リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

本手順の全体的な目的は、関連するバイオマス変異体間における熱化学的前処理および酵素加水分解の難分解性を測定することです。まず、粒径の調整、およびデンプンと可溶性糖の抽出を行うことで、バイオマス試料を試験用に調製します。次に、熱化学的に適合したハイスループット反応プレートに、バイオマスを高精度に分注します。

サンプルを蒸気リアクターで前処理します。次に、市販の標準的なセルラーゼを用いてサンプルを3日間消化し、セルロースとヘミセルロースを加水分解します。最終ステップとして、GO pod法およびXDH法を用いて、酵素加水分解中に放出されたグルコースおよびキシロースの定量を行います。

最終的に、ハイスループットなグルコースおよびキシロースの定量分析を用いて、出発バイオマス1gあたりの糖放出量（g糖/gバイオマス）に基づいてサンプル間の相対的な糖放出量を決定します。前処理や酵素加水分解などの他のベンチスケール手法に対するこの手法の主な利点は、数百から数千のサンプルを同時に処理できる点にあります。この方法は、どの品種や変異体が糖およびその後の製品への変換に適しているかなど、バイオマス変換分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

したがって、細胞壁合成経路において導入した変異による構造的・化学的な変化をスクリーニングできるため、本手法の意義は細胞壁の構造と機能の理解へと拡張することが可能です。また、本手法は植物細胞壁の難分解性に関する知見を提供できるほか、酵素活性や相乗効果の研究など、バイオマス変換における他の構成要素にも応用できます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ミリグラムスケールで同一かつ同時に処理しなければならない大量のバイオマス変異体サンプルセットを扱うため、習得に苦労することがあります。そのため、専用のロボットおよび設備が必要となります。手順を開始するには、バーコード付き帯電防止袋から番号付きティーバッグへ、あらかじめ粉砕したバイオマス約250 mgを移します。デンプン除去および抽出中の損失を防ぐため、ティーバッグの両端をバイオマスの方へ折り込みながら、慎重に巻き上げてください。次に、各ティーバッグを錫メッキ銅線で閉じ、バーコード付きサンプルごとにティーバッグの番号を記録します。

あらかじめ調製した脱デンプン酵素溶液500 millilitersをプラスチック容器に加えます。次に、バッチ処理プロトコルに従い、バッファー酵素溶液にティーバッグ120個を加えます。シェーカーでインキュベートした後、脱デンプン処理したバイオマスを十分にすすぎ、数リットルの脱イオン水に30分間浸漬させます。

緩衝塩を除去するため、ティーバッグをソックスレー抽出器のコラムに入れます。95% ethanolを用いてソックスレー還流装置をセットアップし、サンプルを24時間抽出します。抽出が完了したら、ティーバッグを取り出し、乾燥させたバイオマスを元のバーコード付き容器に戻します。

帯電防止袋から乾燥バイオマスを50 mg以上、バーコード付きホッパーに移します。正確なサンプル追跡を確実に行うため、帯電防止袋と受け取り用ホッパーのバーコードをスキャンします。ホッパーを固体計量ロボットにロードした後、乾燥サンプル5 mgを耐酸性ステンレス製容器にロボットで計量します。

96ウェルプレートを用い、局所的な変動を最小限に抑えるため、各サンプルの3反復をプレート全体に分散させて秤量します。次に、各ウェルに250 µLの脱イオン水を加え、シリコン粘着剤付きのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープでプレートを密封します。1/8インチの半田ごてチップを使用して、各蒸気ポートのPTFEテープに穴を開けます。

各プレートについて、プレート間に厚さ0.031 inchのガラス強化PTFEガスケットを挟み、スタックの最上段と最下段に空のプレートを配置して、プレートをしっかりと締め付けます。180 °Cに設定した蒸気リアクターを用いて、サンプルを17.5分間前処理します。処理終了後、脱イオン水で満たしてリアクタープレートを50 °Cまで冷却します。

プレートが冷えたら、スイングバケットを用いて遠心分離します。ローター速度 1700 GS で 20 分間遠心します。その後、シーリングフィルムを取り除きます。

新しいPTFEテープで再密封した後、あらかじめ調製した8%酵素ストック溶液を各ウェルに40 microlitersずつ加えます。密封したプレートをマグネットプレートクランプに固定します。プレートを少なくとも15回転倒混和させてサンプルを穏やかに混合し、50 degrees Celsiusで70時間インキュベートします。インキュベーション後、リアクタープレートを混合し、遠心分離します。

次に、液体ハンドリングロボットを使用して、酵素結合比色法によるグルコースおよびキシロースの定量を行います。キシロースにはキシロースデヒドロゲナーゼ（XDH）を、グルコースにはグルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ（GO POD）を使用します。デッキには、GO PODおよびXDH試薬のリザーバーに加え、希釈用の水、および各試薬用の96チャンネル200 µLチップラックを配置します。これらのチップは、複数のリアクタープレートで再利用されます。

また、デッキには水分の除去および糖標準液の調製に使用する使い捨ての200 µLチップと、あらかじめ調製された糖標準液が配置されています。ロボットはストレージカルーセルからHPLCバイアルと共に、加水分解混合液の希釈用、およびXDHアッセイ用とGoPodアッセイ用にそれぞれ1枚ずつ、計3枚の透明マイクロタイタープレートを取り出します。グリッパーはこれら計4枚のプレートすべてをデッキ上の所定の位置に移動させます。

使い捨ての96チャンネル100 µLチップをカルーセルからデッキに搬送し、リアクターから希釈プレートへ、および希釈プレートからXDHおよびgo podプレートへの分注に使用します。可変スペースの8チャンネルピペッターを用いて、希釈プレートへのキャリーオーバーを防ぐため、リアクタープレートの各コーナーにある3つのウェルから、前処理前に添加した水を除去します。これらの12個のウェルは、96チャンネルピペッティングヘッドを用いた糖標準物質に使用されます。

各コーナーのチップ3本を取り除いた状態で、希釈プレートのウェルに180 µLの水を加えます。チップを交換した後、96チャンネルピペッティングヘッドを用いて、XD、H、およびgo pod試薬をそれぞれのリザーバーから対応するアッセイプレートへ移送します。

この操作を行っている間に、希釈プレートの各コーナーにある3つのウェルに糖標準液を分注します。8チャンネルピペッティングヘッドで小型チップに交換した後、96チャンネルピペッティングヘッドを使用して、加水分解上清 20 µLを希釈プレートに転送し、プレートを3回混ぜ合わせます。チップがバイオマス粒子で汚染されるのを防ぐため、サンプルは液面に近い位置から吸引してください。

混合後、20 µLを順次分注します。96チャンネルピペッティングヘッドを使用して、XDHプレートおよびgo podプレートに分注します。トリエ（trier）でそれぞれ混合した後、サンプルチップ、リアクタープレート、および希釈プレートをカルーセル内の廃棄ラックに戻します。XDHプレートとgo podプレートは別のカルーセルラックに移し、1時間静置した後、紫外可視96ウェルプレートリーダーを用いて分光光度計で測定します。

測定波長を510 nanometersに設定し、試薬ブランクに対する吸光度を記録します。次に、プレートリーダーの測定波長を340 nanometersに設定し、小型スパチュラを用いて吸光度を記録します。調製したバイオマス約4 milligramsを、質量分析計のオートサンプラー用80 microliterステンレス製カップに分注します。

標準的なパンチを使用して、バインダーを含まないtype adガラスフィルターシートからガラスフィルターディスクを手動で作成します。ピンセットを用いて、オートサンプラーラックにサンプルをロードします。その際、分光計の時間経過によるドリフトによるバイアスを避けるため、カップにサンプルをランダムにロードしてください。校正を行い、質量分析計に適切なパラメータを入力した後、データ収集を開始し、背景スペクトル収集に十分なデータが得られるまで少なくとも60秒間待ちます。最後に、ヘリウムキャリアガスの流量を0.9 liters per minuteに設定し、オートサンプラーの自動メソッドを開始します。

トレンドの例として、太平洋北西部のポプラの天然変異体755株を対象とした難分解性の調査が挙げられます。その結果、シリンジとグイルの比率が上昇するにつれて難分解性は低下し、比率が約2になると難分解性の改善が横ばいになることが示されました。ここでは、PT four CL one遺伝子がダウンレギュレートされた外れ値が見られます。

ポプラにおいて、スクリーニングした100の栽培品種のうち数種では、糖放出の減少により、難分解性物質が明らかに増加していることが示されました。複数の地点で栽培され、異なる成長条件下で収穫された様々な小麦わら品種により、上記の変数の組み合わせに基づいて20の異なる個体群が得られました。これらのサンプルセットは容易に区別可能であり、正および負の変数を指し示しています。

難分解性物質の熱分解において、細胞壁組成の変化を評価するために分子ビーム質量分析法を用いることができます。質量分析フラグメントは、異なるリグニンモノマーに割り当てられます。リグニン含有量の高いサンプルと炭水化物含有量の高いサンプルを比較すると、スペクトルデータの相違が明らかになります。

ここでは、主成分分析と組み合わせた質量分析データの活用法について解説します。主成分負荷量プロットを用いることで、スコア分類プロットにおいてどの化学的特性が説明されているかを特定できるほか、サンプルクラスター間でどの特性が変化しているかを明らかにすることができます。この手法を習得し、適切に実施すれば、週に数千個のサンプルをスクリーニングすることが可能です。本手順を行う際は、可能な限り一貫性を保ち、関連するセット内のサンプルのみを比較することが重要です。

本技術の開発後、イオン液体やアルカリ前処理などの手法を用いることで、他の研究者がハイスループットスクリーニング法や植物細胞壁の難分解性に関するその他の領域に取り組む道が開かれました。このビデオを視聴することで、粒径還元と抽出、熱化学的前処理および酵素加水分解を用い、難分解性の差異を調べるために、マイクロスケールの大量のバイオマスサンプルセットを適切に調製、処理、および分析する方法について十分に理解できたはずです。高圧、蒸気、および自動装置を取り扱うことは極めて危険であり、これらの手順を実行する際は、個人用保護具の着用や、すべての装置に安全インターロックを設置するなど、あらゆる安全上の予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。