TCR-のpMHCが結合を測定します

このビデオでは、T細胞抗原受容体とペプチド搭載主要組織適合性複合体（pMHC）間のキネティクスを、T細胞と平面支持脂質二重層との間の免疫シナプス内において測定する方法を説明します。また、タンパク質の調製に関する重要な事項や、カルシウムフラックス測定による脂質二重層の機能的完全性の検証について簡潔に解説します。脂質二重層の調製方法および単一分子蛍光顕微鏡のセットアップに関するより詳細な情報については、Journal of Visualized Experimentsに掲載されている我々の併設論文をご参照ください。その後、バルクおよび単一分子レベルでのフェルスター共鳴エネルギー転移（FRET）測定の実施方法とその解析について詳しく説明します。

本研究の全体的なアプローチで用いたFRETベースの戦略を説明するため、シナプスにおけるT細胞受容体とPMHCの結合キネティクスを導出します。まず、青色で示したT細胞受容体（TCR）が、黄色と赤色で示した抗原であるペプチド負荷MHC分子（PMHC）に結合している結晶構造から開始します。また、AGE 57と呼ばれるT細胞受容体β鎖反応性抗体から得られた可変領域のシングルチェーンフラグメントも導入します。定量的なFRET測定を行うには、FRETドナー（本ケースではシングルチェーンフラグメント）とFRETアクセプター（PMHC）の両方を、部位特異的にラベル化することが不可欠です。

これは、導入したシステインを介して、maleimide修飾された蛍光色素と共有結合させることで、組換えタンパク質において実現可能です。図に示すように、FRETドナーであるAlexa Fluor 555またはCy3をシングルチェーン断片に、FRETアクセプターであるAlexa Fluor 647またはCy5をMHC結合ペプチドのC末端にそれぞれ結合させます。

この複合構造に示されているIndy距離は約41 angstrumであり、2つの色素間での最大エネルギー転移の半分となる距離である第1半径よりもさらに短くなっています。我々の実験では、代用抗原提示細胞として平面ガラス支持脂質二重層を採用しています。これらはPMXC、ストア分子B7-1、および接着分子ICAM-1で機能化されています。

これにより、全内部反射蛍光モードでのイメージングが可能になります。このモードでは、界面に近接した蛍光分子のみを照射するため、細胞の背景光を大幅に低減できます。Fretは、シングルチェーンフラグメント標識TCRが層に埋め込まれたpMHCと結合した時にのみ検出されます。これにより、TCR-pMHC結合を可視化し、適切に折り畳まれた組織適合性抗原の結合キネティクスを算出することが可能になります。

P71およびIchem1の細胞外領域は、対応するBUCウイルスに感染させた昆虫細胞培養液の上清から精製します。精製は、ニッケルNTAアフィニティークロマトグラフィーに始まり、続いてイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いる3段階の手順で実施します。Hisタグ付きMHCクラスIIヘテロ二量体は、大腸菌で封入体として発現させ、還元剤含有バッファーへの急速希釈により、スペースホルダーペプチド存在下の4 °Cでin vitroでリフォールディングさせます。

スペースホルダーペプチドは、後にUV光照射によって切断されます。精製および濃縮されたスペースホルダー以外の適切に折り畳まれたPMHC複合体において、pH 5.2でペプチドを切断し、蛍光ペプチドで置換します。

最終産物はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製されます。シングルチェーン断片は、未ペアリングのシステインを含む状態でE. coli中で封入体として発現され、段階的な透析によるin vitroでのリフォールディング後、サイズ精製が行われます。その後、未ペアリングのシステインを介してマレイミド結合染料でラベル化し、再度サイズ精製を行います。

すべての組換えタンパク質は、最終的に50%グリセロール含有PBSに対して透析し、タンパク質濃度1 mg/mLに濃縮して-20°Cで長期保存します。リピッドブレイスの刺激能を検証するため、比率計量的URA2染料を用いてT細胞内のカルシウムレベルを測定します。T細胞芽球にURA2 AMエステルをロードします。

この化合物はAM基を介して細胞内に浸入しますが、その後、エステラーゼの作用によってAM部が切断され、細胞内に保持されます。約300万個のT細胞に、最終濃度5 µMとなるようにAMを添加します。24ウェルプレートから細胞を新しいチューブに移し、室温で30分間インキュベートします。

カルシウムおよびマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液と1%のアルブミンを含むイメージングバッファーで、細胞を1回洗浄します。細胞内カルシウムをモニタリングするには、自動UV対応倒立顕微鏡システムを使用します。タイミングプロトコルを開始し、顕微鏡ステージ上の焦点位置に配置した機能化脂質二重層に、負荷したT細胞を2個以下添加します。その後、一定の時間間隔で、DIC画像および340 nmと380 nmのUV光で励起した2つの蛍光画像を取得します。

バイレイヤー接触後直ちに、T細胞はカルシウムレベルの上昇を示し、これはラン開始から15分後のURA 2-photonレシオによって読み取られます。すべてのpMHC抗原を飽和させるブロッキング抗体を細胞に添加します。その結果、細胞内カルシウムレベルは非活性化状態まで低下し、これが後のリファレンスとして機能します。

ブロッキング抗体の存在レベルが、非活性化状態を反映する値（FRET測定用に1に正規化）まで低下した時点で、各実験においてT細胞をTCR反応性シングルチェーン断片FRETプローブで染色する必要があります。約100万個の細胞をチューブに移し、400 Gで遠心分離します。培地をデカンテーションし、チューブ内壁に残った培地液滴をペーパータオルで拭き取ります。これにより、前述した約30 µLという最小限のインキュベーション容量を確保します。

FRETプローブは、1 mg/mLの濃度および50% glycerolにて-20 °Cで保存します。このプローブはAlexa Fluor 555またはAlexa Fluor 647で部位特異的にラベル化されており、タンパク質あたりの比率は1です。0.3 µLのプローブを細胞に添加します。ペレットを数回慎重に弾き、細胞を氷上で20分間インキュベートします。

氷冷したイメージングバッファーで細胞を洗浄します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。インキュベーション、遠心分離、および低温保存を行うことで、T細胞が蛍光プローブに曝露されている間にプローブを内部に取り込むことを防ぎます。

これにより、バックグラウンド蛍光が上昇することになります。さらに、T細胞は、バイレイヤー含有チャンバーを顕微鏡ステージの交換部に設置する前の洗浄および保存中の低温条件下において、プローブを消失させません。PBSを順次イメージングバッファーに置換しますが、バイレイヤーが破壊されるため、いかなる場合においても空気にさらされないようにしてください。

細胞のバックグラウンドを低減するため、ターフ照明（turf illumination）を採用します。このため、励起ビームを全反射が起こる臨界角に配置します。励起光をオフにし、広視野照明をオンにしてから、T細胞をltecチャンバーに加え、脂質二重層上に静置させます。

励起光をオンにし、非TURF照明にフォーカスを合わせます。あらゆる焦点面において、細胞膜が光軸に沿ったリング状に観察されます。TURFでは、二層膜に接している基底膜のみが観察可能です。それより上の焦点面はもはや励起されないため、観察することはできません。

タイミングプロトコルは、PMHCおよびTCRをイメージングするための赤色および緑色の励起パルスから始まり、続いてP-M-H-C-Fアクセプターを消光させるための赤色ブリーチパルスを行います。F受容体ブリーチ後のTCRイメージングのための緑色パルス、およびF受容体の消光を確認するための赤色パルスは、1秒未満の時間スケールで、1回目と2回目の緑色パルスの間隔をできるだけ短くして実施されます。オプションとして、最初にDIC画像を取得することができ、2色の画像分離により、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの同時検出が可能になります。

FRETアクセプター励起により、T細胞シナプスにおけるpMHCの蓄積が示されています。このプレブリーチ画像はpMHCの存在を検証し、すでにTCRを介したpMHC結合が起こっていることを示しています。FRETドナーにより、両方のチャンネルで画像が得られます。

ドナーチャネルの信号は、FRET受容チャネルへのエネルギー転移により、ある程度強度が低下します。FRET受容チャネルの信号は、ドナーからのFRETブリードスルーと、FRET受容体の相互励起で構成されています。いずれにせよ、この画像は解析には使用しません。

本プロトコルでは、迅速な漂白パルスによって、すべてのFRET受容体蛍光を消失させます。FRET受容体の漂白後、FRET供与体画像の強度は、FRETチャネルへの強度損失なしに、より高いレベルまで回復します。

以下のFRETアクセプターの期待値により、Fアクセプターの完全な退色を確認します。次に、ドナーの回復量を定量化するためにシナプスを拡大します。FRETアクセプターに関わらず一定である平均背景強度を決定します。

光退色を行った後、シナプス全体の平均強度と、代表的なTCRクラスターの強度を測定します。その後、アクセプターの消失前後の差を正規化することで、FRET効率を算出します。本例では、シナプス全体で16% FRET、代表的なクラスターで26% FRETという値が測定されました。

TCRクラスターのFRET収率は、後にTCR占有率に変換され、これにより2次元的なシナプス解離定数の単分子データが得られます。これにより、単分子FRET実験におけるシナプスTCRとペプチドMHCの結合キネティクスを推定することができます。試薬およびラベル化戦略は、以前と同様のものを使用します。

しかし、単一のTCRと単一のペプチドMHCとの相互作用を確実に観察するため、以下の基準を満たすようにします。単一分子FRETの候補イベントは、慣習的に、単一のFRETアクセプターまたはFRETドナー分子と共局在していなければなりません。ここでは、観察されたFRETイベントが単一分子によるものであることを検証するために、単一のPMHCをFRETアクセプター分子として用いますが、逆の論理でも同様に検証可能です。

高波長のボタンにアクセプターを、低波長のボタンにドナーを割り当てることも、もちろん選択肢の一つです。通常、刺激性脂質二重層に接触しているT細胞に対し、514 nmおよび647 nmの励起光を用いて、ドナーとアクセプターを最小1ミリ秒のタイムラグで逐次的に、かつ繰り返し励起させ、その後にディレイ時間を設けます。このディレイ時間は、実験の要件に応じて変更することが可能です。

励起後ミリ秒単位で単一色素検出に十分な蛍光信号を得るには、1～5 kW/cm²の範囲の高励起電力密度を適用する必要があります。光退色により、可視化されるPMHC FRETアクセプター分子の数は急速に減少し、1 µm²あたり30個以上のラベル化PMCSを含むバイレイヤーにおいても、単一のFRETアクセプター蛍光力が識別可能なレベルまで低下します。ここでは、全体のタイムラグが42 msである例を示します。

赤色の円でマークされた単一のFRETイベントが、2番目と3番目のタイムポイントで確認できます。これは、緑色の円でマークされた単一のS5分子と共局在しています。この例では、観察可能なFRETイベントのトレース長は2です。some 128 tracesの表に示すように、さらに多くの単一分子FRETトレースを収集してください。

次に、緑色の数字で示されているようにトレースの補完累積和を算出して規格化し、規格化された値をプロットして単一指数関数でフィッティングします。期待値は1.5 timeframesをわずかに上回ります。この値はTCRペプチド、MHC結合、および光退色に依存するため、これら2つの寄与を区別するには、少なくとも3つの異なる時間で期待値を算出する必要があります。

次に、すべての期待値をそれぞれのタイムラグに対してプロットし、データポイントをここに示す寿命を含む関数にフィッティングさせます。ここでは2.12秒であり、PHOTOBLEACHINGの期待値はf Fredです。ここに示されており、また前述の詳細にあるように、許容可能な漂白後のドナー回復を用いることで、免疫シナプス内で有効な二次元解離定数をわずか数ステップで決定できます。

ここでは、TCR結合およびTCRクラスター、特にTCR-pMHC結合が最も顕著な箇所に焦点を当てて解析を行います。提示された測定結果から明らかなように、F FREDの収量は大幅に異なります。個々のTCRクラスターについて検討します。

F fredに比例係数Cを乗じると、TCR占有率（PMHCに結合したTCR数とTCR総数との比率を表す項）が得られます。Cは、特定のfreペアのセットおよび使用されるFREシステムに対して一度決定する必要があります。本プレゼンテーションの終盤で、例えばCをどのように決定するかについて詳しく説明します。これには、TCR R反応性シングルチェーン抗体フラグメントおよびMHC結合ペプチドのC末端に特異的に配置されたSI 3およびSI 5が含まれます。TCR占有率Aと脂質二重層上に存在するpMHCの初期密度から、約2つのシナプス様二次元解離定数を算出することができます。

表示されている関係は質量作用の法則から導出されており、この動画に付随する論文でより詳細に説明されています。本例では、pmcの初期密度は1平方ミクロンあたり30分子です。これにより、T細胞シナプスにおいて有効な2D kdの分布が得られ、その中央値は約34分子/平方ミクロンとなります。

オンレート分布は、シナプスにおける2D KD分布と、それに対応するオフレート（24 °Cでの単一分子FRETトレース解析により決定された0.41 per second）から算出できます。中央値は約0.01 square micron per molecule in secondです。要約すると、TCRとペプチドMHC間のFRET測定により、C2における反応ダイナミクスを記述するすべての速度論的パラメータの包括的な解析が可能になります。

この手法は、原理的に、細胞間認識に不可欠と考えられる他の受容体リガンド相互作用の解析にも一般化することが可能です。最後に、脂肪収量をTCR占有率に変換するために必要な定数Cを、実験的にどのように導出するかについて説明します。この手順は一度だけ行えば十分です。

決定された定数Cは、同一の蛍光色素を用いた同じFRETシステムを適用する以降のすべての実験に使用することができます。本手順では、本質的に、アクセプター光退色後のドナー回復を通じて個々のTCRクラスターで測定されたFRET収量を、感作FRETチャネルで検出された対応する強度値に関連付けました。前述の通り、FRET収量は、FRETアクセプター除去前後の背景補正済みFRETドナーチャネル画像から決定されます。

感作されたFRETチャネルをFドナーチャネルおよびXおよびYとアライメントさせ、背景補正を行う必要があります。ここに示すように、FRETドナーのブリードスルーおよびFRETアクセプターのクロスエキサイテーションを補正します。FRETドナーのブリードスルーおよびFRETアクセプターのクロスエキサイテーションの補正方法に関する詳細な説明は、本記事に記載されています。

このビデオに併せて、各TCRクラスターについて、補正後のFRET画像におけるbg信号と、それに対応する補正後のFRETドナー画像の信号との比を算出します。単一FRETドナーおよび単一分子FRETイベントの補正後平均信号を決定し、その比を算出してください。その後、これら両方の比を掛け合わせることで、TCR占有率を導出します。

次に、個々のTCRクラスターについて決定されたFRET収率を、それぞれのTCR占有率に対してプロットします。そして、ここで示すように、線形回帰を通じてCを決定します。今回の例では、約2となります。

このビデオを視聴することで、タンパク質機能化脂質二重層と単一分子蛍光顕微鏡を組み合わせて、PMHCとTCR間のシナプス結合キネティクスを測定できるようになります。タンパク質の作製、T細胞のラベル化、そして最終的なFRET測定を含むすべての必要な手順について解説しました。さらに、T細胞活性化曲線とFRET値を算出するための画像解析について詳細に説明しました。

最後に、キネティックなオン・オフ速度の決定の根拠となる手法について説明しました。原理的には、同様のアプローチを他のシナプス受容体リガンド相互作用の決定にも利用できますが、必要に応じて適切な修正を加える必要があるかもしれません。