蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

本手順の全体的な目的は、耳毒性物質をマウス蝸牛の正円窓ニッチに戦略的に直接投与することにより、内耳損傷モデルを確立することである。まず、皮下脂肪層を剥離し、筋肉組織を慎重に退けて鼓室骨膜を露出させる。次に、正円窓ニッチが露出するまで骨片を徐々に除去し、鼓室骨の蓋を開ける。

次に、中耳および正円窓ニッチ内の可視流体を完全に乾燥させ、正円窓ニッチを最適に可視化します。最後のステップは、STA茎動脈を損傷させないように、選択した耳毒性物質で正円窓ニッチを満たし、その後、薬剤の仕様に従って適切に繰り返し投与を行うことです。最終的に、聴性脳幹反応を含む機能的手続きおよび形態学的評価を用いて、蝸牛微細構造の選択的な保存または変性を実証します。

本手法（当社の既存の測定法）の主な利点は、この手順によりラウンドウィンドウニッチが十分に露出され、選択的なオートトキシックエイジング（自己毒性老化）を直接適用できることです。本手法の利点には、内耳の微細構造の維持、全身毒性の回避、迅速な効果の発現、特定の蝸牛細胞型の選択的な変性、および再現性のある結果が含まれます。この手法は、ラット、モルモット、ジャービルを含む他の齧歯類にも、わずかな変更を加えることで適用可能です。

それでは、私の研究室でこの手順を実演します。動物研究のすべての側面は、適切な機関動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従って実施されました。ここで述べる脊椎のすべての実験手順は、サウスカロライナ医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに基づき承認されました。

承認された手順に従って動物を麻酔した後、術前鎮痛剤を0.1 mg/kg投与します。ここではブプレノルフィンを使用します。動物が手術可能な麻酔深度に達していることを確認してください。

ここに見られるように、マウスにおいて足指へのピンチに対する反応はなく、右書き反射（writing reflex）は消失しているはずです。選択した耳毒性物質を含む水溶液0.2 millilitersを、先端を鈍化した28 gaugeの0.5インチ針を装着した1 milliliter結核用注射器に分注し、注射器内の空気を排出します。気泡があると薬剤を適切に投与できない可能性があるためです。バリカンを用いて、頭頸部境界線から肩帯にかけての領域の被毛を除去します。

背側の正中線から下顎角に向かって外側に除毛範囲を広げます。適切に剃毛するため、使い捨てカミソリを使用してください。施設内のプロトコルに従い、処置部位の皮膚を滅菌します。

ここで、Betadineとエタノールを交互に用い、2分間円を描くように局所的に塗布します。動物の体温を維持するため、体の下に小型のヒートパッドを設置します。36〜38 °Cに設定し、ヘッドホルダー装置で動物の頭部を固定します。

動物の鼻背部に小さなクランプを緩やかに締め、固定します。ヘッドホルダーがU字型の関節アームの中央にしっかりと接続されていることを確認します。右側へのアクセスを確保するため、U字アームの左側に幅1 cmのロッドを固定し、左側のヘッドレストとして使用します。

マウスをヘッドホルダーにしっかりと固定した後、左側臥位になるように回転させます。処置の間、マウスが安定し、頸椎に過度な捻転ストレスがかからないよう、平らな手術台の上に体を注意深く配置します。手術野の上に、10倍および20倍の拡大が可能な手術用顕微鏡を配置します。

顕微鏡下の拡大視界で手術を行う際、両手を術操作に使用できるよう、顕微鏡がハンズフリーで位置を保持できることを確認します。鋭い剪刀またはメスを用いて、耳介頭側溝から約6〜8mm caudal側に、1〜1.5cmの耳後切開を加えます。下層の血管構造を保存するため、深く切除しすぎないように注意してください。

皮下脂肪層を鈍的に剥離します。腹側から内側に向かって剥離する場合は、外頸静脈を傷つけないよう注意してください。出血が生じた場合は、吸収性ゼラチン、スポンジ、またはコットンペレットを使用して止血します。

脂肪層を適切に分割した後、頸部筋肉を露出させます。重要な指標となるのは、CTO乳突起の後縁を回る第11脳神経の小さな神経枝です。耳介に向かって視野を広げるために、自己保持式リトラクターを用いてCTO乳突筋本体を後方に緩やかに牽引します。

筋肉体を包んでいる透明な筋膜をそっと分けます。また、耳下腺と外頸静脈を反対方向にそっと牽引します。CTO Masto筋体を十分に牽引すると、鼓室骨の内側、より深層にある頸筋の停止部において、鼓室骨骨膜の光沢のあるドーム状の構造が見えてきます。

胸鎖乳突筋に沿って乳突洞が視野に入ります。両手の手技を用いて、CTO乳突洞を開いたままにするための自己保持式リトラクターを配置します。バイポーラ電気凝固器を慎重に使用して骨膜を剥離し、下層の骨を露出させます。次に、ピンセットまたは耳科用キュレットを使用して骨膜を慎重に持ち上げ、周辺方向へ押し広げることで、乳突洞のドーム部を完全に露出させます。

次に、1または2 mmのテーパーチップを備えたベルト駆動式歯科用ハンドドリルを使用し、鼓室骨に2 mmのパイロット穴を慎重に開けます。ドームの側方縁と、鼓室の吻側にかけて伸びる視認可能な不透明線との間に穴を開けてください。続いて、その近くに2つ目のパイロット穴を慎重に開けます。鼓室骨の開窓を容易にするため、精密ピンセットを用いて、鼓室骨を背側および側方方向へ取り除きます。

ブルロックキャップの直下に位置するEDL動脈を穿刺しないように注意してください。薬剤を投与する前に、中耳への過剰な液体の流入を防ぐため、除去する骨の量を最小限に抑えてください。ペーパーウィックを使用して、乾燥した骨が見えるまで、中耳および円窓ニッチ内のすべての可視液体を除去します。

このステップはプロトコルの成功に不可欠です。最大倍率で領域を確認しながら、1 mLのツベルクリン注射器に装着した細径針を用い、耳毒性薬剤を1滴、正円窓ニッチに直接滴下して完全に満たします。薬剤を正円窓ニッチに10分間静置させてください。

初期段階では、ドライニッチの底部にある小さな光の反射が、鈍くかすんだ液面のメニスカスに置き換わるのを注意深く観察してください。これは、ニッチが適切に満たされていることを示しています。10分が経過したら、薬剤を完全に吸い取り、同じ薬剤を新しく塗布してください。

塗布回数は使用する薬剤によって異なります。曝露時間は通常30分から60分の間です。最終塗布後、ブルはキャップをせず、ピンセットを使用して手術部位の軟部組織を閉じます。

手術部位の皮膚を閉鎖するために、4-0の非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用します。動物を、敷材と軟らかい餌を備えた清潔なホームケージ内で麻酔から回復させます。屠殺および成体C-B-A-C-A-Jの蝸牛組織採取まで、動物を毎日観察してください。

雌雄両性のマウスに、耳毒性物質であるHeptエタノールを投与した。円窓経由で拡散させた。Hept投与マウスでは、術後1日から14日にかけて、生理食塩水を投与した擬似手術（シャム手術）群の対照動物と比較して、BR閾値の有意な上昇が観察された。

エタノールは、テストしたどの周波数においても有意な閾値シフトを示しませんでした。緑色で示された内向き整流性カリウムチャネルに対する免疫染色は、蝸牛構造の損傷と回復を可視化するための間接的な手法として用いられました。染色強度は、theria vais内で著しく低下していました。

術後1日目において、細胞アポトーシスに典型的な核の完全性の喪失および染色体の凝縮が、赤色で示された核対比染色で認められました。ストラチス処理した耳の領域におけるカリウムチャネル染色の強度を定量化したところ、最初に低下が見られ、その後、hept曝露から7日後にコントロールの強度に向けて有意な回復を示し、その後も回復が継続することが実証されました。習熟すれば、適切に実施することでこの手順は30分から60分で完了できます。

血中の凝縮液や間質液による自家毒性剤の不本意な希釈を避けるためには、追加の曝露や補充が有効である可能性があることを覚えておくことが重要です。しかし、この手法は蝸牛動脈を誤って損傷させたり、ラウンドウィンドウ・ニッチに間質液を混入させたりするリスクを高める傾向があるため、注意して行う必要があります。この低侵襲の手法により、繊細な生化学的プロセスの詳細な研究が可能となり、in vivo での蝸牛再生能の解明を目指した我々の研究を推進する上で極めて重要な役割を果たしてきました。