNAの発現は、前立腺癌の進行、攻撃性とのmiRNA 12,14,16-19の予後の可能性を強調再発とリンクされています。証拠の成長体は、miRNAが、前立腺癌の発生、発達、進行中の重要な機構的な役割を果たしていることを示していますイオンおよび転移。全体的に、miRNAは、前立腺腫瘍12の層別化に正常組織および癌組織と援助とを区別することができる前立腺癌の診断および予後のための有望な代替のバイオマーカーを浮上しています。また、miRNAは、前立腺癌20に対する有効な治療薬の開発のための重要な標的です。 その小さなサイズと、内因性RNase活性に対する抵抗性のために、miRNAは、容易に、ホルマリン固定組織21及び22の前立腺生検で検出することができる安定したバイオマーカーです。さらに、miRNAの発現プロファイルは、凍結およびホルマリン固定組織で比較されており、21強く相関することが見出されています。しかし、前立腺癌臨床組織においてmiRNA発現プロファイリングはしばしば重くRELI前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてなど、エラーをサンプリングする、腫瘍の不均一性に起因するmiRNAの開発を間質汚染を挑戦され臨床組織における自分の正確な検出にES。ここでは、アーカイブFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床検体でmiRNA発現プロファイリングのための私たちの研究室で使用される単純化されたワークフローについて説明します。我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーション旧得、より定量的な情報および組織の配列に潜在的なmiRNAバイオマーカーの発現差異を可視化するため、後者で、臨床検体の分析。このワークフローの中で、私たちはFFPE、凍結前立腺組織からのmiRNA抽出のための既存の方法論を最適化し、式はロックされた核酸（LNA）を用いたin situ ハイブリダイゼーション技術でのTaqmanプローブベースのmiRNA RT-PCRおよびmiRNAの分析により、プローブ23をベース。 LNAベースのプローブは、DNAまたはRNA-ベースのプローブと比較して増加した感度と特異性を提供し、すべてのmiRNA配列のロバストな検出を可能に関係なく、GC含量のもdiscriminaを許可miRNAファミリーのる。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、miRNAバイオマーカーの発見を加速する可能性を提供し、後者で、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>あるいは、Life TechnolgiesのArcutus Xtシステムを使用することもできます。&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 高速リアルタイムPCRシステム&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA 逆転写キット&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR マスターミックス&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr>U6 <td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td>BM Purple AP基板<td>用DIG標識LNAプローブ</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションソリューション&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング溶液&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP標識抗ジゴキシゲニン抗体</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤&nbsp;</td><td>ベクターラボラトリーズ&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール(グアニジンイソチオシアネートフェノール試薬)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ<a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td></td><td>Statlab SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>スタットラボ</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

前立腺癌臨床組織におけるmirna発現解析

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

前立腺癌（PCA）臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療のために現在使用されているバイオマーカーの不足によってもたらされています。近年では、マイクロRNA（miRNA）は、前立腺癌の診断および予後のための有望な代替バイオマーカーを浮上しています。しかし、前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてのmiRNAの開発が重く、臨床組織におけるそれらの正確な検出に依存しています。 miRNAは、多くの場合、腫瘍の不均一性、サンプリングエラー、間質汚染などのmiRNAは、組み合わせのを使用して、アーカイブFFPEや新鮮凍結前立腺癌臨床検体で分析するために、この記事の目的は、単純化されたワークフローを記述することであるために挑戦された前立腺癌臨床検体で分析します定量的リアルタイムPCR（RT-PCR）、およびインサイチュハイブリダイゼーション （ISH）。このワークフローの中で、私たちは、FFPEからのmiRNA抽出のための既存の方法論や凍結前立腺TISSUを最適化ESおよび発現は、タックマン・プローブベースのmiRNA RT-PCRにより分析します。ベースのプローブ - 加えて、我々は、ISHのための最適化された方法は、ロックされた核酸（LNA）を使用して、前立腺組織においてformiRNA検出を分析記述する。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。

RT-PCRによってLCM原発性前立腺癌臨床検体におけるmiR-203の発現プロファイリング分析（図1） RT-PCRは、LCM原発性前立腺癌組織中のmiR-203の相対的発現の分析及びコントロールとして使用したSAINI ら RNU48 15で説明したようにマッチした隣接する正常領域を行いました。以下の表は、隣接する正常組織に比べて前立腺癌腫瘍組織における相対的なのmiR-203の発現を要約したものです。 RT-PCRによるのmiR-383の発現の比較は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション対に解析する（ 図2）のPCa組織を顕微解剖前立腺癌組織は、いずれかの顕微鏡下で顕微解剖した、またはRT-PCR、続いLCMに供した腫瘍組織中のmiR-383発現の腫瘍サンプルにおける一致隣接する正常tissues.Relative...

ここでは、定量的リアルタイムPCR(RT-PCR)およびin situハイブリダイゼーション(ISH)を用いたアーカイブされたホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)、または新鮮凍結前立腺癌(PCa)臨床組織におけるマイクロRNA(miRNA)発現分析のための簡略化されたプロトコルについて説明します。

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

このビデオの目的は、定量的リアルタイムPCRとNC 2ハイブリダイゼーションを組み合わせ、さらにロッキング核酸（LNA）ベースのプローブを導入することで、保存された前立腺癌臨床検体におけるマイクロRNA解析の簡略化されたワークフローを解説することです。まず、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて前立腺癌のFFPE切片から組織を分離し、続いてマイクロRNA抽出を行います。次に、2ステップRT-PCRを用いて組織内のマイクロRNAを定量し、C 2ハイブリダイゼーション解析において、ジゴキシゲニン標識LNAプローブとBM purpleで検出されるAP標識抗体を用いてマイクロRNAの局在化を行います。提示された結果は、前立腺がんの臨床組織におけるマイクロRNAの発現を示しています。これらの手法を用いることで、近年、マイクロRNAは前立腺がんの有望な代替疾患バイオマーカーとして注目されています。しかし、前立腺腫瘍の不均一性や間質汚染などの混在要因があるため、前立腺がんの臨床検体におけるマイクロRNAの発現解析は困難な場合が多くあります。私たちは過去10年間にわたり、microRNAおよび非コードRNAの分野で研究を行ってきました。私たちは、前立腺癌の異なるステージにおけるmicroRNA発現の条件を最適化しました。microRNA発現は前立腺癌の臨床結果と相関するため、診断および予後予測のバイオマーカーとして利用できると考えています。また、ナノ粒子技術を用いることで、マイクロRNAを前立腺癌の治療に利用できると考えています。前立腺癌における正確な発現プロファイリングは、病変の不均一性によって妨げられることが多々あります。これは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を用いて純粋な良性または悪性の上皮細胞を回収し、間質細胞との混在を減少させることで、部分的に克服されます。アーカイブされたFFP組織のLCMを行い、続いてmicroRNA発現プロファイリングを実施する方法は、感度が高く、信頼性があり、費用対効果に優れた相補的な手法であることが分かっています。C2ハイブリダイゼーションで最適化することで、microRNAがどこで発現しているかを確認できます。組織を採取して10 micronの切片を作成した後、ドラフトチャンバー内でパラフィンを除去します。スライドをキシレンに10分間2回浸し、その後、段階的な含水アルコール浴に移して組織を再水和させます。次に、ヘマトキシリン染色を30秒間行い、スライドを水で洗浄します。再水化した組織を、70%から始まる別の段階的なアルコール系列で処理します。次に、切片をキシレンに5分間浸し、自然乾燥させます。乾燥したスライドをレーザーキャプチャーマイクロダイセクション装置に移します。病理医がマークしたスライドを用いて、前立腺癌の病巣および良性/正常領域を特定します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションの実施については、製造元のガイドラインに従ってください。ビーム幅を10～20ミクロンに設定し、70～90ミリワットでパルス照射します。赤外線パルスを使用して、目的の領域をレーザーキャプチャーマイクロダイセクション用キャップに回収します。各サンプルについて、キャップの内容物を回収チューブに加え、直ちにマイクロRNA抽出用の細胞処理を行います。製造元の指示に従い、市販のキットを用いて全RNAを抽出します。RNAを20〜30 µLのヌクレアーゼフリーウォーターで溶出させ、迅速に次工程へ進みます。次に、マイクロRNA特異的プライマーを用いて、逆転写反応キットでcDNAを合成します。10〜100 ngの全RNAを用いて各反応をセットアップしてください。回収後、cDNAを5〜10倍に希釈し、濃度を約1〜20 ngにします。次に、コントロールとしてfast universal master mixを用いたマイクロRNAアッセイにより、CD NAからPCR反応を3連（triplicate）でセットアップします。遺伝子発現の相対的な変化を算出するためのテンプレートとしてRNU 48を使用してください。比較CT法（comparative CT method）を用いて、厚さ5 µmの組織切片の前処理を開始します。スライドを56°Cで1時間固定します。次に、室温に設定したキシレン浴に15分間ずつ2回浸し、脱パラフィンを行います。その後、段階的なエタノール系列を用いて組織を再水和させます。最後に、組織を水に5分間浸します。次に、室温で4% PFA含有PBSを用いて組織を20分間固定します。PBSで5分間の洗浄を2回行い、固定液を洗い流します。続いて、あらかじめ加温したproteinase Kバッファーに10 µg/mLのproteinase Kを加え、組織を37 °Cで10分間インキュベートします。処理後、スライドを0.2% glycine含有PBSで30秒間すすぎ、室温のPBSで5分間洗浄します。その後、4% PFAに再度15分間浸漬させます。さらに、PBSでの5分間の洗浄を2回繰り返し、固定液を洗い流します。組織のハイブリダイゼーション準備が整いました。まず、後続のステップで溶液が組織切片上に留まるよう、パスペンを用いて組織の周囲に疎水性の円を描きます。その後、組織を前ハイブリダイゼーション緩衝液中で55 °Cで3〜4時間インキュベートします。タオルを50%ホルムアミドと50% 5X SSC溶液に浸し、加湿したチャンバー内でこの操作を行ってください。次に、diggen標識したmicroRNA特異的プローブおよびコントロールプローブを調製します。最終的に20〜50 nanomolarの希釈液を作成しますが、まずは最終希釈に必要な量より25 µL少ないハイブリダイゼーションバッファーでプローブを希釈します。続いて、プローブを90 °Cで約4分間加熱します。次に、プローブを氷上に置きます。最後に、氷冷したハイブリダイゼーションバッファーを用いてプローブをさらに希釈し、最終濃度を20〜50 nanomolarにします。ここで、各スライドに100〜400 microlitersのプローブ溶液を適用します。その後、適切なハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベートします。翌日、洗浄手順に従い、SSC溶液による洗浄を数回行います。ブロッキング後、スライドをブロッキング液に入れ、室温で1〜2時間インキュベートします。組織を、PBSで希釈した1:100のAP標識抗原抗体液に浸します。室温で1〜4時間、または4°Cで一晩反応させます。その後、PBSで10分間ずつ3回洗浄し、余剰な抗体を除去します。室温にて、PBSバッファーで5分間の洗浄を2回行います。その後、スライドをBM purple（AP基質）に浸し、室温・遮光下で1時間から20時間インキュベートします。翌日、0.1% Tween 20含有PBSでリンスし、BM purpleを除去します。その後、水で2回洗浄し、microRNA抽出およびR-T-P-C-Rの既述のプロトコルに従って水溶性封入剤で封入します。前立腺癌組織および隣接正常組織においてmicroRNA 2 0 3を検討したところ、相当数の組織で相対的な発現量に変動が認められました。コントロールとしてRNU 48を使用しました。前立腺癌組織を顕微鏡下でマイクロダイセクションするか、あるいはLCMに供し、その後に相対的なmicroRNA-383の発現を解析しました。腫瘍組織における発現を、対応する正常対照群と比較しました。LCMで調製した組織では、マイクロRNAの発現をより確実に検出できました。Cでは、正常組織および骨転移を有する前立腺癌組織において、microRNA-203に対する2回のハイブリダイゼーションを行いました。U6によるものです。染色の強度に基づき、RNA検出をコントロールとして用いた。各組織の細胞におけるmicroRNA 2 0 3の発現を1から4の段階でスコア化した。その結果、骨転移組織において発現が統計的に低いことが示された。このビデオを視聴することで、前立腺がんの臨床検体におけるmicroRNA発現を、ワークフロー全体を通じてどのように評価するかについて、十分に理解できるはずです。全工程において、RNAフリーの環境を維持することが極めて重要です。また、パラホルムアルデヒドおよびサリンを取り扱う際は非常に危険を伴うため、本手順の実施中は、常にドラフトチャンバー内での作業や個人用保護具の着用などの予防措置を講じてください。この手順に続き、統計解析を行い、マイクロ発現パターンが疾患の臨床病理学的変数と相関しているかを評価します。これにより、特定のマイクロRNAの発現に予後予測または診断における潜在的な能力があるかといった重要な疑問への回答を得ることができます。最適化されたC2ハイブリダイゼーションプロトコルは、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイに適用可能です。また、最適化を行うことで、他の組織型にも本プロトコルを適用できます。

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Medicine

医学

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。...

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。...

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

このプロトコルの目標は、下流のRNA分析のために不均一な前立腺組織から純粋な細胞型の集団を分離する効果的な方法として、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用することです。...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。...

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

この修​​正された抽出プロトコルは、組織病理学的組織ブロックへの関心をより正確に対象地域からのRNAとDNA収量を向上させます。...

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

アーカイブの組織、腫瘍の不均一性や新鮮凍結組織標本の欠如の核酸分解することができます世界中の病理学研究室でがん診断サービスに悪影響を。本稿では、乳癌を分類する多重磁気ビーズ アッセイを用いたバイオ...

乳房癌のアーカイブ材料を用いた多重 RNA に基づく発現アッセイの最適化

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。...

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析の簡易ワークフロー。レーザー捕捉顕微鏡解剖とリアルタイムPCR、in situハイブリダイゼーションを用いて、miRNAの定量化と局在解析を行う方法です。

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

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