TCR-のpMHCが結合を測定しますその場で FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

このビデオでは、T細胞抗原受容体とペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体(PMHC)との間の動態を測定する方法を示します。これは、T細胞と平面支持脂質ブレイとの間の免疫学的シナプス内にあるC 2です。タンパク質産生の重要な側面と、カルシウムフラックス測定による脂質ブレイの機能的完全性の検証について簡単にご案内します。脂質ブレイの調製方法や単一分子蛍光顕微鏡のセットアップ方法の詳細については、並行して寄稿したJournal of Visualized Experimentsの論文を参照してください。その後、バグおよび単一分子レベルでのファーストまたは共鳴エネルギー伝達測定の実施方法と分析方法について詳しく説明します。

シナプスT細胞受容体PMHC結合の動態を推測し、全体的なアプローチで使用されたフレットベースの戦略を説明するために、ここでは抗原に結合するT細胞受容体またはTCRの結晶構造から始めます。ここでは、抗原に結合するT細胞受容体またはTCRの結晶構造、黄色と赤で示されているペプチド負荷MHC分子またはPMHC。また、57歳と名付けられたT細胞受容体β反応性抗体からの可変ドメインの一本鎖断片も導入します。定量的なfreベースの測定では、freドナー(この場合は一本鎖フラグメント)とfre受容体(PMHC)の両方を部位特異的な方法で標識することが必須です。

これは、未気味のシステインを導入することで組換えタンパク質に対して実現可能であり、システインはダニの結合型Fluor力に共有結合することができます。図のように、供給されたドナーAlexa Fluor 5 5 5またはサイド3を一本鎖フラグメントとフレットアクセプターに取り付けます。Alexaは、MHC結合ペプチドのC末端まで6、4、7、またはSI5を流します。

この複合構造に示されているインディ距離は約41オングストラムであり、最初の半径、つまり2つの染料間の最大エネルギー移動の半分の距離よりもさらに小さくなります。私たちの実験では、代理抗原提示細胞として平面ガラス支持脂質ビラールを使用します。これらはPMXC、アトリー分子B seven one、接着分子I chem oneで官能基化されています。

このようにして、イメージングは全反射蛍光モードで実行でき、界面に近接した蛍光力を照射し、細胞のバックグラウンドを大幅に低減します。フレットは、標識された一本鎖フラグメントTCRが層埋め込みPM hcsによって係合している場合にのみ検出可能です。これにより、T-C-R-P-M-H-Cの結合を視覚化し、Cの2つの適切に折り畳まれたヒスト遺伝子タクトの結合速度を計算することができます。

P seven oneおよびI chem oneの細胞外部分は、対応するBUCウイルスに感染した昆虫細胞培養物の上清から精製されます。精製は、ニッケル抗アロスアフィニティークロマトグラフィーから始まり、鉄交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーに続く3つのステップで行われます。HistoタグMHCクラス2ヘテロ二量体は、大腸菌で封入体として発現し、in vitroで摂氏4度でリフォールディングされ、酸化還元バッファーでの急速希釈によりスペースホルダーペプチドの存在下でリフォールディングされます。

スペースホルダーペプチドは、後でUV光にさらされることで切断されます。適切に折りたたまれたPMHC複合体は、その後、スペースホルダーを精製し、濃縮しました。ペプチドは切断され、pH 5.2で蛍光ペプチドと置換されます。

最終製品はスタンドサイズが精製されます。一本鎖フラグメントは、段階的な透析によりin vitroでリフォールドされ、サイズ精製された大腸菌の封入体として、未気味のシステインで発現されます。次に、未気味のシステインを介して、処女結合染料で標識され、サイズが精製されます。又。

すべての組換えタンパク質は、最終的に50%グリセロールを含むPBSに対して透析され、1ミリリットルあたり1ミリグラムのタンパク質に濃縮され、摂氏マイナス20度で長期的に開始されます。レシオメトリックURA two dyeを使用して、T細胞の細胞内カルシウムレベルを測定し、脂質ブレーの刺激力を確認します。T細胞ブラストにURA 2:00 AMエステルをロードします。

この化合物は、AMモティを介して細胞内に侵入しますが、その後、AM部分を切断するエステラーゼの作用によって細胞内に閉じ込められます。フィラを約300万個のT細胞に、最終濃度5μm/リットルで加えます。細胞を24ウェルプレートから新しいチューブに移し、室温で30分間インキュベートします。

カルシウムとマグネシウム、およびアルブミン1%を含むHanks緩衝生理食塩水を含むイメージングバッファーで細胞を一度洗浄します。細胞内カルシウムをモニターするには、自動UV対応倒立顕微鏡システムを使用します。タイミングプロトコルを開始し、顕微鏡ステージに焦点をあてた官能基化脂質二重層にロードされたT細胞を少なくし、一定の時間間隔で、340ナノメートルおよび380ナノメートルのUV光で励起されたDIC画像と2つの蛍光画像を取得します。

二重層接触を行った直後、T細胞は、実行の15分後にURA 2比によって読み取られたカルシウムレベルの上昇を採用します。すべてのPMHC抗原を飽和させるブロッキング抗体を細胞に加えます。その結果、細胞内のカルシウムレベルは非活性化状態のものに低下し、これは後で参照として機能します。

ブロッキング抗体の存在レベルが非活性化状態を反映する値に減少するとすぐに、フレット測定のために1つに正規化しますが、T細胞は各実験のためにTCR反応性一本鎖フラグメントフレットプローブで染色する必要があり、約100万個の細胞をチューブに移し、400Gでスピンダウンします。ペーパータオルで内壁に貼り付けます。これにより、先に述べた約30マイクロリットルの最小インキュベーション量が保証されます。

フレットプロペは、1ミリリットルあたり1ミリグラム、マイナス20°Cで50%のグリセロールの濃度で保管されます。これは、アレクサ、インフルエンザの5、5、5、5、3のいずれかで特異的に標識された部位であり、0.3マイクロリットルのプローブで1つのジトタンパク質比で細胞に投与される。ペレットを数回慎重にフリックし、細胞を氷上で20分間インキュベートします。

細胞を氷冷イメージングバッファーで洗浄します。この洗浄手順を一度繰り返します。低温でのインキュベーション、遠心分離保存により、T細胞が蛍光プローブにさらされている間、蛍光プローブが内部化しないようにします。

これにより、バックグラウンド蛍光が上昇する可能性があります。さらに、T細胞は、ビラール含有チャンバーを顕微鏡ステージ交換前に置く前に、洗浄および保管中に低温でプローブを失うことはありません。イメージングバッファーを連続して使用するPBSは、二重層が空気にさらされるのを防ぐと、二重層が破壊されるため、絶対に避けます。

細胞の背景を減らすために、芝生の照明を採用しています。このために、励起ビームを全反射が発生する臨界角度に配置します。励起をオフにし、ワイドライトをオンにして、T細胞をltecチャンバーに追加し、脂質ブレーに落ち着かせます。

励起のスイッチを入れ、芝以外の照明に焦点を合わせます。細胞膜は、芝のすべての焦点面で光軸に沿ったリングとして観察され、二重層と接触している基底膜のみが観察されます。上の焦点面は励起されなくなり、したがって見えなくなります。

タイミングプロトコルは、PMHCおよびTCRをイメージングするための赤と緑の励起パイルから始まり、続いて赤の漂白パルスでP-M-H-C-Fアクセプターをアブレーションします。F脂肪受容体漂白後のTCRを画像化するための緑色パルスと、F受容体アブレーション実験を検証するための赤色パルスは、1番目と2番目の緑色パルスの間の遅延が可能な限り短いサブ秒の時間スケールで実行されます。任意選択で、DICイメージは最初に得ることができる 2色イメージの分割は供給されたドナーおよび供給されたアクセプターのチャネルの同時検出を可能にする。

摂食アクセプター励起は、T細胞シナプスにおけるP HCSの蓄積を示しています。このプレブル イメージは、pmcs の存在を確認し、既に TCR が PMHC 結合を媒介していることを示しています。エキサイティング。フィードドナーは、両方のチャネルで画像を生成します。

供給されたドナーチャネルの信号は、F受け入れられたチャネルへのエネルギー伝達により、強度がある程度減少します。フレット受理チャネルの信号は、供給ドナーのフレットブリードスルーとフレットアクセプターの交差励起で構成されています。いずれにせよ、この画像は解析には使用されません。

現在のプロトコルで。高速漂白剤パイルが追従し、Fで受け入れられたすべてのフルオロ力を排除します。フレット許容漂白後のF Fedドナー画像の強度は、フレチャネルへの強度損失なしにより高いレベルに回復するようになりました。

次のフレットアクセプターの期待は、完全なF脂肪アクセプターの漂白を検証します。シナプスを拡大して、栄養ドナーの回復を定量化してみましょう。平均バックグラウンド強度を、freアクセプターに関係なく一定に決定します。

次に、光退色により、シナプスの平均強度と代表的なTCRクラスターの平均強度が決定されます。次に、フレットの歩留まりは、fアクセプターアブレーションの前後の差を正規化することによって計算されます。この例では、シナプス全体で16%フレット、代表で26%フレットを測定します。

TCRクラスターフレット収率は後でTCR占有率に変換され、2次元シナプス解離定数の単一分子データが生成されます。単一分子F脅威実験のためのシナプスTCRペプチドMHC結合の動力学を推定するために私たちに役立ちます。以前と同じ試薬と手間戦略を使用します。

ただし、単一のTCRと単一のペプチドMHCとの間の相互作用を実際に観察するために、次の基準を満たすことを選択します。単一分子 fre の候補イベントは、口語的に single fre アクセプターまたは fre ドナー分子と話す必要があります。ここでは、単一のPMHCをFre受容体分子として使用して、観察されたFreイベントの単一分子の性質を検証しますが、その逆の合理性

高いボタンとフレッドのドナーと低いボタンで供給されたアクセプターを使用することは確かにオプションです。我々は通常、514ナノメートルおよび647ナノメートルの励起、光逐次および反復ドナーおよびアクセプター励起に接触するT細胞を514ナノメートルおよび647ナノメートルの励起で曝露し、その後に遅延時間が続きます。これは、実験の要件に応じて変更できます。

励起から数ミリ秒以内にシングルダイ検出に十分な強度の蛍光シグナルを得るには、1平方センチメートルあたり1〜5キロワットの範囲の高励起電力密度を適用する必要があります。光退色により、目に見えるPMHCフレットアクセプター分子の数は、1平方ミクロンあたり30個以上の標識PMCSを含む二重層で単一のフレットアクセプターフルオロ力が区別できるレベルまで急速に減少します。ここでは、全体のタイム ラグが 42 ミリ秒の場合の例を示します。

赤い丸でマークされた1つのフレットイベントが、2番目と3番目のタイムポイントに表示されます。これは、緑色の円でマークされた単一のS5分子と共局在します。この例では、観測可能なフレット イベントのトレース長は 2 で、表に示すように、約 128 のトレースでさらに単一分子のフレット トレースを収集します。

次に、緑色の数字で示されているようにトレースの相補累積和を計算し、示されているように正規化して正規化された値をプロットし、モノ指数関数で近似します。期待値は 1.5 時間枠を少し超えています。この値は、TCRペプチド、MHC結合および光退色に依存して、これら2つの寄与を区別できるようにし、したがって、期待値は少なくとも3つの異なる時間で計算されなければならない。

ラグは、それぞれのタイムラグに対してすべての期待値をプロットし、データポイントをここでの寿命を含む示された関数に適合させます。 2.12秒とPHOTOBLEACHING f Fredの期待値。Fフレッド後のドナー回復は、ここに示されているように、そしてより詳細に示されているように、許容可能な漂白剤であり、免疫学的シナプス内で有効な2次元解離定数をわずか数ステップで決定するために使用できます。

ここでは、T-C-R-P-M-H-C結合が最も顕著なTCRエンゲージメントとTCRクラスターに分析を集中させます。示された測定値から明らかなように、F FREDの収量は大きく異なります。個々の TCR クラスターの場合。

F fredの利回りに比例係数Cを掛けると、TCR占有率が生じます。PMHCにバインドされたTCRの数とそれらの総数Cとの間の比率を説明する用語は、特定のFREペアのセットと採用されているFREシステムについて一度決定する必要があります。このプレゼンテーションの終盤では、例えば、TCR R反応性一本鎖抗体フラグメントとMHC結合ペプチドのC末端に特異的に設定されたSI 3とSI 5を含むCの測定方法について詳しく説明します。これは、約2つのシナプスに相当し、2次元解離定数は、Aと呼ばれるTCR占有率と脂質ブレイ上に存在するpmcsの初期密度から計算できます。

表示される関係は、質量行動の法則から導き出されたもので、このムービーに付属する記事で詳しく説明されています。この例では、pmcsの初期密度は1平方ミクロンあたり30分子になります。私たちは、T細胞シナプスで有効な2D kdsの分布に到達し、中央値は1平方ミクロンあたり約34分子です。

オンレート分布は、シナプス2D KD分布と、ここで対応するオフレート(摂氏24度での単一分子フレットトレース分析によって決定された毎秒0.41)から計算できます。中央値は、1分子あたり秒で約0.01平方ミクロンです。要約すると、TCRとペプチドMHCの間のF脅威測定により、C 2の反応ダイナミクスを記述するすべての速度論的パラメータを包括的に分析できます。

この方法論は、原則として、細胞細胞の認識に不可欠である可能性があるため、他の受容体リガンド相互作用の分析に一般化できます。最後に、脂肪収量をTCR占有率に変換するために必要な定数Cを実験的に導出する方法について説明します。この手順は一度だけ実行する必要があります。

決定された定数Cは、その後、同じフレットシステムと同じフルオロ4が適用されるすべての実験に使用できます。この手順では、アクセプター光漂白後のドナー回収を通じて個々のTCRクラスターで測定されたフレット収量を、増感されたフレットチャネルで検出された対応する強度値に本質的に中継しました。前に説明したように、フレットの歩留まりは、フレットアクセプターアブレーションの前後に背景補正されたフレットドナーチャネル画像から決定されます。

増感されたフレットチャンネルは、FドナーチャンネルとXおよびYに位置合わせし、背景を補正する必要があります。フレッドドナーはブリードスルーし、フレッドはここに示すように交差励起を受け入れます。フレッドドナーのブリードスルーとフレッドの交差励起の受け入れを補正する方法の詳細な説明は、記事に記載されています。

このビデオでは、各 TCR クラスターについて、補正されたフレット画像と対応する補正されたフレットドナー画像のバグ信号の比率を計算します。単一フレットドナーと単一分子フレットイベントの補正された平均シグナルを決定し、比率を計算します。TCRの占有率は、両方の比率を乗算することによって導き出されます。

次に、個々の TCR クラスターについて決定されたフレットの歩留まりを、TCR 占有率に対してプロットします。次に、次に示すように、Cは線形回帰によって決定されます。この例では、それはラウンド2になります。

このビデオを見た後、タンパク質官能化脂質二重膜を単一分子蛍光顕微鏡と組み合わせて使用し、PMHCとTCRの間のシナプス結合速度を測定できるようになるはずです。タンパク質産生、T細胞の標識、最終的なフレット測定など、必要なすべてのステップについて議論されました。さらに、画像解析を詳細に示し、T細胞の活性化曲線とフレット値をもたらしました。

最後に、キネティック・オン・オフ・レートの決定の基礎となる方法論が示されました。原理的には、他のシナプス受容体リガンド相互作用を決定するために類似のアプローチを用いることができるが、適切な修正が必要であることが証明されるかもしれない。