Name: リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶリグノセルロース系バイオマスの反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング法。熱化学前処理と酵素加水分解を用いて総リグニン、リグニンモノマー、酵素糖リリースを測定し、バイオ燃料原料の評価効率を向上させる。

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著者は、この原稿で議論されている両方のハイスループットパイプラインのバイオマスサンプルの調製に関する最も重要な洞察を提供してくれたインターンのEvelyn Von Neidaに感謝したいと思います。この研究と原稿の開発は、バイオエネルギー科学センターによって支援されました。バイオエネルギー科学センターは、米国エネルギー省のバイオエネルギー研究センターであり、DOE科学局の生物環境研究局が支援しています。National Renewable Energy Laboratory(NREL)は、米国エネルギー省エネルギー効率・再生可能エネルギー局の国立研究所であり、Alliance for Sustainable Energy, LLCがDOEのために運営しています。この作業は、米国エネルギー省の支援を受け、契約番号に基づいて行われました。DE-AC36-08-GO28308 国立再生可能エネルギー研究所と共同。

酵素糖化9,29に続いてグルコースおよびキシロース収量の1.高スループットの決意<ol><li>サンプル調製（研削、デ糊付け、抽出、前処理） <ol><li>粒子は、20メッシュ（850ミクロン）スクリーンを通過するように、ウィリーミルを使用して、各バイオマス試料の少なくとも300ミリグラムを挽きます。帯電防止ジップトップバッグに移す（通常はバーコード）とバーコードのデータベースにサンプル情報を記録します。 </li><li>番号が（鉛筆で、インクまたはマーカーを使用しないでください）​​ティーバッグに約静電気防止用の袋から地上バイオマスの250 mg以上を追加し、慎重にティーバッグをロールアップし、防止するために、バイオマスの上に端を折るようにしてくださいというデ糊付けし、抽出中の損失。 </li><li>ティーバッグは、スズ被覆銅線を使用して閉じたラップ。各バーコードのサンプルのティーバッグの数を記録します。 </li><li>商業的な酵素（典型的には、0.25％（v / v）のグルコアミラーゼ（〜1600 AGU / L）からの脱糊付け酵素溶液を調製します0.1 M酢酸ナトリウム（pHは5.0）1.5％（v / v）のα-アミラーゼ（〜2900 KNU-S / L））。バルクバイオマスのグラムあたり16 mlまたは120ティーバッグサンプルあたり500ミリリットルを準備します。注意：地上バイオマスから澱粉を除去することができる負荷量は、酵素負荷および比の範囲で消化した後、デンプンのために試験することにより実験的に決定されるべきです。 </li><li>プラスチック容器では、バルク地上バイオマス1g当たりデ糊付け酵素液の16ミリリットルを追加します。バッチデ糊付けプロトコルの場合、緩衝酵素溶液500 mlに120ティーバッグを追加します。 </li><li>可能な澱粉を除去するために、120rpmで、24（±4）時間、55℃でシェーカーでインキュベートします。 </li><li>脱糊付けインキュベートした後、30分間脱イオン水で数リットルのバイオマスを洗浄し、浸し。カスケードに熱い液体エタノールを引き起こし、解決策のレベルの突然の暴力的な上昇​​をもたらすことができる溶液中の気泡のバンピング（形成を引き起こす可能性がありますバッファー塩を除去するために、このプロセスをさらに2回繰り返し抽出時の反応容器）のうち。 </li><li>脱糊のバイオマスを徹底的にすすいだ後、抽出のためにソックスレー列にティーバッグを置きます。いいえシンブルは、このステップのために必要とされません。 </li><li> 95％のエタノールを用い、ソックスレー還流を設定し、24時間のサンプルを抽出します。 </li><li>ソックスレー反応器からティーバッグを取り外し、平らなトレイの上に単層に広がります。 </li><li>サンプルは、ヒュームフード中で室温で一晩乾燥することができます。 </li><li>ティーバッグをアンロールし、元のバーコード静電​​気防止袋に乾燥バイオマスを返します。 注：帯電防止袋取り扱い特性を改善する、バイオマス中の静電気を低減することで効率的です。他のストレージオプションが使用される場合、追加のバイオマスによる貯蔵容器の側面に付着したバイオマスに必要とされるかもしれません。 </li><li>バーコードホッパーに乾燥バイオマスの少なくとも50 mgの転送（より多くの材料を使用すると、正確な分注のためのより良いです）。 S帯電防止バッグや受信ホッパーのバーコードは正確なサンプルの追跡を確保することができます。 </li><li>固体は、ラック内のサンプルのために細心の注意を払って、ロボットの重さにロードホッパー。すべてのサンプルが含まれており、使用したプレートの数に基づいて、分配プロトコルを選択するのに十分な原子炉プレートをロードします。 </li><li>ロボット耐酸性ステンレス鋼96ウェルプレートに乾燥した試料（±0.3 mg）を5mgの重量を量ります。いずれかの局所的な変動を最小限にするために、プレートの周りに分布し、各サンプルの3複製を秤量。 </li><li>アッセイ性能を追跡するために、十分に特徴付けられたバイオマス標準材料の8制御バイオマスサンプルを含みます。複数のプレートは、複数の標準的なバイオマスホッパーの使用を繰り返し、分配サイクルでホッパーにふるいにかけることによって生じる粒子サイズのずれを最小限に抑えることができます。 注：各プレートには、3反復で24サンプル、脱イオン水と酵素からなる4ブランク、および8制御があるはずですLS、以前に特徴付け標準バイオマスを使用。プレートの4隅の各々の3コーナーウェルは、糖標準用に予約されています。 </li><li>誤ったバイオマス粒子のための空白と砂糖標準井戸を確認し、存在する場合は削除します。 </li><li>各ウェルに脱イオン水250μlを添加し、シリコーン接着剤付きポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープでプレートをシール。 </li><li> 1/8「はんだごてチップを用いて、各プレートのために、各蒸気口（117合計）でPTFEテープを突き刺します。密封された反応容器プレート上に積層空のプレートをガイドとして使用して、PTFEフィルムの動きを制限します。 </li><li>スタックの上下にプレートし、空のプレートの間に0.031 &quot;の厚さのガラス繊維強化PTFE製ガスケット（蒸気ポート用の穴をあらかじめパンチ）でしっかりとプレートを固定します。 17.5分、または所望の重症度に基づいて、他の温度/時間の組み合わせのために180℃に設定した蒸気反応器を用いてサンプルを前処理。 </li><li> 50℃に冷却し、反応器プレート;脱イオン水でフラッディングすることで、C。 </li></ol></li><li>酵素的糖化<ol><li> 1.0 Mクエン酸ナトリウム、pHが5.0に8％（v / v）の酵素溶液からなる酵素糖化液を準備します。反応容器プレートあたり5ミリリットルを準備します。注：必要な希釈は、特定のストック酵素溶液の活性およびタンパク質含量に基づいて決定されるべきです。 </li><li>プレートがクールである場合、20分間1500×gで、スイングバケットローターでそれらを遠心分離します。封止膜削除します。注：これらのプレートは重く、遠心仕様は互換性のためにチェックする必要があります。 </li><li>各ウェルに8％の酵素原液（グラムバイオマスあたり70 mgの酵素）の40μLを追加します。 </li><li>新しいPTFEテープで再密封。磁性板クランプに密封プレートを置きます。 </li><li>静かに反転によるサンプル（少なくとも15倍）を混合し、70時間50℃でインキュベートします。 </li><li>糖化が終了した場合には、1,500 xで反転し、遠心分離することによって、プレートを混ぜます20分間グラム。 </li></ol></li><li>シュガーアッセイ<ol><li> 6グルコースおよび0.014 Mクエン酸緩衝液中のキシロース組み合わせ校正標準0から0.750ミリグラム/ mlの範囲（pHは5.0）のセット準備（0、0.2、0.3、0.45、0.65、および0.75 mgの/ mlの推奨）、および0から0.600それぞれグルコースとキシロースのためミリグラム/ mlの（0、0.1、0.2、0.35、0.45、および0.6 mgの/ mlのを推奨）、。 </li><li>キットの説明書に従って、グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD）およびキシロースデヒドロゲナーゼ（XDH）試薬を準備します。 </li><li>ピペットを用いて、反応容器プレートのコーナーウェル（12ウェルの合計）に隣接する4コーナー井戸とエッジウェルから液体の200μlのを削除します。 </li><li>ピペットを用いて、96ウェルポリスチレン平底希釈プレートの各ウェルに180μlの脱イオン水を分配します。 12砂糖標準とコーナー井戸に水を追加しないでください（96チャンネルヘッドを使用している場合、これらのヒントを削除します）。 </li><li>ピペットを使用して、グルコースアッセイPLの各ウェルに180μlのGOPOD試薬を分配食べました。 </li><li>ピペットを用いて、キシロースアッセイプレートの各ウェルに180μlのXDH試薬を分注します。 </li><li>ピペットを用い、希釈プレートに96ウェルの反応器プレートから20μlの加水分解物のアリコートを移します。井戸の上部からピペットは、バイオマス固形分とコーナーウェル内の残液を避けるために。少なくとも10サイクル粉砕して混合します。 </li><li>ピペットを用い、希釈プレートのコーナーウェルに、二重に、糖標準の110μLを移します。 </li><li>ピペットを使用して、グルコースおよびキシロースアッセイプレートに、希釈プレートからの20μlのアリコートを移します。粉砕して混ぜます。 </li><li> 30分間室温でグルコースおよびキシロースアッセイプレートをインキュベートします。慎重に読む前に任意の表面の気泡を破ります。簡単にプレートの表面上を通過ヒートガンはうまく動作します。 </li><li>紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、510 nmの測定波長を設定し、試薬ブランクに対して吸光度を記録。この測定は、グルコース濃度に比例するキノンイミンの形成を監視します。グルコース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。 </li><li>紫外/可視96ウェルプレートリーダーを使用して、340 nmの測定波長を設定し、吸光度を記録します。この測定は、キシロース濃度に比例したNADHのNAD +の還元を、監視します。キシロース濃度は、1.3.1で調製した較正標準に基づく較正曲線から計算します。 </li></ol></li></ol> pyMBMS 28を用いて、全リグニンおよびリグニン単量体含有量の2.高スループット決意<ol><li>サンプル調製<ol><li>ステップ1.1.1、および1.1.6-1.1.8に記載の方法を用いてバイオマスを粉砕し、抽出します。これは、研削、実験のコントロールとして使用する標準のセットの抽出が含まれます。 注：pyMBMS measurementsではなく、粒子サイズに依存しているので、唯一pyMBMSプロトコルを使用する場合、バイオマスの調製は、試料は、&lt;、サンプルホルダーに4ミリメートル適合できるようにするために行われるべきです。 </li><li>約4 mgの小さなへら分配を使用したオートサンプラー用に設計された80μlのステンレス製のカップに準備されたバイオマスの（3〜5 mgのが好ましいです）。 </li><li> （または麦わら-8494;ポプラ-8492;松-8493サトウキビバガス-8491）、分析されるサンプルの少なくとも10％は、米国立標準技術研究所から入手可能なもののような管理基準であることを確認してください。標準はまた、すでに標準的な方法を用いて特徴付けられた分析されるべきサンプルに類似の任意の種であってもよいです。 </li><li>ランダムに時間をかけて可能な分光器のドリフトによるバイアスを避けるために、ピンセットを使用して、オートサンプラーカップにサンプルをロードします。注：サンプルの典型的なランダム化は、一度、すべてのサンプルの測定が含まれるであろう、再ランダム化が続きます重複した測定のためのサンプル程度の。ランダム化プログラムは、オンラインで入手できます。 </li><li>標準穴パンチを使用して、手動でなしバインダーと、型A / Dガラス繊維シートからガラスフィルターディスクを製造します。 、ピンセットでラウンドガラス繊維フィルターを持ち、サンプルカップの上にセンター、実験中に各カップ内の物質を閉じ込めるために3.5ミリメートル六角レンチを使用して、試料中に押し込みます。 </li></ol></li><li>インストゥルメンタル・プロトコル<ol><li>実験試料のために存在することができる化合物の全範囲にわたって最大強度を持つ既知の標準を用いて、質量分析計を較正します。典型的なバイオマスサンプルについては、パーフルオロトリブチルアミン（PFTBA）を使用します。 </li><li>ガス流量計を使用して、0.9 L /分のヘリウムキャリアガス流量を設定します。 </li><li> 500℃での熱分解温度とオートサンプラーソフトウェアを使用して350°Cまでの界面温度にオートサンプラー炉を設定します。注記：1/8 &quot;ステンレス鋼を加熱質量分析計にオートサンプラーを接続する熱テープで包まれた移送ラインを、250℃での熱コントローラを用いて制御されます。 </li><li>質量分析計でのデータ収集を開始し、バックグラウンドスペクトルの収集のための十分なデータを取得するために、少なくとも60秒待ってください。 </li><li> 2.2.2からの仕様に自動化されたオートサンプラー法を開始します。注意：オートサンプラーは、オートサンプラー炉に個別に各サンプルを削除します。総データ収集時間は約1.5分です。しかし、典型的な4 mgのサンプルの熱分解は、30秒後に完了しました。 </li><li> 0.5秒のスキャン速度で、質量分析ソフトウェアを使用して、各サンプルの記録総イオン量（TIC）。 m / z 30〜450の間でレコードの強度。 注意：代表的なバイオマス化合物は、17 eVの時にソフトイオン化を使用します。機器は、1,000のm / z 1から大きな間隔を記録することができます。しかし、走査速度は、コンピュータのCPUパワーによって制限されます。 </li><li> MAを使用して、スペクトルから背景を削除しますヌアルはソフトウェアで機能を強化します。注：データ収集の開始時にベースラインの60スキャン部は、平均バックグラウンド値を計算するために使用されます。この平均背景スペクトルは、質量分析計ソフトウェアで自動的に実験サンプルスペクトルから除去されます。 </li><li>データベースプログラムの中に、各サンプルのスペクトルデータを含む質量分析計ソフトウェアによって作成された単一列のテキストフ​​ァイルをインポートし、1のデータベースにすべてのサンプルを組み合わせます。スプレッドシートに適用可能なメタデータを追加します。統計ソフトウェアパッケージにフォーマットされたデータ（表計算/ CSVファイル）をインポートし、熱分解サンプルの質量の変動を考慮するためにスペクトルを正規化する意味。 </li><li>測定に使用される複製された標準サンプルのグループを分析するためにスペクトルデータを用いて、主成分分析（PCA）を実行するために、統計ソフトウェアパッケージを使用し、ならびに化学物質の分類に不可欠であるピークを評価しますローディングプロット28中の化合物。 PCAグループそのスペクトルの類似性に基づいて、サンプル、および標準のチェックは実行時に起因する機器のドリフトに実験誤差を測定することができます注意してください。 </li><li>リグニンシリン（S）/グアイアシル（G）の比を計算するために、Sのピーク面積を合計（M / Z = 154、167、168、182、194、208、および210）Gピークの和で除算124、137、138、150、164、および178で。 </li><li>総リグニン含量を計算するには、M / Z = 120、124、137、138、150、152、154、164、167、178、180、182、194、及び210とリグニンのピークを合計。 </li><li>そのようなKlasonリグニンとして、総リグニンを推定するための標準的な方法にpyMBMS測定値をスケーリングするための補正係数を算出します。 pyMBMSを使用して、標準試料に対して測定された全リグニン含量によって、個々の標準のKlasonリグニン値を割ります。 </li><li>データセット内のすべてのような種には、この補正係数を適用します。分析バイオマスの種類ごとに繰り返します。 NOTE：補正係数を分析バイオマスのS / Gに基づいて大きく変化することができます。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

次のようにハイスループットスクリーニング実験を行う際に、正確で再現性のあるデータを得るための重要なサンプル調製手順は次のとおりです。 シュガー放出アッセイ： 一般に、サンプルは、一度に、数十から数千の範囲のロットで製造されます。それぞれの主なステップは、典型的には、サンプル間の調製の変動を最小にするために前方に移動する前に、すべての試料について行われます。デ糊付けは、もともとプロトコルの一部ではなかったし、ある場合には省略することができます。ウッドコア試料と老化草本材料は、デンプン中一貫して低く、したがってばらつきを低減するために、脱糊付け必要としません。澱粉は、主要な関心事です。しかし、緑の組織植物のサンプルセットで、特に収穫は数時間にわたって生じる大きなサンプルセットについて。デンプンレベルは日照時間の間に上昇し、暗闇の間に枯渇しているとして、デンプンレベルはSで大幅に変化することができます澱粉からeveral時間とグルコースは、セルロースからのグルコースと区別がつかないため、高デンプンレベルが歪ん低反抗の測定につながるこ...

非再生可能燃料とその関連製品の下落のグローバルな供給として、科学者たちは、植物由来の源1から同様の燃料や化学物質を作成するために挑戦されています。この研究の重要な側面は、植物の種がバイオ燃料及びバイオマテリアル2,3の製造に適している可能性が決定されます。典型的には、これらの原料は、リグニン、セルロース、およびヘミセルロース含有量について評価されます。同様に、熱的、機械的、および/または化学的な前処理を経て解体（反抗）に対する感受性を持つか、その後の酵素糖化なし。より詳細な分析は、リグニンおよびヘミセルロース画分の特定の組成物、ならびに必要に応じて、最適な酵素活性を決定するために使用されます。本質的に希望する商品に生化学的または熱化学変換のための理想的な特性を持たない植物のトランスジェニック修正は鍋の大幅に拡張ソースで研究者に提供していますential原料4。小さ ​​なサンプルセットのために非常に有用であるが、植物の化学的特性を定量化するための標準的な分析方法は、サンプル5-7の数百または数千の迅速なスクリーニングには不向きです。本明細書に記載のHTP法は、迅速かつ効率的に熱および/または酵素分解に細胞壁反抗の変化をバイオマス変異体の大きな番号を評価するために開発されてきました。 これは、HTPスクリーニングアッセイは、本明細書に記載の変換または収量を最大にするように設計されていないことを理解することが重要です。目的は、従来のバイオマス試料の固有の反抗の相対的差異を決定することです。その結果、分析ステップの多くは、目的の最大変換速度または程度を得ることである &quot;典型的な&quot;バイオマス変換アッセイ、異なります。例えば、下部前処理重大度および短い酵素加水分解時間は、異なる最大化するために使用されサンプル間ences。ほとんどの場合、比較的高い酵素負荷を大幅に結果をゆがめる可能性が酵素活性の実験的変動に起因する差異を減少させるために使用されます。 植物の細胞壁と単糖の組成を決定するための迅速な技術は、酵素糖化以下の遊離したロボット、カスタマイズされた、熱化学互換性の96ウェルプレート、および標準的な実験方法8-11や、振動分光法などの楽器のプロトコル（赤外線の変更が含まれます（IR）、近赤外線（NIR）、またはラマン）および核磁気共鳴（NMR）12-17。これらの方法論は、実験の削減につながる、高セルロース、低リグニン含量、または最高グルコース、キシロース、エタノールを得ることが予想される、 などが挙げられる。これらの方法は、バイオマスや消耗品の少量を採用するダウンスケールの分析を有効にしているとの供給原料を分離するための鍵です費用18 </s&gt;アップ。この方法論的アプローチのもう一つの特徴は、種々の実験条件を迅速にすることができることであり、同時にいくつかの例では、評価しました。例えば、異なる前処理方針または酵素カクテルの様々な最適な実験パラメータを迅速に識別して使用することができるように、試験することができます。トウモロコシ茎葉9、ポプラ8,10、サトウキビバガス8、およびスイッチグラス8など人気の原料は、首尾よくこれらのHTP法を用いて評価されています。 総リグニンおよびリグニン単量体組成物はまた、一般的にバイオマスの特性を定量化します。リグニン含量の減少は、多糖類19,20の酵素消化を増加させることが示されています。 （多くの場合、シリン/グアイアシル（S / G）の含有量として報告される）リグニン単量体の比率は植物細胞壁の解体で果たす役割はまだ調査中です。一部のレポートは、S / Gでその削減を示しています他の研究は反対の傾向19,22を発表しながら、比は、加水分解21後に増加したグルコース収量につながりました。リグニンおよびそのモノマーを評価するためのハイスループット法は、振動多変量解析と結合された分光法（IR、NIR、およびラマン23-26）、および熱分解分子ビーム質量分析法（pyMBMS）27,28を含みます 。 バイオマスをスクリーニングするためのHTP法を開発する場合、いくつかの不可欠な考慮事項が念頭に置いておく必要があります。一つの重要な側面は、方法の複雑さです。技術に必要なスキルレベルとは何ですか？計量化学分析は、例えば、構築評価し、予測モデルを維持するための特定のスキルを必要とします。標準的な方法は、望ましくない、準備やデータ解析の手順を示すか、有毒な試薬を使用しています。モデルの開発は、新しいデータがモデルの堅牢性を高めるために時間をかけてモデルに組み込まれている継続的なプロセスです。別considerationはコスト削減であると提案された高スループット法の実験的な分析時間を減少させました。この方法は非常に迅速ですが、非常に高価である場合には、採用する多くのラボのための実現可能な技術ではないかもしれません。この原稿に示される方法は、スループット能力を増幅するように修正された標準化された技術の変異体です。これらのプロトコルは、定量的予測モデルの開発を必要とすることなく、興味のあるバイオマスの特性を測定します。 、モデルを開発するために使用される標準的な分析と強い相関を示すが、実際にサンプルに対する関心の量を測定するほど正確ではありませんしながら、予測方法以来、これらの技術の重要な属性です。使用方法は、基本的に、標準的なベンチスケールの分析方法のバージョンをスケールダウンしているのに対し、正確さと精度、速度とスループットのために取引されています。ほとんどの場合、この結果は、小容量のピペッティングおよび計量の上位エラーに起因するものです。同様の増加サンプルサイズとして十分な不均一性が低減されます。大規模なサンプルセットをスクリーニングし、比較することができますが、別個のキャンペーンの間とベンチスケールの結果との比較を行う際に、細心の注意を払わなければなりません。 最も時間のかかるステップは、バイオマスの物理的操作を必要とします。研削サンプルはサンプル間圧延機を掃除などのサンプルあたりのいくつかの分をとることができます。手動でアンロードをロードし、クリーニングホッパー、充填、ティーバッグやサンプルバッグを空にすることも非常に労働集約的です。各ステップは分以上かかる場合がありますが、数千のサンプルを実行すると、数時間または数日かかる場合があります。ロボットは約3〜4時間または6〜8プレート1日目ロボット-1にバイオマスと典型的な反応容器プレートをロードすることができます。この状況は、同様にテストされる種類、バイオマスの量として使用される精度パラメータに依存します。水を原子炉プレートを充填、希酸、または酵素を迅速に液体処理ロボットを使用して行われます。 Pプレートスタック（1〜20の原子炉プレート）の再治療は、アセンブリは、クールダウン時に1〜3時間がかかり、解体は含まれています。酵素加水分解は3日かかり、糖分析は、アッセイを完了し、結果を読み取るために準備時間の約1時間を加えた反応容器プレートあたり10分を必要とします。設定前処理と分析日の週間スケジュールは、継続的に週〜800〜1000のサンプルをアッセイの人間コンポーネントの奇数時間や週末の努力を最小限に抑え、合理的な作業スケジュールを収納して処理することができます。最大スループットは、主にどのくらいのハードウェア（ロボット、原子炉プレートなど ）、いくつかの要因に依存し、どのくらいの「ソフトウェア」（ すなわち 、人材派遣）マニュアル作業を行うことが可能です。実用的な上限は、2,500〜3,000サンプル/週です。しかし、その出力は、7日週の操作と複数の学生のインターンや技術を必要とします。比較では、HPLCによる3000サンプルは、SAMの約125日を必要とするであろうPLE分析に加えて、手動で分析前に反応器およびフィルタリングのサンプルにサンプルを計量の追加の労働。

<table><tbody><tr><td>Biomek FX 自動ワークステーション</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Biomek FX</td><td>自動リキッドハンドラー</td></tr><tr><td>ワイリーミル</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>3375E15 (モデル4)、または3383L20 (ミニミル)</td><td></td></tr> <tr><td>帯電防止袋</td><td>ミニグリップ*</td><td>MGST4P02503</td><td>2.5x3インチ、複数のサプライヤーが利用可能</td></tr><tr><td>錫コーティング銅線</td><td>マクマスターカー8871K84</td><td></td><td>0.016インチ直径、ベンドアンドステイワイヤー</td></tr><tr><td>ティーバッグ</td><td>ハーブコ</td><td>プレスアンドブリューティーバッグ</td><td>3.5x5インチ</td></tr><tr><td>グルコアミラーゼ</td><td>ノボザ</td>イム<td>スピリザイム燃料&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>α-アミラーゼ</td><td>ノボザイム</td><td>リコザイム SC DS</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>任意の化学供給試薬</td><td></td><td>グレード</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>任意の化学供給</td><td></td>試薬<td>グレード</td></tr><tr><td>190 プルーフ (95%) エタノール</td><td>任意の化学供給試薬</td><td></td><td>グレード</td></tr><tr><td>ホッパー</td><td>フリースレート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-井戸C-276ハステロイプレート</td><td>アスペン加工(コロラド州ラファイエット)</td><td>N / A(カスタムビルド)</td><td></td></tr><tr><td>1/8 "はんだごてチップ</td><td>シアーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコーン接着剤裏テフロンテープ</td><td>3M</td><td>5180</td><td>3 "幅(36ヤードロール)</td></tr><tr><td>酵素溶液</td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>任意の化学サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td>任意の<td>化学サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て、ポリスチレン96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>または同等品;複数のサプライヤー利用可能な</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>K-Gluc</td><td>メガザイム D-グルコースアッセイキット</td></tr><tr><td>キシロースデヒドロゲナーゼ</td><td>メガザイ</td>ム <td>K-キシロース</td><td>メガザイム D-キシロースアッセイキット</td></tr><tr><td>グルコース標準液</td><td>メガザイ</td>ム <td>K-グルコース</td><td>メガザイム D-グルコースアッセイキット</td></tr><tr><td>キシロース標準液</td><td>メガザイ</td><td></td><td>ム D-キシロースアッセイキット</td></tr><tr><td>ステンレス製サンプルカップ</td><td>フロンティアラボラトリーズ</td><td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td>ガラス繊維シート</td><td>ポール</td><td>66227</td><td>8x10" シート; 標準穴パンチでパンチされた円 サ</td></tr><tr><td>トウキビ バガス 全バイオマス原料</td><td>NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>イースタン コットンウッド (ポプラ) 全バイオマス原料</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>モントレーパイン 全バイオマス原料</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>小麦ストロー全バイオマス原料NIST</td><td></td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

リグノセルロース系バイオマスの燃料、化学品、その他の商品への変換は、再生不可能なエネルギー源の使用削減に向けた一つの可能な経路として探求されてきました。多様なプールの中から、どの植物が下流の用途に適した化学形質を持っているかを特定するには、セルロースやリグニンの含有量、または酵素糖化後の単量体の糖放出などの属性を比較する必要があります。標準的な分析方法の実験プロトコルやデータ解析プロトコルは時間がかかるため、測定できるサンプルの数が制限されます。ハイスループット(HTP)分析法は、標準分析法の欠点を軽減し、利用可能なサンプルを迅速にスクリーニングして、目的の形質を持つサンプルを分離することができます。この研究は、国立再生可能エネルギー研究所で採用されているHTP糖放出と熱分解分子ビーム質量分析パイプラインを示しています。これらのパイプラインにより、数千のプラントを効率的に評価すると同時に、労力と消耗品の削減により実験時間とコストを削減しました。

熱前処理およびそれに続く酵素糖化の複合効果は、アッセイの終了時に放出されるグルコースおよびキシロースの質量の関数として測定されます。結果は、バイオマスのグラムあたりの放出されたグルコースとキシロースのミリグラムで報告されています。これは通常、出発材料の組成分析に基づく理論収率パーセントとして報告されているベンチスケールのアッセイから報告されたデータとは全く対照的です。それはまだ週あたりのサンプルの数千に組成分析を行うことは現実的ではないように、データは、最高の質量に基づいて、変換レベルとして報告されます。これは限り比較がバイオマスの密接に関連したサンプル間で行われており、サンプルの組成があまり変化しないよう合理的なサンプル評価を可能にします。 アッセイの主な目標は、組み合わせ熱/ enzymに植物細胞壁の抵抗値の相対的差異を評価することです個々の変異体の範囲にわたってATIC糖化。これは、アッセイは、糖化のために使用される条件のいずれかを最適化しようとしないことは注目に値します。実際には、前処理の重要度の条件は理論値の70％に50％の最終的な変換収率を標的、アッセイの感度範囲を拡大...

植物の細胞壁の構造と化学的特性が評価され、バイオ燃料とバイオマテリアルの理想的な原料を特定します。標準メソッドを大規模なデータセットに適用すると、制限があります。これらのハイスループット前処理法、酵素糖化法、および熱分解分子ビーム質量分析法は、実験時間とコストを削減しながら、大量のバイオマスサンプルを比較します。

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

本手順の全体的な目的は、関連するバイオマス変異体間における熱化学的前処理および酵素加水分解の難分解性を測定することです。まず、粒径の調整、およびデンプンと可溶性糖の抽出を行うことで、バイオマス試料を試験用に調製します。次に、熱化学的に適合したハイスループット反応プレートに、バイオマスを高精度に分注します。サンプルを蒸気リアクターで前処理します。次に、市販の標準的なセルラーゼを用いてサンプルを3日間消化し、セルロースとヘミセルロースを加水分解します。最終ステップとして、GO pod法およびXDH法を用いて、酵素加水分解中に放出されたグルコースおよびキシロースの定量を行います。最終的に、ハイスループットなグルコースおよびキシロースの定量分析を用いて、出発バイオマス1gあたりの糖放出量（g糖/gバイオマス）に基づいてサンプル間の相対的な糖放出量を決定します。前処理や酵素加水分解などの他のベンチスケール手法に対するこの手法の主な利点は、数百から数千のサンプルを同時に処理できる点にあります。この方法は、どの品種や変異体が糖およびその後の製品への変換に適しているかなど、バイオマス変換分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。したがって、細胞壁合成経路において導入した変異による構造的・化学的な変化をスクリーニングできるため、本手法の意義は細胞壁の構造と機能の理解へと拡張することが可能です。また、本手法は植物細胞壁の難分解性に関する知見を提供できるほか、酵素活性や相乗効果の研究など、バイオマス変換における他の構成要素にも応用できます。一般的に、この手法に不慣れな方は、ミリグラムスケールで同一かつ同時に処理しなければならない大量のバイオマス変異体サンプルセットを扱うため、習得に苦労することがあります。そのため、専用のロボットおよび設備が必要となります。手順を開始するには、バーコード付き帯電防止袋から番号付きティーバッグへ、あらかじめ粉砕したバイオマス約250 mgを移します。デンプン除去および抽出中の損失を防ぐため、ティーバッグの両端をバイオマスの方へ折り込みながら、慎重に巻き上げてください。次に、各ティーバッグを錫メッキ銅線で閉じ、バーコード付きサンプルごとにティーバッグの番号を記録します。あらかじめ調製した脱デンプン酵素溶液500 millilitersをプラスチック容器に加えます。次に、バッチ処理プロトコルに従い、バッファー酵素溶液にティーバッグ120個を加えます。シェーカーでインキュベートした後、脱デンプン処理したバイオマスを十分にすすぎ、数リットルの脱イオン水に30分間浸漬させます。緩衝塩を除去するため、ティーバッグをソックスレー抽出器のコラムに入れます。95% ethanolを用いてソックスレー還流装置をセットアップし、サンプルを24時間抽出します。抽出が完了したら、ティーバッグを取り出し、乾燥させたバイオマスを元のバーコード付き容器に戻します。帯電防止袋から乾燥バイオマスを50 mg以上、バーコード付きホッパーに移します。正確なサンプル追跡を確実に行うため、帯電防止袋と受け取り用ホッパーのバーコードをスキャンします。ホッパーを固体計量ロボットにロードした後、乾燥サンプル5 mgを耐酸性ステンレス製容器にロボットで計量します。96ウェルプレートを用い、局所的な変動を最小限に抑えるため、各サンプルの3反復をプレート全体に分散させて秤量します。次に、各ウェルに250 µLの脱イオン水を加え、シリコン粘着剤付きのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープでプレートを密封します。1/8インチの半田ごてチップを使用して、各蒸気ポートのPTFEテープに穴を開けます。各プレートについて、プレート間に厚さ0.031 inchのガラス強化PTFEガスケットを挟み、スタックの最上段と最下段に空のプレートを配置して、プレートをしっかりと締め付けます。180 °Cに設定した蒸気リアクターを用いて、サンプルを17.5分間前処理します。処理終了後、脱イオン水で満たしてリアクタープレートを50 °Cまで冷却します。プレートが冷えたら、スイングバケットを用いて遠心分離します。ローター速度 1700 GS で 20 分間遠心します。その後、シーリングフィルムを取り除きます。新しいPTFEテープで再密封した後、あらかじめ調製した8%酵素ストック溶液を各ウェルに40 microlitersずつ加えます。密封したプレートをマグネットプレートクランプに固定します。プレートを少なくとも15回転倒混和させてサンプルを穏やかに混合し、50 degrees Celsiusで70時間インキュベートします。インキュベーション後、リアクタープレートを混合し、遠心分離します。次に、液体ハンドリングロボットを使用して、酵素結合比色法によるグルコースおよびキシロースの定量を行います。キシロースにはキシロースデヒドロゲナーゼ（XDH）を、グルコースにはグルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ（GO POD）を使用します。デッキには、GO PODおよびXDH試薬のリザーバーに加え、希釈用の水、および各試薬用の96チャンネル200 µLチップラックを配置します。これらのチップは、複数のリアクタープレートで再利用されます。また、デッキには水分の除去および糖標準液の調製に使用する使い捨ての200 µLチップと、あらかじめ調製された糖標準液が配置されています。ロボットはストレージカルーセルからHPLCバイアルと共に、加水分解混合液の希釈用、およびXDHアッセイ用とGoPodアッセイ用にそれぞれ1枚ずつ、計3枚の透明マイクロタイタープレートを取り出します。グリッパーはこれら計4枚のプレートすべてをデッキ上の所定の位置に移動させます。使い捨ての96チャンネル100 µLチップをカルーセルからデッキに搬送し、リアクターから希釈プレートへ、および希釈プレートからXDHおよびgo podプレートへの分注に使用します。可変スペースの8チャンネルピペッターを用いて、希釈プレートへのキャリーオーバーを防ぐため、リアクタープレートの各コーナーにある3つのウェルから、前処理前に添加した水を除去します。これらの12個のウェルは、96チャンネルピペッティングヘッドを用いた糖標準物質に使用されます。各コーナーのチップ3本を取り除いた状態で、希釈プレートのウェルに180 µLの水を加えます。チップを交換した後、96チャンネルピペッティングヘッドを用いて、XD、H、およびgo pod試薬をそれぞれのリザーバーから対応するアッセイプレートへ移送します。この操作を行っている間に、希釈プレートの各コーナーにある3つのウェルに糖標準液を分注します。8チャンネルピペッティングヘッドで小型チップに交換した後、96チャンネルピペッティングヘッドを使用して、加水分解上清 20 µLを希釈プレートに転送し、プレートを3回混ぜ合わせます。チップがバイオマス粒子で汚染されるのを防ぐため、サンプルは液面に近い位置から吸引してください。混合後、20 µLを順次分注します。96チャンネルピペッティングヘッドを使用して、XDHプレートおよびgo podプレートに分注します。トリエ（trier）でそれぞれ混合した後、サンプルチップ、リアクタープレート、および希釈プレートをカルーセル内の廃棄ラックに戻します。XDHプレートとgo podプレートは別のカルーセルラックに移し、1時間静置した後、紫外可視96ウェルプレートリーダーを用いて分光光度計で測定します。測定波長を510 nanometersに設定し、試薬ブランクに対する吸光度を記録します。次に、プレートリーダーの測定波長を340 nanometersに設定し、小型スパチュラを用いて吸光度を記録します。調製したバイオマス約4 milligramsを、質量分析計のオートサンプラー用80 microliterステンレス製カップに分注します。標準的なパンチを使用して、バインダーを含まないtype adガラスフィルターシートからガラスフィルターディスクを手動で作成します。ピンセットを用いて、オートサンプラーラックにサンプルをロードします。その際、分光計の時間経過によるドリフトによるバイアスを避けるため、カップにサンプルをランダムにロードしてください。校正を行い、質量分析計に適切なパラメータを入力した後、データ収集を開始し、背景スペクトル収集に十分なデータが得られるまで少なくとも60秒間待ちます。最後に、ヘリウムキャリアガスの流量を0.9 liters per minuteに設定し、オートサンプラーの自動メソッドを開始します。トレンドの例として、太平洋北西部のポプラの天然変異体755株を対象とした難分解性の調査が挙げられます。その結果、シリンジとグイルの比率が上昇するにつれて難分解性は低下し、比率が約2になると難分解性の改善が横ばいになることが示されました。ここでは、PT four CL one遺伝子がダウンレギュレートされた外れ値が見られます。ポプラにおいて、スクリーニングした100の栽培品種のうち数種では、糖放出の減少により、難分解性物質が明らかに増加していることが示されました。複数の地点で栽培され、異なる成長条件下で収穫された様々な小麦わら品種により、上記の変数の組み合わせに基づいて20の異なる個体群が得られました。これらのサンプルセットは容易に区別可能であり、正および負の変数を指し示しています。難分解性物質の熱分解において、細胞壁組成の変化を評価するために分子ビーム質量分析法を用いることができます。質量分析フラグメントは、異なるリグニンモノマーに割り当てられます。リグニン含有量の高いサンプルと炭水化物含有量の高いサンプルを比較すると、スペクトルデータの相違が明らかになります。ここでは、主成分分析と組み合わせた質量分析データの活用法について解説します。主成分負荷量プロットを用いることで、スコア分類プロットにおいてどの化学的特性が説明されているかを特定できるほか、サンプルクラスター間でどの特性が変化しているかを明らかにすることができます。この手法を習得し、適切に実施すれば、週に数千個のサンプルをスクリーニングすることが可能です。本手順を行う際は、可能な限り一貫性を保ち、関連するセット内のサンプルのみを比較することが重要です。本技術の開発後、イオン液体やアルカリ前処理などの手法を用いることで、他の研究者がハイスループットスクリーニング法や植物細胞壁の難分解性に関するその他の領域に取り組む道が開かれました。このビデオを視聴することで、粒径還元と抽出、熱化学的前処理および酵素加水分解を用い、難分解性の差異を調べるために、マイクロスケールの大量のバイオマスサンプルセットを適切に調製、処理、および分析する方法について十分に理解できたはずです。高圧、蒸気、および自動装置を取り扱うことは極めて危険であり、これらの手順を実行する際は、個人用保護具の着用や、すべての装置に安全インターロックを設置するなど、あらゆる安全上の予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

環境

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、コンテンツとポリフェノールリグニンの組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。...

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

共焦点ラマン顕微鏡法に基づく方法は、ラベルフリー植物細胞壁中のリグニンの可視化と異なる組織、試料や種の木質化の比較に支払うよう提示される。...

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

このプロトコルは、大腸菌で発現メタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性のためのハイスループットスクリーニングを説明します。画面には、ソリューションベースと高度に自動化され、吸光度測定など最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。...

メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

私達は中の真菌エンドグルカナーゼ活性をスクリーニングするために、低コスト、高スループットの方法を説明します...

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

植物バイオマスの大量のサンプルの糖化性を決定するためのシンプルな、迅速な方法が記載されている。この分析のための自動化されたプラットフォームは、96ウェルプレートおよび放出糖の前処理、加水分解と定量化のその後のパフォーマンスの分析のための植物バイオマスの準備を行います。...

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する。...

のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

適応進化と分離技術は、ヘキソースおよび酵素でペントース混合糖がundetoxified加水分解物を糖化し、40以上のグラム/ Lのエタノールを蓄積するために急速に消費することができますScheffersomyces stipitis株NRRL Y-7124の誘導体を得るために説明し、実証されています。...

エタノールへのリグノセルロースの生物変換のための堅牢なペントース発酵酵母の進化のための技術

酵素スクリーニングのためのハイスループットアッセイについて説明しています。このマルチプレックスのすぐに使用できるアッセイキットは、事前に選択されたC高原性PオリマーHイドロゲル(CPH)基質と複合体I不溶性C糖素性Bアイオマス(ICB)基質で構成されています。標的酵素は、多糖類分解エンド酵素とプロテアーゼです。...

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

OrganoCatはリグニン、発酵性糖、セルロースパルプへの穏やかな条件下でのリグノセルロースの前処理および分画の方法です。2,5フランカルボン酸を触媒とした生物原性の二相性溶媒系と2-メチルテトラヒドロフラン(2-メチルテトラヒドロフラン)では、OrganoCat製品を その際に...

有機Catプロセスを用いたリグノセルロース系バイオマスの分画

深いユーテク系溶媒ベースのマイクロ波アシスト前処理は、リグノセルロース分画および高純度リグニン回収のための、緑色で迅速かつ効率的なプロセスです。...

特殊地中海リグノセルロース残基からの超高速リグニン抽出

このプロトコルは、産業用微生物向けの標準的な高スループットスクリーニングワークフローを提供します。これはARTP変異誘発による変異体ライブラリの構築、自動マイクロ流体解析による陽性液滴スクリーニングを行い、その後結果を検証する過程を含みます。ワークフローの信頼性は、高収量の B. coagulans...

自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

学ぶリグノセルロース系バイオマスの反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング法。熱化学前処理と酵素加水分解を用いて総リグニン、リグニンモノマー、酵素糖リリースを測定し、バイオ燃料原料の評価効率を向上させる。

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

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