Name: TCR-のpMHCが結合を測定しますその場で FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: 学ぶFRET顕微鏡法を用いて免疫学的シナプスにおけるTCR-pMHC結合動態を測定する方法です。単一分子レベルで結合親和性、解離速度、結合速度を定量的に解析し、T細胞抗原認識の分子メカニズムを解明します。

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MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金（FWF、J3086-B11）と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSとJHは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS13-030）によってサポートされていました。

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

in situでのタンパク質-タンパク質相互作用を測定することは、TCRのpMHC-11に結合するような低親和性相互作用を扱う場合は特に、非常に望ましいです。オン速度、ならびにこのような相互作用の安定性を大幅に結合が起こるような状況下で、特定の影響を受けるためです。低侵襲FRETベースのイメージング手法は、原理的にはこのように、このようなタスクに最適です、まだ最初に克服しなければならないハードルの数を含みます。携帯自家蛍光によって発生するノイズは、測定の感度を制限するため、最小限に保たれるべきです。 TIRF顕微鏡は、理想的な選択13-15のタンパク質で飾ら平面ガラスサポート脂質二重層の形で、非常によく12本必要性を提供していますが、ガラススライドの官能化を必要とします。一部reconstitutiveアプローチのもう一つの利点は、組換え二重層常駐FRETパートナーがずっとmとすることができるということです鉱石は容易に細胞表面に発現するタンパク質で可能であるよりも小さく、明るい蛍光体で定量的な部位特異的かつ合理的な方法でラベルされました。以前に2テストされたようなTCRは、組換えのscF V S、T細胞認識に影響を与えないものでタグ付けされています。また、SLBのタンパク質組成物は、例えばpMHCsの密度およびアクセサリー因子の選択は、1つの特定のニーズに調整することができます。我々は以前、刺激pMHCsの様々な密度で実験を行っているが、 オフ 2D-Kおよび2D-K D 2で有意差を検出していません。 これまでのところ、ここでのMHCクラスII分子の認識は、主に両端が開いているので、蛍光体の結合のためのリンカーを含む、より大きなペプチドを収容し、それらのペプチド結合溝、の性質上、のみを扱ってきました。いくつかのケースでは、このようなアプローチは、MHC CLAを標識するために働く可能性がありますSS私は16分子が、大きな注意が実験での使用を確認するために取られるべきです。表面プラズモン共鳴によってインビトロで測定されるT細胞増殖アッセイ、ならびに動力学結合のpMHC-TCRを介して測定することができる抗原に対するT細胞の感受性を、リンカーおよびフルオロフォアの添加によって影響されてはなりませんペプチド。代わりに、私は自分自身を分子MHCクラスは、重鎖（未発表の観察）の配列内の不対システインの導入と部位特異的に標識することができます。 適切な分子プローブを使用して任意のシナプスのタンパク質 - タンパク質相互作用は、原理的には、本明細書中に記載の方法で研究することができます。このようなプローブは、 例えば、のscF V Sまたは設計されたアンキリンリピートタンパク質（ダルピン）17、一価であるべきであり、関心の相互作用に影響を与えることなく、安定的に彼らの標的に結合する必要があります。もちろん、構造informationが合理的なプローブ設計のための非常に望ましいですが、絶対に必要ではありません。 FRETパートナーの新しいペアを確立するときは、最初に一括でFRETを記録し、分析することをお勧めします。標識結合の部位は、FRETシグナルを最大化するために、また、測定されたFRET収率がインター染料距離に基づいて異なることを確認するために、大幅に変化させることができます。システムが最適化されると、単一分子は、信号が10〜30％に多量のFRETパートナーのラベルを制限し、単一分子は照明の分野で解決可能になるまで少量のFRETパートナーを漂白することによって記録することができるFRET。 少なくとも最後にではなく、それはのSLBは、生理的形質膜のすべての側面一部に近似するがないことに留意すべきです。このような膜の曲率と柔軟性、ドメイン区画、細胞骨格の再編成および細胞運動だけでなく、表面発現膜タンパク質の高いさまざまな資質としては、SLBので表されていないが、Tに影響を与える可能性があります彼は調査中で処理します。多くの努力は、TIRFイメージングにアクセスできない生理的シナプスにおける単一分子分解能でのタンパク質 - タンパク質相互作用をモニタリングすることを可能にするの画像診断法を確立するために投資する必要があります。

T細胞が抗原を認識する方法のより基本的な理解は、T細胞とAPCとの間に形成された免疫学的シナプスの中に、すなわち、適切な場所で見ることが必要です。ここでは、分子の結合反応速度のみセルラー力、膜構造と膜タンパク質との間の横方向の相互作用だけでなく、シナプス特有の幾何学的制約を含む細胞パラメーター、に大きく依存するが、関連する相互作用パートナーの固有の生化学的特性によって決定されていません3。生化学的アプローチは、それらが関連するシナプス膜の少なくとも一つの破壊を必要とするような分解能が制限されます。この理由のためにFRETベースのイメージング法は、抗原pMHCs 2 TCRの結合をモニターするために開発されました。ここでは、T細胞は、組換えとサイト特異的に標識されたTCRβ反応性単鎖抗体フラグメント（SCFのV）で装飾され、計画に直面しています<html>蛍光標識された抗原ペプチド、共刺激分子および接着タンパク質を搭載したMHCクラスII分子を保有ARガラスサポート脂質二重層（のSLB）。シナプスは、色素で標識したTCRと全反射蛍光（TIRF）顕微鏡によってバルクおよび単一分子レベルで監視することができFRETの色素標識のpMHC結果、間の結合。 この記事では、T細胞のシナプスをアッセイするためのSLBを利用する機能的T細胞のカルシウムフラックスアッセイを介してそれらの完全性を検証する、バルクでFRETの測定を行い、単一分子の感度で、取得したデータを分析する方法を詳細に説明します。勧告は、二層の官能化のために必要な適切に準拠したタンパク質を生産することに提供されています。適切なTIRF顕微鏡の二層形成とセットアップに関するより具体的な情報については4を背中合わせに発表され、追加のパブリックアクセスJoveの出版物を参照してください。 10トン &quot;&gt;のSLBの自然官能化のSLBは、容易に（短い：POPC、90から99%）2脂質1-パルミトイル-2-オレオイル-SN-gylcero -3-ホスホコリンを含む単層小胞（SUV車）から生成することができ、1,2- dioleoyl- SNを -グリセロ-3 - {[N（5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸]スクシニル}（ショート：DGS NTA-Ni系、1〜10％）。 SUVが隣接する平面二重層4を形成するために、きれいなガラススライド上に広げました。 DGS-NTA-Niは、合成NTA-Niの含有頭部基（ 図1A）とポリヒスチジン媒介複合体形成を介してポリヒスチジンタグ融合タンパク質を固定するのに役立ちます。安定な会合のために1は、一般的に12個のヒスチジン（ICAM-1-12H、B7-1 -12H）（ 図1B）を含むつのタグでネイティブの膜貫通ドメインおよび接着タンパク質のICAM-1および共刺激分子B7-1の細胞質尾部を置き換えます。ペプチド負荷クラスII分子IE kは2つの膜埋め込 ​​み（α及びβ）のポリペプチド鎖を含みます秒。両鎖の膜貫通/細胞質ドメインは、6つのヒスチジンそれぞれ（α6Hβ6HまたはIE K -2x6H IEのk）を含むタグと交換する必要があります。代替、12個のヒスチジンとα鎖を拡張し、タグなし（12Hの βの0HまたはIEのk個の -12HαIE kに上昇を与える）β鎖の細胞外ドメインを残すように、満足のいく結果（ 図1B）を生じさせます。 pMHCsの部位特異的標識それは意味の平衡結合定数にFRET測定利回りを変換できるようにするために、化学量論的および部位特異的のpMHCにラベルを付けることが重要です。これは、組換えヒスチジンタグ付きMHCクラスII分子2,5のペプチド結合溝にロードされた合成ペプチドの化学的標識化によって達成することができます。ペプチドは、WとしてT細胞エピトープの全ての残基を含みますエルシステインに続く短いC末端リンカー（GGS）として（例えば蛾シトクロムc（MCC）ペプチドANERADLIAYLKQATK- GGSCに、リンカーは太字で示されています）。このシステインは、マレイミド色素誘導体を用いた化学量論的にペプチドを標識するために使用されます。この時点で、特別な注意は、システイン含有ペプチドを定量的色素結合の検証に専念する必要があります。ペプチド - 色素付加物のHPLC精製は、推奨およびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって従うべき有します。 （染料なし）ペプチド遊離体に対応する任意の記録質量は不完全なラベリングを反映しています。これが本当であれば、標識が定量的とみなされるまで、HPLC精製ペプチドは、色素標識の連続した​​ラウンドに供されるべきです。この方法は、試料のイオン化のためにレーザー照射することを含むようにMALDI-TOF質量分析を避けるべきであることに留意されたいです。ペプチド質量を読み出すため、underrepreされる前に、この処理は、添付の敏感な蛍光色素分子を分解する<html>色素結合のsents度。 価単鎖F V断片を用いた細胞結合TCRの間接まだサイト特異的標識それはまだ部位特異的に生細胞の表面関連タンパク質をセルに色素を結合するために挑戦しています。表面露出のTCRは、このハードルを克服するために、TCRβ -反応性モノクローナル抗体H57-197 2の遺伝子からの一価の単鎖バージョン（SCF V）が構築されています。 TCRとの複合体中のこの抗体の結晶構造は、合理的に（対応するFRETパートナーの染料が結合している）MHC関連ペプチドのC末端に近接したセリン残基をするために置換されたバージョンを設計することができシステイン残基。この変異体システインはその後、色素コンジュゲート（ 図2）のための受容体として機能します。 FRETを記録するための方法論NT &quot;&gt;バルクFRET値は、選択されたインター色素距離との関係を検証することが最も適しているとこのTCR-のpMHC結合システム 2で測定効率をFRET。また、バルクのFRET測定は、シナプスTCR-のpMHCの親和性（で定性的および定量的な差を明らかに下記参照）とプロトコルセクション3.2。FRET効率を定量化するための様々なアプローチは、文献6で導入されました。この記事では、FRETを介して記録されています （a）は、ドナーアクセプター漂白後の回復、及びビアを （b）は、FRETアクセプター放出を感作。 最初の方法は、（a）は、容易に光退色することができるFRETアクセプター、むしろ光安定であり、ドナーの使用を必要とします。それに加えて、光退色アクセプターはもはやドナー蛍光を消光することが可能であることを保証しないことが重要です。同じ検出チャネル（ドナー）を定量化するために使用されるように、補正は係数ありませんD全く色収差がこの方法論は、シンプルで信頼性の高いレンダリングする、考慮しなければなりません。しかし、定量的な測定は、同一試料の場で繰り返すことはできませんし、FRETの変化が経時的に記録することはできません。 （アクセプター漂白の前に）最初のFRETドナーおよび（FRETアクセプター漂白後の）第二FRETドナー画像取得の間を通過する時間を最小限に分子拡散または高速漂白工程をを目的としなければならない細胞の運動性によって引き起こされる影響を回避します。これは、照明及び漂白時間を最小限にするために、FRETアクセプターの励起波長の強力なレーザ光源を使用することを推奨しています。 これに対し、（b）は、感作されたFRET発光測定のアプローチにFRETドナーが励起され、FRETアクセプターの発光は、FRETアクセプターチャネル中で観察されます。 FRETアクセプターシグナルの変化は、赤方偏移アクセプターチャネル（トンにFRETドナーの時間が、放射にわたって記録することができますermed bleedthrough）と正確に決定し、記録FRETアクセプターチャネルから減算する必要がドナーの励起を経由して、アクセプター相互励起をFRET。このためのFRETドナーに対応するFRETアクセプタ画像が空間的に整列されなければなりません。 単一分子の検出（SM）のイベントをFRET 励起源、感度カメラとノイズ減衰全反射顕微鏡としてレーザーを使用すると、単一のフルオロフォアの蛍光は簡単に時間をかけて追跡することができます。同様に分子間smFRET事象の検出のために真です。しかし、合併症は、FRETドナーbleedthroughとFRETアクセプターの相互励起によって引き起こされる可能性があり、したがって、細心の注意がsmFRET実験における蛍光体濃度を調整する際に注意しなければなりません。 以下に提供されたプロトコル（プロトコル部4）でTCRは少量でFRETアクセプタとして高い豊富とのpMHCにおけるFRETドナーとして選ばれました。 FRを減衰させます十分に、蛍光のSCF Vと非蛍光のSCF VとTCRの90から70パーセントとTCRの10〜30％を飾るbleedthrough ET供与。それは単一分子FRETチャネルと共焦点であるため、ここではFRETアクセプターチャネルは単一分子チャネルとして選択されまし​​た。これはsmFRET検証の基礎であり、FRETアクセプターの単一分子とsmFRETイベントを揃えることができます。 smFRETの測定によってシナプスオフ速度の抽出両方のFRETドナーの光退色とアクセプターをFRETは、単一分子からの相互作用の半減期を抽出する際、考慮される必要はありトレースをFRET。単一のドナー-アクセプター対Nのような外見（0）の開始時に観察可能なFRET-信号の数は、受容体-リガンド複合体のアンバインドと光退色の両方で時間をかけて削減されます。次のように与えられた時間N（T）での複合体の生存数は数学的に表現することができます。 光退色項exp（-t /τ 漂白剤 ）で、時間t はすなわち 、漂白のみ照射中に発生する観測の数 Nとの積（なぜなら、非連続的な、個別の観察モードの病気照明時間tで記述されています）。運動項のEXP-（T /τ オフ ）内の時間tは、観測値の数の積であり、nおよび単一のFRET観察のための時間t 遅れ （ すなわち 、動力学的ア ​​ンバインドが継続的に行われます）。式1は、のように表すことができます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" />用語τ 漂白剤/τ 病気デ漂白は、その指数関数のために発生し、期待値&lt;N 漂白剤 &gt;のように定義されるまで、観測数をcribes。次のように方程式2を簡略化することができます。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> 時間 tの後に観察FRET事象のフレーム数N（t）の期待値は、&lt;N（T 遅れ ）&gt;直接実験から決定されます。これは、実験で選択された観察（T 遅れ ）、τ オフ（k offをオフ速度の逆数）のための未知の値の間に設定可能な時間に依存し、漂白が発生する前に、観測数の期待値を&lt;N 漂白します &gt; 。 したがって、Tのうちの少なくとも二つの値のための期待値&lt;N（T 遅れ ）&gt;の計算<sub&gt;ラグは&lt;N 漂白 &gt;とオフ τの実験的な決意を可能にします。 FRETベースの測定によってシナプスの2D-K D値を抽出します TCR占有すなわち A、バウンドのTCRと合計のTCRとの比率を測定し、シナプスの2D-K D値を決定する中心的です。式（4）によると、この用語は、限り、FR​​ETアクセプターとしてのTCRは、FRETドナーおよびpMHCsとして機能するようにして測定FRET収率に正比例します。 <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> = TCR占有で、C =変換係数 Cは、FRETシステムに依存し、フルオロフォアを用いた、定数です。以下に示すように、実験的に決定することができます。式5ときによれば、2D-K Dに変換することができます。前の二重層のT細胞を添加するTCRリガンドの初期密度が知られています。これは、SLB接続タンパク質の高移動度であり、またのSLBは、リガンド2のほぼ無尽蔵の貯蔵器を提供するからです。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [のpMHCの初期 ]と=のpMHCの初期密度の前のT細胞の添加に式では4と5一つは簡単に、TCRのpMHCとの間のシナプス2D-K D を決定することができます 。これは、最も確実に、アクセプター漂白（プロトコルセクション3.1を参照）の後、ドナーの回復に基づいて、FRET測定で行われます。 しかし、C私はFRET FRET強度との関係を測定し、TCRの占有率Aを決定しなければならない（バックグラウンドについて補正し、FRETドナーおよびアクセプタbleedthroughクロス励起FRET）。このため、あります単一のTCR関連FRETドナーフルオロフォア（例えば、Cy3またはAF555）SMの平均蛍光強度との比Rを知る必要があります私は、ドナーと単一分子の平均強度をFRETのイベントは、私がFRET SM FRET。 Rは、蛍光検出のために使用される質問、発光フィルターとカメラ内FRET系に依存します。 TCRは、直接式（6）に従って決定することができる人数<img alt="式6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = SMと私はFRETドナー / SMをFRET RはにつながるH57 scFv-たCy3 / Cy5ののpMHC-システムのための1.45のように決定しました。 私は1.45•/バルクI TCR-のCy3をFRET =バルク TCR占有a及びFRET歩留まりとの関係は、FRETドナーによって決定することができる復旧アクセプター漂白後のY。線形近似の図4A【選択勾配に示すように、この両方のパラメータの数TCRマ ​​イクロクラスターのために互いに対してプロットされているため（式4）からの変換係数Cを示しています 。 1.995までのCy3 / Cy5のFRETのpMHC・システムと、（b）適用顕微鏡システムの構成- 図4（a）に示すように、Cは、（A）H57のSCF Vの金額。 TCRは、以下のように容易に推定することができる人数： TCR占有A = 1.995•得FRET

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10000713</td><td>細菌発現</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10227402バ</td><td>キュロウイルス産生用昆虫細胞培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン(ロンザ)入り昆虫-XPRESS L-グルタミン(ロンザ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10564038</td><td>バキュロウイルス発現用昆虫細胞培地</td></tr><tr><td>Sf9細胞</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>ウイルス用細胞 11496-015</td><td>細胞生産と拡張</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>細胞 ポテイン発現用</td></tr><tr><td>LBメディア</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10000713</td><td>細菌発現</td></tr><tr><td>セントラメイトシステム</td><td>ポール</td><td></td>タンパク質<td>の大量集中</td></tr><tr><td>セントラメートカセット 10kDaカットオフ</td><td>ポール</td><td>OS010T12</td><td>タンパク質の大量集中</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>タンパク質濃縮</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>タンパク質濃縮</td></tr><tr><td>Amicon 攪拌限外ろ過細胞モデル 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>タンパク質濃縮</td></tr><tr><td>&Auml;kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>Gilson HPLC システム</td><td>Gilson</td><td></td><td>精製蛍光色素結合ペプチド</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 & micro;m粒度、21.2*250mmカラムサイズ</td><td>蛍光色素結合ペプチド</td>の<td>Agilent</td><td>A6000250X212</td>精製</tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 & micro;m粒径、21.2*50 mm カラムサイズ</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>蛍光色素結合ペプチドの精製</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 カラム&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>28-4064-13</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>ギルソンHPLCシステム</td>フル<td>オロクロム共役ペプチドの</td><td>ギルソン</td><td></td>精製パー</tr><tr><td>シュートXRs C18、5&マイクロ;m粒度、21.2*250mmカラムサイズ</td><td>蛍光色素結合ペプチド</td>の<td>Agilent</td><td>A6000250X212</td>精製</tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 & micro;m 粒子サイズ、21.2*50 mm カラムサイズ</td><td>蛍光色素結合ペプチドの</td><td>A6000050G212</td><td>精製</td></tr><tr><td>Cy3 マレイミド</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td>変異<td>型非対システインによる部位特異的タンパク質標識</td></tr><tr><td>Cy5 マレイミド</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>変異型非対システインによる部位特異的タンパク質標識</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>変異型不対システインによる部位特異的タンパク質標識</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 マレイミド</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>変異型不対システインによる部位特異的タンパク質標識</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, 細胞透過性</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>細胞標識用カルシウム感受性色素</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>fura-2 amを溶解</td></tr><tr><td>ハンクのバランスの取れた塩溶液とカルシウム/マグネシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10225362</td><td>イメージングバッファー</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン凍結乾燥粉末</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A2153</td>イメージング<td>バッファー用サプリメント</td></tr><tr><td>14-4-4S 抗体</td><td>アフィメトリクス eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>H2-I-Ek (5c.c7, 2B4, AND TCR で認識) のブロッキング抗体</td></tr> 5 <tr><td>ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m Ultrafree-MC遠心フィルターユニット</td><td>EMDミリポア</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター0.2&micro;m</td><td>ミリポア</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>テトラスペック マイクロスフェア、0.1 &micro;m 蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>fura-2系カルシウム測定用顕微鏡&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>(1分子)FRET測定用顕微鏡</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>詳細については、Axmann et al.による並行JoVEの貢献を参照してください。</td><td></td></tr><tr><td>planarが担持した脂質二重層</td><td></td><td>の詳細については、Axmannらによる並列JoVEの寄与を参照してください。</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640、L-グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T細胞培地</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>マウスインターロイキン-2組換えタンパク質</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>研究用ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>Origin (分析プログラム)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>2つのパラメータの非線形フィッティング(tauoff、[ntlag])</td></tr></tbody></table>

tcr-のpmhcが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; fretベースの顕微鏡アッセイを使用して

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T細胞は、抗原提示細胞（APCs）の表面上のMHC分子（pMHC）に埋め込まれたペプチドの形で抗原を認識する際に、非常に特異的で効果的です。これは、結合をin vitroで測定すると、T細胞抗原受容体(TCR)が通常、抗原に対して中程度の親和性(μM範囲)を発揮するにもかかわらずです1。T細胞抗原感受性に寄与する分子的および細胞的パラメータを考慮して、生T細胞のシナプス内で発生するTCR-pMHCのin situ結合と、抗原提示細胞(APC)2の細胞膜を模倣する人工的で機能化されたガラス支持平面脂質二重膜(SLB)をモニターする手段として、顕微鏡ベースの方法論が開発されました.測定は、TCRとpMHCに付着した青方偏移と赤方偏移の蛍光色素との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいています。FRETの効率は色素間距離の6乗に反比例するため、FRET信号を使用してシナプスTCR-pMHC結合を視覚化できます。顕微鏡法の高感度アプローチは、単一分子FRETイベントの検出をサポートします。これにより、シナプスTCR-pMHC相互作用の親和性とオフレートを決定し、次に結合のオンレートを補間することができます。類似のアッセイは、天然環境における他の受容体-リガンド相互作用を測定するために適用できます。

FURA-2カルシウムを介した細胞内カルシウムの記録染料、ならびに刺激効力を確認するために、その後の細胞解析、ひいてはのSLBの機能は、 図4に示されている。明らかになるように、カルシウム濃度は、T細胞の上昇（として発現ベースラインはすぐに、すぐに彼らは刺激するSLBに落ち着くように）1である正規化FURA-2 340nm / 380nmの比。カルシウムレベルがまもなくTCR結合とするT細胞活性化を終了からブロックpMHCs抗体を添加した後にベースラインレベルに戻ります。 図6は、（図4に示されている）FRET収率を測定するために使用され、2D-K D値を計算するのに役立つ受容漂白、後のFRETドナー回復を伴う典型的な実験を示しています。 FRET Aの迅速かつ完全な切除後、AF555を介しラベルTCRを表すFRETドナー強度の増加を、注意してくださいcceptor種（ここではpMHCsに関連したAF647）。また、明らかにFRETチャンネルに強い減少、 すなわち 、FRETドナー励起下でのFRETアクセプターチャネルは、FRETアクセプター漂白した後、あります。ほとんど見えない残りの信号は、ドナーbleedthroughをFRETに相当します。個々のTCRマ ​​イクロクラスターまたは全体のシナプス内の収率は示さ測定された強度値（ 図6B）に基づいて計算されるFRET。 図7には、2つの時間枠に表示単一分子FRETイベントの軌跡と時間経過を示しています。導入に上記で概説したように、このような挙動は、両方の結合シナプスTCR-のpMHCの崩壊と光退色が原因で発生します。これらの2つの寄与とを区別するために、実験的な取得時間フレームは、期間中に変化させることがあります：光退色は一定のまま、FRETイベント軌道長さの変化が唯一の結合速度によって引き起こされます。 W tracelengthsの定量、<html> HICH は 、図7に示されるオフ速度及び漂白の計算のための基礎を形成する、3の表1に提供されています。 2D-K D Sの決意は、FRETドナーラベルのTCRのためのバルクのFRET利回りの記録が必要です。実験的に推定された定数 C（ 図4）を使用すると、TCRのマイクロクラスターまたは全体のシナプスについて測定FRETの収量は、TCRに占有変換することができ、 すなわち 、のpMHC-従事し、総TCRの割合（ 図4C） 。前のT細胞の添加にSLBに存在する既知のpMHC密度で、値は、シナプスの2D-K D値（ 図4D）を決定するために適用することができます。オン率は質量作用の法則を用いて計算することができる（ 上の 2D-K = 2D-K / 2D-K D をオフ ）を決定し、シナプスからオフ速度および2D-KD値。 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; 図1.平面ガラスサポート脂質二重層（SLB）システムの概要図。 （A）のSLBは、対応する脂質からなるPOPC（90から99までパーセント）と合成脂質DGSのNi-NTA（1-10％）で構成され、きれいなガラス表面は単層小胞（SUV車）で充電しているときに自発的に形成されています。 （B）は、一旦形成されると、そのようなのSLBは、T細胞のためのAPCとして機能するように、B7-1タンパク質およびICAM-1接着タンパク質共刺激、pMHCs由来の可溶性ポリヒスチジンタグ化細胞外部分で官能化することができます。 SLBの準備の詳細についてはAxmann ら 4を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> その場で結合TCR-のpMHCを定量する2.再フェルスター共鳴エネルギー移動に基づくアッセイ。 （A）H57単鎖フラグメントと複合体TCRの複合構造のpMHC係合は、本明細書に記載のFRETベースのアプローチを示しています。約41Aは、FRETを受けて対応する二つの蛍光団を分離する短い距離に注意してください。フルオロフォア-マレイミドのためのアクセプター部位は、緑と赤で示されている。（B） インサイチュでのTCRのpMHC相互作用を検出する原理が示されています。のみのscF Vは特定の複合体を形成するTCRとpMHCs（ここではIEのk）を 、-decorated、測定可能なFRETシグナルを生じさせる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &quot;/&gt; 図のscF Vの単量体およびペプチド負荷IE kの-2x6H分子に最終ゲル濾過工程生じさせる3.クロマトグラム。X軸はミリリットルでの保持容量を表し、Y軸は任意の単位で280 nmで（AU）の吸光度を示します。（A）H57のscF Vの部位特異的にアレクサフルオロ555マレイミドで標識したタンパク質は、（ステップ1.2.5）からの未反応染料を分離するために、S75クロマトグラフィーに付しました。間隔14〜15ミリリットル（破線）を保持するために対応する画分を標識した単量体H57のscF Vを表しています。UV-切断可能なANP空間ホルダーペプチドと複合体を形成する分子は、UV照射、部位特異的にアレックスと一緒にインキュベートされていた-2x6H（B）IEのK 647マレイミド標識ペプチド、最終的に遊離ペプチド（ステップ1.1.2.4）からタンパク質を分離するためにS200クロマトグラフィーに供しました。破線の間隔が適切に折り畳まれ、単量体pMHCsが含まれています。（A、B） </strong&gt;は0.7ミリリットルのサンプルは、ラム酒（0ミリリットル点）の開始時にカラムに適用しました。集めた画分を濃縮しました。タンパク質対色素比は（-20°で保存）、PBS / 50％グリセロールに対して透析前にphotospectrometryによって決定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> 図4の決定2D-K D SとS の 2D-K。（A）、アクセプター漂白及びTCR占有が実験的に測定したドナーの回復によって決定されるように、FRETの収量との相関関係。セクション4.2で説明したように、TCRの占有率は、個々のTCRマイクロクラスターについて決定することができます。データの線形適合が線で表示されている、の傾きは、TCRとの比Cに等しいです。占有とFRET収率。Cが採用FRET系のための一定の特定およびフルオロフォア（ここでのCy3およびCy5）です。この例では、（B）1.988を得た収率データは、個々のTCRマ ​​イクロクラスターについて決定したFRET（N = 187、温度= 24℃）アクセプター漂白の供与体を介して回収。ヒストグラムの棒の下の数字は、区間内の上限値を示す。（A）で決定された定数 Cと測定されたFRETの利回りを乗じて（B）に示したデータの（C）変換 。バーの下の数字は、区間内の上限値を示している。（D）ヒストグラム（半対数、ベース= 4）個々のTCRマ ​​イクロクラスターについて測定した2D-K D Sの分布を示しました。中央値は、2D-K D が青色で表示されます。バーの下の数字は、（E）（D）に示すヒストグラム。区間内の上限を示すint型に変換されました-histogram 上のOA 2D-K（半対数、ベース= 4）24℃（0.41秒-1）のためのオフシナプスKを採用。値の決定の中央値の2D-Kが青色で表示されます。データはもともとHuppa らに出版された。2、ここに新しい形式で可視化されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> T細胞刺激およびイメージングのために使用のSLBの図5の機能検証。 FURA-2を搭載した（A）TCRトランスジェニックT細胞ブラストは、抗原pMHCs、ICAM-1およびB-7を保有刺激SLBに直面しました。携帯電話340 nmおよび380 nmで励起されたFURA-2排出量だけでなく、DIC画像を記録しました。示されるように、発光強度の比の値は34で励起0と380 nmのは、右側のパネルに表示されます。実験に抗体14分を遮断するのpMHCの添加は、休止T細胞のそれに匹敵する細胞内カルシウムレベルが減少した。（B）刺激のSLBを接触させ、T細胞の平均FURA-2比の典型的な時間的プロファイルを特徴としています抗体媒介遮断後の抗原を奪われた非活性化T細胞またはT細胞に比べ2~4倍高い細胞内カルシウムの立ち上がりによる。グリーンの円は、（A）に示した時点を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> 図6は、バルクFRETアクセプター漂白後のFRETドナー回収を通して測定される収率をFRET。 <strオング&gt;（A）図は、典型的なシナプスのFRET測定の一例です。左側に、トップに表示されるように一連の画像は、FRETドナーとFRETアクセプターチャネル（ビームスプリッタの詳細については、Axmann ら 4を参照）を生じさせる放射ビームスプリッタを使用して取得されました。左DICの画像に示す線は、T細胞のシナプスの境界を示します。 （B）ならびにFRETアクセプター漂白（ステップ4）の後にFRETドナーチャネル中の強度の増加はFRETアクセプターチャネル内の強度の損失を注意個々のシナプス領域または全体シナプスために示されているように効率を定量化することができるFRET。検査のために、FRETアクセプター漂白前と後の画像は2つのルックアップテーブル（LUT、緑と物理学）を使用して示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </p&gt; <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> 図7.単一分子は、イベントが表示され、insingleステップを消え、完全に単一のFRETアクセプターフルオロフォアで整列されている。単一分子FRETイベントの時間経過が示されているFRET。画像は、裏面照射型EMCCDカメラを用いて得た。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> H57のscF V -AF555由来観察可能なFRETシグナルのオフ = 1 / K測定smFRET軌道からオフ τの決定図8（A）の正規化累積和は、（IEの&lt;認識5c.c7 TCRトランスジェニックT細胞ブラストを飾っSUP&gt; / K3-AF647は、4つの異なるタイムラグ（42ミリ秒、490ミリ秒、1007ミリ、1989ミリ秒）のため24℃）での観測の合計数の関数としてプロットしたK。単一指数フィット関数が。期待値&lt;N（T ラグ ）&gt;の負の逆数に対応を生じさせる（B） の期待値は遅延tの遅れに対してプロットし、&lt;N（T 遅れ ）&gt;式を用いて適合=τ オフ / {（τ オフ / &lt;N 漂白 &gt;）+ T 遅れ }τをオフに生成すると、&lt;nは漂白剤 &gt;。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

このビデオでは、T細胞抗原受容体とペプチド搭載主要組織適合性複合体（pMHC）間のキネティクスを、T細胞と平面支持脂質二重層との間の免疫シナプス内において測定する方法を説明します。また、タンパク質の調製に関する重要な事項や、カルシウムフラックス測定による脂質二重層の機能的完全性の検証について簡潔に解説します。脂質二重層の調製方法および単一分子蛍光顕微鏡のセットアップに関するより詳細な情報については、Journal of Visualized Experimentsに掲載されている我々の併設論文をご参照ください。その後、バルクおよび単一分子レベルでのフェルスター共鳴エネルギー転移（FRET）測定の実施方法とその解析について詳しく説明します。本研究の全体的なアプローチで用いたFRETベースの戦略を説明するため、シナプスにおけるT細胞受容体とPMHCの結合キネティクスを導出します。まず、青色で示したT細胞受容体（TCR）が、黄色と赤色で示した抗原であるペプチド負荷MHC分子（PMHC）に結合している結晶構造から開始します。また、AGE 57と呼ばれるT細胞受容体β鎖反応性抗体から得られた可変領域のシングルチェーンフラグメントも導入します。定量的なFRET測定を行うには、FRETドナー（本ケースではシングルチェーンフラグメント）とFRETアクセプター（PMHC）の両方を、部位特異的にラベル化することが不可欠です。これは、導入したシステインを介して、maleimide修飾された蛍光色素と共有結合させることで、組換えタンパク質において実現可能です。図に示すように、FRETドナーであるAlexa Fluor 555またはCy3をシングルチェーン断片に、FRETアクセプターであるAlexa Fluor 647またはCy5をMHC結合ペプチドのC末端にそれぞれ結合させます。この複合構造に示されているIndy距離は約41 angstrumであり、2つの色素間での最大エネルギー転移の半分となる距離である第1半径よりもさらに短くなっています。我々の実験では、代用抗原提示細胞として平面ガラス支持脂質二重層を採用しています。これらはPMXC、ストア分子B7-1、および接着分子ICAM-1で機能化されています。これにより、全内部反射蛍光モードでのイメージングが可能になります。このモードでは、界面に近接した蛍光分子のみを照射するため、細胞の背景光を大幅に低減できます。Fretは、シングルチェーンフラグメント標識TCRが層に埋め込まれたpMHCと結合した時にのみ検出されます。これにより、TCR-pMHC結合を可視化し、適切に折り畳まれた組織適合性抗原の結合キネティクスを算出することが可能になります。P71およびIchem1の細胞外領域は、対応するBUCウイルスに感染させた昆虫細胞培養液の上清から精製します。精製は、ニッケルNTAアフィニティークロマトグラフィーに始まり、続いてイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いる3段階の手順で実施します。Hisタグ付きMHCクラスIIヘテロ二量体は、大腸菌で封入体として発現させ、還元剤含有バッファーへの急速希釈により、スペースホルダーペプチド存在下の4 °Cでin vitroでリフォールディングさせます。スペースホルダーペプチドは、後にUV光照射によって切断されます。精製および濃縮されたスペースホルダー以外の適切に折り畳まれたPMHC複合体において、pH 5.2でペプチドを切断し、蛍光ペプチドで置換します。最終産物はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製されます。シングルチェーン断片は、未ペアリングのシステインを含む状態でE. coli中で封入体として発現され、段階的な透析によるin vitroでのリフォールディング後、サイズ精製が行われます。その後、未ペアリングのシステインを介してマレイミド結合染料でラベル化し、再度サイズ精製を行います。すべての組換えタンパク質は、最終的に50%グリセロール含有PBSに対して透析し、タンパク質濃度1 mg/mLに濃縮して-20°Cで長期保存します。リピッドブレイスの刺激能を検証するため、比率計量的URA2染料を用いてT細胞内のカルシウムレベルを測定します。T細胞芽球にURA2 AMエステルをロードします。この化合物はAM基を介して細胞内に浸入しますが、その後、エステラーゼの作用によってAM部が切断され、細胞内に保持されます。約300万個のT細胞に、最終濃度5 µMとなるようにAMを添加します。24ウェルプレートから細胞を新しいチューブに移し、室温で30分間インキュベートします。カルシウムおよびマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液と1%のアルブミンを含むイメージングバッファーで、細胞を1回洗浄します。細胞内カルシウムをモニタリングするには、自動UV対応倒立顕微鏡システムを使用します。タイミングプロトコルを開始し、顕微鏡ステージ上の焦点位置に配置した機能化脂質二重層に、負荷したT細胞を2個以下添加します。その後、一定の時間間隔で、DIC画像および340 nmと380 nmのUV光で励起した2つの蛍光画像を取得します。バイレイヤー接触後直ちに、T細胞はカルシウムレベルの上昇を示し、これはラン開始から15分後のURA 2-photonレシオによって読み取られます。すべてのpMHC抗原を飽和させるブロッキング抗体を細胞に添加します。その結果、細胞内カルシウムレベルは非活性化状態まで低下し、これが後のリファレンスとして機能します。ブロッキング抗体の存在レベルが、非活性化状態を反映する値（FRET測定用に1に正規化）まで低下した時点で、各実験においてT細胞をTCR反応性シングルチェーン断片FRETプローブで染色する必要があります。約100万個の細胞をチューブに移し、400 Gで遠心分離します。培地をデカンテーションし、チューブ内壁に残った培地液滴をペーパータオルで拭き取ります。これにより、前述した約30 µLという最小限のインキュベーション容量を確保します。FRETプローブは、1 mg/mLの濃度および50% glycerolにて-20 °Cで保存します。このプローブはAlexa Fluor 555またはAlexa Fluor 647で部位特異的にラベル化されており、タンパク質あたりの比率は1です。0.3 µLのプローブを細胞に添加します。ペレットを数回慎重に弾き、細胞を氷上で20分間インキュベートします。氷冷したイメージングバッファーで細胞を洗浄します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。インキュベーション、遠心分離、および低温保存を行うことで、T細胞が蛍光プローブに曝露されている間にプローブを内部に取り込むことを防ぎます。これにより、バックグラウンド蛍光が上昇することになります。さらに、T細胞は、バイレイヤー含有チャンバーを顕微鏡ステージの交換部に設置する前の洗浄および保存中の低温条件下において、プローブを消失させません。PBSを順次イメージングバッファーに置換しますが、バイレイヤーが破壊されるため、いかなる場合においても空気にさらされないようにしてください。細胞のバックグラウンドを低減するため、ターフ照明（turf illumination）を採用します。このため、励起ビームを全反射が起こる臨界角に配置します。励起光をオフにし、広視野照明をオンにしてから、T細胞をltecチャンバーに加え、脂質二重層上に静置させます。励起光をオンにし、非TURF照明にフォーカスを合わせます。あらゆる焦点面において、細胞膜が光軸に沿ったリング状に観察されます。TURFでは、二層膜に接している基底膜のみが観察可能です。それより上の焦点面はもはや励起されないため、観察することはできません。タイミングプロトコルは、PMHCおよびTCRをイメージングするための赤色および緑色の励起パルスから始まり、続いてP-M-H-C-Fアクセプターを消光させるための赤色ブリーチパルスを行います。F受容体ブリーチ後のTCRイメージングのための緑色パルス、およびF受容体の消光を確認するための赤色パルスは、1秒未満の時間スケールで、1回目と2回目の緑色パルスの間隔をできるだけ短くして実施されます。オプションとして、最初にDIC画像を取得することができ、2色の画像分離により、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの同時検出が可能になります。FRETアクセプター励起により、T細胞シナプスにおけるpMHCの蓄積が示されています。このプレブリーチ画像はpMHCの存在を検証し、すでにTCRを介したpMHC結合が起こっていることを示しています。FRETドナーにより、両方のチャンネルで画像が得られます。ドナーチャネルの信号は、FRET受容チャネルへのエネルギー転移により、ある程度強度が低下します。FRET受容チャネルの信号は、ドナーからのFRETブリードスルーと、FRET受容体の相互励起で構成されています。いずれにせよ、この画像は解析には使用しません。本プロトコルでは、迅速な漂白パルスによって、すべてのFRET受容体蛍光を消失させます。FRET受容体の漂白後、FRET供与体画像の強度は、FRETチャネルへの強度損失なしに、より高いレベルまで回復します。以下のFRETアクセプターの期待値により、Fアクセプターの完全な退色を確認します。次に、ドナーの回復量を定量化するためにシナプスを拡大します。FRETアクセプターに関わらず一定である平均背景強度を決定します。光退色を行った後、シナプス全体の平均強度と、代表的なTCRクラスターの強度を測定します。その後、アクセプターの消失前後の差を正規化することで、FRET効率を算出します。本例では、シナプス全体で16% FRET、代表的なクラスターで26% FRETという値が測定されました。TCRクラスターのFRET収率は、後にTCR占有率に変換され、これにより2次元的なシナプス解離定数の単分子データが得られます。これにより、単分子FRET実験におけるシナプスTCRとペプチドMHCの結合キネティクスを推定することができます。試薬およびラベル化戦略は、以前と同様のものを使用します。しかし、単一のTCRと単一のペプチドMHCとの相互作用を確実に観察するため、以下の基準を満たすようにします。単一分子FRETの候補イベントは、慣習的に、単一のFRETアクセプターまたはFRETドナー分子と共局在していなければなりません。ここでは、観察されたFRETイベントが単一分子によるものであることを検証するために、単一のPMHCをFRETアクセプター分子として用いますが、逆の論理でも同様に検証可能です。高波長のボタンにアクセプターを、低波長のボタンにドナーを割り当てることも、もちろん選択肢の一つです。通常、刺激性脂質二重層に接触しているT細胞に対し、514 nmおよび647 nmの励起光を用いて、ドナーとアクセプターを最小1ミリ秒のタイムラグで逐次的に、かつ繰り返し励起させ、その後にディレイ時間を設けます。このディレイ時間は、実験の要件に応じて変更することが可能です。励起後ミリ秒単位で単一色素検出に十分な蛍光信号を得るには、1～5 kW/cm²の範囲の高励起電力密度を適用する必要があります。光退色により、可視化されるPMHC FRETアクセプター分子の数は急速に減少し、1 µm²あたり30個以上のラベル化PMCSを含むバイレイヤーにおいても、単一のFRETアクセプター蛍光力が識別可能なレベルまで低下します。ここでは、全体のタイムラグが42 msである例を示します。赤色の円でマークされた単一のFRETイベントが、2番目と3番目のタイムポイントで確認できます。これは、緑色の円でマークされた単一のS5分子と共局在しています。この例では、観察可能なFRETイベントのトレース長は2です。some 128 tracesの表に示すように、さらに多くの単一分子FRETトレースを収集してください。次に、緑色の数字で示されているようにトレースの補完累積和を算出して規格化し、規格化された値をプロットして単一指数関数でフィッティングします。期待値は1.5 timeframesをわずかに上回ります。この値はTCRペプチド、MHC結合、および光退色に依存するため、これら2つの寄与を区別するには、少なくとも3つの異なる時間で期待値を算出する必要があります。次に、すべての期待値をそれぞれのタイムラグに対してプロットし、データポイントをここに示す寿命を含む関数にフィッティングさせます。ここでは2.12秒であり、PHOTOBLEACHINGの期待値はf Fredです。ここに示されており、また前述の詳細にあるように、許容可能な漂白後のドナー回復を用いることで、免疫シナプス内で有効な二次元解離定数をわずか数ステップで決定できます。ここでは、TCR結合およびTCRクラスター、特にTCR-pMHC結合が最も顕著な箇所に焦点を当てて解析を行います。提示された測定結果から明らかなように、F FREDの収量は大幅に異なります。個々のTCRクラスターについて検討します。F fredに比例係数Cを乗じると、TCR占有率（PMHCに結合したTCR数とTCR総数との比率を表す項）が得られます。Cは、特定のfreペアのセットおよび使用されるFREシステムに対して一度決定する必要があります。本プレゼンテーションの終盤で、例えばCをどのように決定するかについて詳しく説明します。これには、TCR R反応性シングルチェーン抗体フラグメントおよびMHC結合ペプチドのC末端に特異的に配置されたSI 3およびSI 5が含まれます。TCR占有率Aと脂質二重層上に存在するpMHCの初期密度から、約2つのシナプス様二次元解離定数を算出することができます。表示されている関係は質量作用の法則から導出されており、この動画に付随する論文でより詳細に説明されています。本例では、pmcの初期密度は1平方ミクロンあたり30分子です。これにより、T細胞シナプスにおいて有効な2D kdの分布が得られ、その中央値は約34分子/平方ミクロンとなります。オンレート分布は、シナプスにおける2D KD分布と、それに対応するオフレート（24 °Cでの単一分子FRETトレース解析により決定された0.41 per second）から算出できます。中央値は約0.01 square micron per molecule in secondです。要約すると、TCRとペプチドMHC間のFRET測定により、C2における反応ダイナミクスを記述するすべての速度論的パラメータの包括的な解析が可能になります。この手法は、原理的に、細胞間認識に不可欠と考えられる他の受容体リガンド相互作用の解析にも一般化することが可能です。最後に、脂肪収量をTCR占有率に変換するために必要な定数Cを、実験的にどのように導出するかについて説明します。この手順は一度だけ行えば十分です。決定された定数Cは、同一の蛍光色素を用いた同じFRETシステムを適用する以降のすべての実験に使用することができます。本手順では、本質的に、アクセプター光退色後のドナー回復を通じて個々のTCRクラスターで測定されたFRET収量を、感作FRETチャネルで検出された対応する強度値に関連付けました。前述の通り、FRET収量は、FRETアクセプター除去前後の背景補正済みFRETドナーチャネル画像から決定されます。感作されたFRETチャネルをFドナーチャネルおよびXおよびYとアライメントさせ、背景補正を行う必要があります。ここに示すように、FRETドナーのブリードスルーおよびFRETアクセプターのクロスエキサイテーションを補正します。FRETドナーのブリードスルーおよびFRETアクセプターのクロスエキサイテーションの補正方法に関する詳細な説明は、本記事に記載されています。このビデオに併せて、各TCRクラスターについて、補正後のFRET画像におけるbg信号と、それに対応する補正後のFRETドナー画像の信号との比を算出します。単一FRETドナーおよび単一分子FRETイベントの補正後平均信号を決定し、その比を算出してください。その後、これら両方の比を掛け合わせることで、TCR占有率を導出します。次に、個々のTCRクラスターについて決定されたFRET収率を、それぞれのTCR占有率に対してプロットします。そして、ここで示すように、線形回帰を通じてCを決定します。今回の例では、約2となります。このビデオを視聴することで、タンパク質機能化脂質二重層と単一分子蛍光顕微鏡を組み合わせて、PMHCとTCR間のシナプス結合キネティクスを測定できるようになります。タンパク質の作製、T細胞のラベル化、そして最終的なFRET測定を含むすべての必要な手順について解説しました。さらに、T細胞活性化曲線とFRET値を算出するための画像解析について詳細に説明しました。最後に、キネティックなオン・オフ速度の決定の根拠となる手法について説明しました。原理的には、同様のアプローチを他のシナプス受容体リガンド相互作用の決定にも利用できますが、必要に応じて適切な修正を加える必要があるかもしれません。

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TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。...

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション...

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による...

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

学ぶFRET顕微鏡法を用いて免疫学的シナプスにおけるTCR-pMHC結合動態を測定する方法です。単一分子レベルで結合親和性、解離速度、結合速度を定量的に解析し、T細胞抗原認識の分子メカニズムを解明します。

TCR-のpMHCが結合を測定します

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