16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

このMALDI-TOF質量分析プロトコルの全体的な目標は、迅速で費用対効果の高い手順を通じて希少な病原体のタイピングを改善することです。この方法は、診断微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、希少な細菌性病原体の迅速な教育を可能にします。今日は、オドラティミムスとミロイデス属の細菌について話したいと思います。

方法を実演し、結果の解釈について話す。一般に、この方法に不慣れな人は、細菌の移植、メトリクスのオーバーレイ、および結果の解釈には技術的なスキルと微生物学的専門知識が必要であるため、難しいと感じるかもしれません。私たちが最初にMALD-TOF MSを使用して希少細菌をスクリーニングするというアイデアを思いついたのは、私たちの病院でミロイデス・オドラティムスによる糖尿病性食物感染症に苦しんでいる患者がいたときでした。

このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されているように、細菌DNA、16SリボソームDNAPCR、およびサンガーシーケンシングの抽出から開始します。木製のつまようじを使用して、単一の細菌コロニーを96ウェルの鋼製ターゲットのウェルに移します。スチールターゲット上の風乾生物の上に70%ギ酸の1マイクロリットルを見つけ、約2〜3分間乾燥させます。

50%アセトニトリル、2.5トリフルオロ酢酸、および47.5%の水で構成される有機溶媒中に50 mg / mlのCHCAを含む1マイクロリットルのマトリックス溶液でスポットを重ねます。汚れと重ね合わせたマトリックスをフードで約5分間自然乾燥させます。サンプルを導入するには、装置のイン/アウトボタンを押して、質量分析計のサンプルローディングポートをエアレーションします。

ローディングポートを開き、乾燥した細菌塗抹標本とマトリックスを塗布したMALDI-TOF MSターゲットプレートを挿入します。ポートを閉じて、再度避難してください。真空度を観察し、450万ミリバールに達したら測定を開始します。

MMIS解析ソフトウェアを開き、ファイルメニューをクリックします。「新しい分類」を選択すると、MALDI Biotyper Real Time Classification Wizardという新しいウィンドウが開きます。フィールドにプロジェクト名を入力します プロジェクト名 「新規」をクリックし、 新しいプロジェクト という名前の新しいダイアログボックスの下で、プロジェクト名を確認して続行します わかった」 ボタン。

MALDI Biotyper Real Time Classification Wizardで、Analyte placeウィンドウを観察します。ターゲット位置を選択し、選択した位置を右クリックして、[サンプルの追加]を選択します。自動的に開いたテーブル ビューで、サンプル名、サンプル ID、および必要に応じてコメントを入力します。

「次へ」ボタンをクリックして続行します。次に、MALDI Biotyperメソッドの選択ウィンドウを確認します。Taxonomy Trees の MSP から [Bruker Taxonomy] を選択し、[Next] をクリックして続行します。

次に、プロジェクトの概要ウィンドウを確認します。上記の挿入されたエントリを実際の分類プロジェクトで確認してください。「Finish」ボタンをクリックして、分類の実行を開始します。

適切な真空度に達すると、測定が自動的に開始されます。測定が正常に完了するまで、分類実行に従います。測定が完了したら、メニュー「View」を開き、「Results」をクリックして、MALDI Biotyper Real Time Classification Project Oneの結果表を表示します。

Bruker-Daltonik MALDI Biotyperの分類結果をデフォルトのWebブラウザでhtmlファイルとして表示します。結果を印刷して保存します。ここに示されているのは、MALDI-TOF MSによって取得されたスペクトルをリアルタイムで測定および分類したものです。

スペクトルには、種名と、測定の品質を反映したスコア値が割り当てられます。2.300を超えるスコアは、非常に可能性の高い種の同定を表しています。2.000 から 2.300 の間のスコアは、安全な種の識別を示します。

1.700 および 2.000 未満のスコアは、種の同定の可能性があることを示します。また、1.700未満のスコアは信頼できません。固体培地上の純粋な培養物で増殖した細菌性病原体の同定には、2〜3分かかります。

希少な細菌性病原体は、装置が適切なスペクトルを確実に含んでいる場合にのみ、MALDI-TOF MSで検出できることを覚えておくことが重要です。それ以外の場合は、特性評価された分離株の型付き株からMaSDAスペクトルを統合することにより、消去する必要があります。スコア結果が明確な菌株同定につながらない場合は、生化学的プロファイリングや16S rDNAシーケンシングなどのさらなる方法を適用することができます。

この方法は、細菌の検出に関する洞察を得ることができますが、真菌や嫌気性菌などの他の微生物にも適用できます。さらに、細菌抵抗性を測定することができます。有害物質であるマトリックスでの作業を忘れず、手袋、保護メガネを着用し、フードの下で作業してください。

さらに、分析チャンバー内での飛散を避けるために、マトリックスを乾燥させ、徹底的に塗抹する必要があります。