Name: 16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学ぶMALDI-TOF MSと16S rRNA遺伝子配列決定によるレア細菌性病原体の迅速同定法。Myroides odoratimimusの実例を用いて、診断微生物学における正確な病原体タイピング技術を習得できます。

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著者は、Enno Jacobs教授の継続的な支援に感謝します。

細菌DNAの1の抽出<ol><li> PBS溶液の調製<ol><li> 1.65グラムのNa 2フラスコ中HPO 4×2H 2 O、0.22グラムのNaH 2 PO 4×2H 2 Oおよび8.80グラムのNaClを秤量し、千ミリリットルの最終容量まで蒸留水で満たします。 pHを7.4に調整します。最終的な使用のための細菌プルーフ（0.22μm）のフィルターを通して溶液をろ過します。 </li></ol></li><li>グラム陰性細菌のDNA抽出<ol><li>ストリーク適切な培地上の患者材料（ 例えば 、コロンビア血液寒天）、潜在的な病原体を同定および単離。 </li><li>純粋培養を準備し、形態型を決定し、純度を確認し、文化49のためにグラム染色を行います。 </li><li>単一の細菌コロニーを選択し、1ミリリットルPBS溶液を含む滅菌2.0ミリリットルの反応管に1μlのシングルユース白金耳でそれを転送します。 </li><li> THERMOMIXでこの懸濁液をインキュベート10分間95℃でのER。インキュベーション後、室温まで冷却細菌抽出物（溶解したDNAを含む）とすると、いずれかの更なる使用（ 図1a）のために-20℃で増幅または店舗に直接それを使用しています。 </li></ol></li><li>グラム陽性細菌のDNA抽出<ol><li>ストリーク適切な培地上の患者材料（ 例えば、コロンビア血液寒天）、潜在的な病原体を同定および単離。文化の形態型を確認するためにグラム染色を行います。 </li><li>純粋培養を準備し、形態型を決定するために、文化の純度を確認するためにグラム染色を行います。 </li><li>滅菌1μlの白金耳を持つ単一の細菌コロニーを採取し、2.0ミリリットルの反応管中の500μlのPBS溶液中で、それを一時停止。 </li><li> 500μlのガラスビーズを加え、5分間、最大周波数と振幅（50ヘルツ）で運転振動ホモジナイザーにチューブを移します。直径1.0mmのガラスビーズを使用します細菌の細胞壁を破壊します。 </li><li> 95℃で10分間、このチューブをインキュベートし、室温まで冷却。さらなる使用のため-20℃でPCR反応またはストアのいずれかに直接エキスを使用してください。 </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNAのPCR <ol><li>増幅プライマーの調製<ol><li>リバースプライマーとして、フォワードプライマーとRTU4（5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;）として、プライマーTPU1（5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]）を使用します25。 100ピコモル/μlの（100μM）の濃度を有する、DNアーゼおよびRNアーゼを含まない水を有するプライマー原液を調製し、/μlの10ピコモルでのワーキング溶液に、さらにそれを希釈します。 -20℃でプライマーストックとワーキング溶液を保存したり、直接使用しています。 </li></ol></li><li> PCR反応ミックスの調製<ol><li> 25mMのMgを含む各プライマーのピペット1μlを、1μlののdNTPミックス（100 mM）の、DNA抽出液の2.5μlを、5μlの10×PCR緩衝液（Cl 2）、無菌の200μlの反応チューブへのTaqポリメラーゼ（5単位/μl）を、および39.25μlのDNAse-及びRNAseを含まないPCR水μlの0.25。 </li></ol></li><li> PCRプロトコル<ol><li>まず、のTaqポリメラーゼを活性化することが必要である95℃で5分間の初期インキュベーション工程を以下のように構築されたPCRプログラムを開始します。第二に、35増幅サイクルは、1分を含みます。 95℃、1分の変性工程。 50℃でのプライマーアニーリング工程、および72℃で1.5分間のプライマー伸長工程。第三に、72℃で10分間の最終伸長。最後に、PCR反応は4℃に冷却します。 注： 黄色ブドウ球菌及びH 2 Oは、正および負の対照を果たす（ 図1B）。 </li><li>サーモサイクラーでのPCR反応混合物を含むチューブを置き、プログラムを起動します。 </li></ol></li><li> PCR産物の精製 注：PCR産物を精製するために、いくつかのプロトコルのいずれか酵素ベース又はシリカ吸着マトリックスを使用してもよいです。ここで使用される単一段階PCRクリーンアップは2加水分解酵素反応を利用しています。エキソヌクレアーゼI（エキソ私は）一本鎖DNAを除去しながら、エビアルカリホスファターゼ（SAP）が取り込まれていないのdNTPを加水分解する。洗浄 - - 低塩溶出サイクルを第2の手順は、高速バインディング高い塩とシリカ膜吸着技術に基づいています。 <ol><li> 25μlのPCR産物にエキソIとSAPの両方を含む酵素ミックスの1.5μl加え、完全に混合し、80℃で15分間、続いて37℃で最初の15分の簡単なプロトコルを適用するサーモサイクラーに移します。 -20℃で精製したPCR産物のいずれかを保存したり、PCRを標識するためのターゲットとして直接それを使用しています。 </li></ol></li></ol> 3. DNAアガロースゲル電気泳動<ol><li>電気泳動バッファー（TBE緩衝液）の調製<ol><li> 54.0グラム（445ミリモル）TRISベース、27.5グラム（445ミリモル）のホウ酸および0.5 M EDTAの20ミリリットル（10を滴定mM）のフラスコ中のNaOHでpH 8.0の溶液と千ミリリットルの全量を蒸留水でそれを埋めます。そして、電気泳動のために蒸留水（0.5×TBE）で、この5倍のバッファー1:10に希釈します。 </li></ol></li><li>ローディングバッファーの調製<ol><li>フラスコ中に250mgのブロモフェノールブルー、250mgのキシレンシアノールFFとポリスクロースの15グラム（ 材料表）を混ぜます。次に100mlと全体積に対して0.5×TBE緩衝液を用いてそれを埋めます。他の用途のために-20℃で1ミリリットル部分とストアにローディング色素を等分。 </li></ol></li><li>アガロースゲルのキャスティング<ol><li> （w / v）アガロースゲルを2％を調製し、アガロースフラスコ中300mLの0.5×TBEバッファー（参照セクション3.1.1）6 G・標準電気泳動を量ります。次いで、アガロースが完全に溶解するまで加熱、マイクロ波オーブン内で近沸点をアガロース混合物を入れて、溶液は透明に見えます。 </li><li>溶融アガロースは十分に冷ますと、1％の臭化エチジウム（w / v）のストック・ソリュー10μlのを追加る。キャストへの溶液を注ぎ、鋳造中（30井戸を可能にする）ゲルコームを配置します。ゲルが完全に固化する際に櫛を削除し、0.5×TBE緩衝液を含む電気泳動チャンバーにゲルを置きます。 注：エチジウムブロマイドは有毒で変異原性です。そのため、慎重に取り扱ってください。ニトリル手袋を使用することをお勧めします。非毒性の代替として使用することができる代替的な挿入核酸汚れがあります。 </li></ol></li><li> PCR産物のアガロースゲル電気泳動 注：PCRアンプリコンの正確なサイズを確認し、精製したPCR産物をアガロースゲルで分離されたDNAの濃度を推定するために。 <ol><li> PCR反応チューブにローディングバッファーのピペット2μlのPCR産物の8μlを添加します。ゲルのウェルにこのミックスをピペット。 PCR産物のサイズを推定するために別個のウェル中分子量サイズマーカー（DNAラダー）の8μlを添加します。 </li><li>適用します定数10 V / cmでの電圧とは、ブロモフェノールブルーマーカーが3/4程度ゲルの全長のに達しているとすぐに電気泳動を停止します。 UV-ネーター（波長302 nm）を用いて分離したPCR断片を可視化し、ゲルドキュメンテーションシステムを使用してそれらを文書化します。 DNAラダーと視覚的に比較することによってDNAの量を推定します。標識のPCRの標的として約10 ngのを使用してください。 </li></ol></li></ol> 4.サンガーシーケンシング<ol><li>サイクルシークエンスPCR 注：市販のキット（ 材料表）を用いて、10μlの反応にPCRラベリングを行います。 <ol><li> 5倍反応マスターミックスの2μlを、DNA調製2μlの、TPU1またはRTU4作業溶液（10ピコモル/μl）をおよびDNAse及びRNAseを含まない水の4.5μlに1.5μlを添加します。 </li><li>サーモサイクラーで、この配列決定反応ミックスを入れて、別のPCRを実行します。合計では、工程25サイクル、（96℃で変性工程からなります10秒）、アニーリングステップ（45〜60°C、5秒）、および伸長工程（60℃、2分）。最後に、4℃に反応を冷却します。 </li></ol></li><li>シークエンシング反応の精製<ol><li> PCR精製（ 材料表 ）のための商業的なスピンカラムを使用して、標識化反応混合物を精製します。 </li><li>事前に含水ゲルろ過マトリックス上に配列決定反応の10μlの負荷とは、3分間750×gで遠心分離工程を行います。 注：組み込まれていない色素ターミネーターは、ゲルマトリックス中に保持され、この手順を使用することにより。 </li><li>その後、真空濃縮器中の水性溶出液を乾燥させます。乾燥を完了するために40℃で20〜30分間、2500×gで遠心分離します。 </li><li>高度に脱イオン化ホルムアミドの10μlを、次に2分間90℃で変性し、氷上で混合物を冷却加えます。ピペットで96ウェルマイクロリットルプレート上で変性したサンプルを10μl。分析の場合、-20℃で乾燥し、洗浄PCR産物を格納後で行われます。 </li></ol></li><li> 16S rRNAの遺伝子配列決定およびDNA配列の解析 注：自動シーケンサー（ 材料表 ）上の配列解析を実行します。ここで使用されるシーケンサは液状ポリマー67（ 図1c）、（50 cmの4-キャピラリーアレイ）を同時に4つのサンプルを分析する自動化蛍光ベースのキャピラリー電気泳動システムです。 <ol><li>シーケンサーでマイクロタイタープレートを置きます。 2にレイアウトとしてサンプルシート（板レコード）を書き、それを保存し、1に与えられた手順に従ってシーケンシングラン/分析を開始。 注：シーケンス実行の持続時間は2時間で、800〜1000塩基対からのデータを提供します。 </li><li>配列解析ソフトウェア（ 材料表）を開きます。シーケンスデータはテキストフ​​ァイル（.SEQ）と品質値（QV）（.ab1）を含む電気泳動を含むファイルとして与えられています。 注：基本コールが自動的にあたりです配列解析ソフトウエアにより形成され、配列は、さらに用途に使用される前に、基礎となる電気泳動（ 例えば 、ピーク高さ、ピーク分離）視覚的にチェックされます。 </li><li> BLASTアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide）を使用して、NCBIのnrをデータベースに保存されたDNA配列のファイルを比較します。 </li></ol></li></ol>前記MALDI-TOF MS 注：質量分析計は、337 nmのN 2レーザーを使用し、特定の制御ソフトウェア（ 材料表 ）によって操作されます。スペクトルは、線形モードと2,000〜20,000 Daが覆われている間の質量範囲内に記録されています。サンプルへのデータの解釈およびスコアの割り当ては解析ソフト（ 材料表 ）によってリアルタイムで行われる（ 図1D）。 <ol><li> MALDI-TOF MS分析のための細菌の調製<ol><li>コル上（ 例えば 、Myroides odoratimimus）目的の細菌を育てます細菌株（ 図2a）に応じて、18〜24時間37℃、5％のウマ血液を含むumbia血液寒天。調査中の生物の形態型だけでなく、文化の純度を確認するためにグラム染色を行います。 </li><li> 96ウェルスチールターゲット（ 図2bおよび2c）のウェルに単一の細菌コロニーを転送するための木製の爪楊枝を使用してください。スポット1鋼ターゲット上の空気乾燥させ、生物の上に70％ギ酸μlの約2〜3分間乾燥させるために残します。 </li><li>次に、有機溶媒（50％アセトニトリル、2.5％トリフルオロ酢酸47.5％のH 2 O）中に50mg / mLのCHCA（αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）を含有する、1μlのマトリックス溶液とスポットを重ねます。 注：（プレートの調製方法で）酸オーバーレイ法は、質量スペクトルの質を改善するために使用されてもよいです。グラム陽性細菌のためのそのような「酸攻撃は「スコアVAを増加させることが示されています測定されたスペクトル45の梅毒。 注：または自動サンプル調製システム（ 材料表 ）において使用することができる1μlの70％ギ酸溶液のフリースポットに接触し、第1の乾燥サイクルの後、1μlのマトリックス溶液は、細菌汚れに適用されます。次いで、試料を60％の相対湿度で標準化された条件下で乾燥させ、分析のために使用する準備ができています。 </li><li>マトリックスとスミアはフードで約5分間、再び空気乾燥を重ねてみましょう。適用されるマトリックスとこの細菌スミアは、現在、多くの時間安定です。 注：行列のない細菌塗抹標本が原因タンパク質分解に対して安定ではないかもしれません。 </li></ol></li><li> MALDI-TOF MS分析の実行<ol><li>サンプルのご紹介<ol><li>私たちのMMIS（ 材料表 ）の制御ソフトウェアを開きます。 </li><li>器具のIN / OUTボタンを押すことにより、質量分析計のサンプルローディングポートを通気。 </li><li>クリックした後、ロードポートを開き、乾燥した細菌スミアプラスマトリクスと、MALDI-TOF MSのターゲットプレートを挿入します。 </li><li>ポートを閉じて、再び避難。真空を観察し、それが到達したときに4.5×10 -6ミリバールで測定を開始します。 </li></ol></li><li>試料分析<ol><li>私たちのMMISの解析ソフト（ 材料表）を開き、「ファイル」メニューをクリックします。 「新しい分類」と新しいウィンドウ「MALDIのbiotyperリアルタイム分類ウィザード」を選択して開きます。プロジェクト名」フィールドに、Myroides計測てproject_1 &quot;例えば、プロジェクト名を入力」ボタンを押して「新規」。という名前の新しいダイアログボックスの下に「新規プロジェクト」のチェックプロジェクト名とボタン押して続行し、「OK」を。 </li><li> 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」で開いた「検体の配置」ウィンドウを観察します。選択目標位置（ 例えば 、A1、A2、A3 ...）、右CLIckの任意の（青い四角で示されている）の位置を選択し、「サンプルを追加」を選択します。サンプル名、サンプルID、および必要に応じてコメントに自動的にオープンテーブルビュータイプで。続行するにはボタン「次へ」をクリックしてください。 </li><li> 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」でウィンドウオープン」MALDI biotyper方法の選択」を観察します。 「分類学の木からのMSP &quot;から&quot;ブルカー分類」を選択し、継続して「次へ」をクリックします。 </li><li> 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」で「プロジェクトサマリー」ウィンドウのオープンを観察します。実際の分類プロジェクトのために上に与えられた挿入エントリを確認します。ボタン「完了」を押すことで実行分類を開始します（ 図2dを - f）を 。適切な真空に達したときに測定が自動的に開始されます。 </li><li>測定が正常に完了するまで、分類の実行に従ってください。トンで結果表を見ます彼は「MALDI Biotyperリアルタイム分類プロジェクトMyroides計測てproject_1「メニュー」ビュー」を開き、「結果」をクリックします。 </li><li>デフォルトのWebブラウザでHTMLファイルとして「ブルカーダルトMALDI Biotyper分類結果」を表示します。結果を印刷して保存します。 </li></ol></li><li>楽器を校正し、機器の検証毎週（楽器セルフテスト）を実行するための分析をサンプリングするために毎日の試験前の標準を測定します。 注：測定MALDI-TOFスペクトル中には解析ソフト（ 材料表 ）によりリアルタイムで分析されます。それぞれのスコアを有する10種のリストが与えられると報告のための検査室情報システム（LIS）に供給されます。 </li><li>批判のためのMALDI-TOF MSの結果（代表的な結果を参照）を評価し、適切であれば、他のそのようなbiochemical-などのテスト、および抗生物質感受性プロファイルまたは16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を含むと、必要に応じて、グラム染色微生物学レポートに細菌種を割り当てます。 </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

MALDI-TOF MS及び16S rRNA遺伝子配列の両方が異なる細菌の多くを同定する可能性を提供します。 MALDI-TOF MSは、取り扱いが容易であり、細菌の質量スペクトルの大規模なデータベースが利用可能で、高速かつ安価な方法です。このため、MALDI-TOF MSはまれな細菌性病原体17,20,39,51に焦点を当てたスクリーニング研究を実施するための迅速でコスト効率と信頼性の高い方法です。他の表現型の識別方法とMALDI-TOF MSを比較した前向き研究、ハンセンら。MALDI-TOF MS 59とタンらの費用対効果と速度を実証した。彼らの実験室環境における細菌同定用試薬および人件費の削減を報告毎年56.9パーセント62による。このようなコスト削減はGaillot らのノートでサポートされています。28 一方、16S rDNAの塩基配列決定は、より多くの時間がかかり、面倒とワラントは、pを専門...

診断ルーチンでは珍しい病原体のセキュアな識別は、古典的、文化的、生化学的方法が煩雑と時々疑問であるという事実によって妨げられています。また、診断微生物学研究室は、自動化されたシステムを使用する必要があり、毎日、数百から数千に及ぶ多数の病原体を、、処理しなければなりません。ハイスループット日々の管理に加えて、細菌種の正確な同定が必要です。彼らは抗菌薬感受性パターンが異なるため、正確な同定は、適切な抗生物質を選択するための重要な情報（ 例えば、 エンテロコッカス属、 アシネトバクター属。）12,43を臨床医に提供するので、これが保証されています。 自動化された微生物同定システム（AMIS）細菌分離株の代謝特性を特徴づけるために酵素反応の標準化セットを適用<sup&gt; 13,15,16,26,27。これらのシステムで使用されるカートリッジが異なる生化学的反応、 例えば 、多数の利用がAMISのGNカード47は、この研究52で使用され、この戦略は、細菌のみの限定セットのための安全な同定を可能にします。さらに、データベース、高度なエキスパートシステムは、明らかに医学的に重要13,15,16,36の関連と関連性の高い細菌の検出に焦点を当てています。広く研究室で使用される2つの更なるシステムは、また、細菌同定のために、この生化学的手法を適用します。種が35を水平に3 回目のAMIのみ82.4パーセントの識別精度を持っていながら、最近の研究では、本研究で用いたAMISと競合他社の1（93.7パーセントと、それぞれ93.0パーセント）との間で同等の識別精度を実証します。このような差異は、基礎となる識別データの参照、キットおよびソフトウェア、メタボの違いのバージョンの品質によって説明することができますLISMと技術者35,36の習熟度。 二つの自動化されたMALDI-TOF MSシステム（MALDI-TOF微生物同定システム、MMIS）が主に使用されています。これらのシステムは、それらのタンパク質フィンガープリント質量スペクトルに基づいて、細菌種の多数の検出を可能にします。例えば、使用MMISのデータベースは、6000参照スペクトルが含まれています。質量分析に基づく識別システムは、まれな病原体11,48,51を含む微生物の多種多様の高速で信頼性の高い検出を提供しています。現在までにわずか数の直接比較は本研究で用いたMMISとその競争相手19,33の間にご利用いただけます。 Daek らによると、両方のシステムは、識別精度の同様の高い速度を提供するが、この研究で使用MMISは、種の同定19でより信頼性の高いと思われます。 同様に、分子技術はよく保存アドレッシングだけでなく、異なる遺伝子（ <em&gt;例えば、16S rDNAのかのrpoB）明確な種の同定3,22,61を可能にします。これらのうち、16SのrDNAのため、すべての細菌34におけるその存在の最も広く使用されているハウスキーピング遺伝子です。その機能は変化しないままで、最終的には、およそ1,500塩基対では、バイオインフォマティクス14,34のために適切であることが十分な長さです。多くの研究者が細菌同定21のための「ゴールドスタンダード」として16S rRNA遺伝子解析を考えています。これは、いくつかの研究室が稀または新しい細菌14,34を識別するためのこれまでに、DNA-DNAハイブリダイゼーション技術を使用するという事実によるものです。さらに、より多くのデータベースは、16S rRNA遺伝子の分析50のために使用することができる利用可能です。しかし、それは、16SのrDNAベースの検出システムは、標準的なPCRプロトコールと比較して制限された感度を有することを考慮しなければなりません。また、分子のアプローチは、同様に、時間がかかり洗練され、高度に訓練された人材を必要とします専用の研究施設とでは、そのため、簡単に診断ルーチン55に実装されていません。さらに、細菌の同定の少なくとも2つの異なる方法の組み合わせは非常に正確な株同定をもたらすことが示されています。 MALDI-TOF MS及び16SのrDNA配列の組み合わせは、高精度の異なる細菌種の多くの同定を可能にします。最近、MALDI-TOF MSおよび16S rRNA遺伝子解析の組み合わせは、疫学的な質問や珍しい病原体56を研究する細菌同定のために提示されました。

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV、HPLCグレードの水、1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie、M&uuml;nchen, ドイツ</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>85600</td><td>振動ホモジナイザー</td></tr><tr><td>ガラスビーズ 1.0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1,000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net、ウルム、ドイツ&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>リバースプライマーRTU4(5&acute;-TAC、CAG、GGT、ATC、TAA、TCC、TGT、T-3、急性;)</td><td>biomers.net、ウルム、ドイツ&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>マスターサイクラー&nbsp;</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td>-&nbsp;</td><td>サーモシルサー</td></tr><tr><td>反応チューブ1.5 ml</td><td>SARSTEDT、N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>72,692</td><td></td></tr><tr><td>反応チューブ 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips Biozym</td><td>Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburg,</td> <td>Germany-Microwave</td><td></td></tr> <tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml;ttich, Belgium</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml;nchen, ドイツ</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml;nchen、ドイツ</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Germany-Ethidium</td><td></td></tr> <tr><td>bromide solution 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml;nchen,</td> <td>Germany-Gel</td><td>-ドキュメンテーションシステム&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 反応)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>バッファー (10x) EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di ホルムアミド (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>-</td><td>シーケン</td></tr><tr><td>サーMicroAmp光学式96ウェル反応プレート、バーコード付き</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer、プレートベース96ウェル</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer、プレートリテーナー96ウェル</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer、ウェルプレートセプタ</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer、POP-7 Polymer、7 ml</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer、4-Capillary Array、50 cm</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Software 5.4</td><td>Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik、ブレーメン、ドイツ</td><td>-</td><td>私たちのmMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute;rieux、N&uuml;rtingen, ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>デバイス制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen</td><td>, Germany-Analysis</td> <td>software</td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinamic acid, HCCA, 1&nbsp;g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptide Calibration Standard II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 target polished steel</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper ギャラクシー&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik、ブレーメン、ドイツ</td><td>部品番号 1836007&nbsp;</td><td>自動サンプル調製システム</td></tr><tr><td>ビテック2&nbsp;</td><td>bioM&eacute;rieux、N&uuml;rtingen, ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>私たちのaMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター、クレーフェルト、ドイツ</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade;Automated Microbiology System</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp;アウレウス&nbsp;ローゼンバッハ (ATCC&reg;&nbsp;25923&trade;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France</td><td></td><td>PCRのポジティブコントロール&nbsp;</td></tr></tbody></table>

16s rrnaの遺伝子配列決定およびmaldi-tof msによるレア細菌性病原体の同定

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

特に免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすことが報告されているため、十分に説明し、稀で、細菌性病原体の数があります。ほとんどの場合、ほとんどの症例報告として公開さわずか数のデータは、感染性病原体などの病原体の役割を調べるが利用可能です。したがって、そのような微生物の病原性の性質を明確にするためには、これらの細菌の多くを含む疫学的研究を行う必要があります。菌株の同定は、彼らが日常的診断において、（堅牢性）扱いやすい経済的でなければならない有効な命名法に従って正確である必要があり、それらは同等の生成する必要があります。このような調査研究で使用した方法は、以下の基準を満たさなければなりません異なる研究所間の結果。一般的に、ルーチンの設定で細菌株を識別するための3つの戦略があります。biochemicaを特徴付ける1）表現型の識別細菌のリットルと代謝特性、2）このような新規のプロ​​テオームベースのアプローチとして、16S rRNA遺伝子配列決定および3）質量分析などの分子技術。質量分析および分子的なアプローチは、細菌種の多種多様を同定するための最も有望なツールであるので、これらの2つの方法が記載されています。これらの技術を使用して進み、制限と潜在的な問題が議論されています。

MALDI-TOF MSは、新規、微生物学的診断ルーチンのための高速かつ安価な方法です。 MALDI-TOF MSによる細菌種の同定は、主に、リボソームタンパク質だけでなく、他の「環境条件によって最小限の程度に影響を受けたハウスキーピング機能を備えた非常に保存されたタンパク質」で構成されるスペクトルを生成し、このMMISの17【選択データベースは、参照スペクトルの大規模なセットが含まれていますそしてめったに臨床分離株で発見されていなくても細菌がしっかり7,56,57を識別することができます。スコア値は、識別された種の信頼性を示しています。 2.300以上のスコアが可能性が高い種の同定を表し、2.000と2.300の間のスコアがセキュアな種の同定を示し、可能性の種の同定のための1.700と2.000スタンド間のスコアと1.700以下のスコアが非信頼性があります。 2.000上記のスコアで識別される複数種の追加のTESの場合tsが適用されなければならない、これは私たちが、このような16S rDNAの配列決定、APIや、グラム染色、...

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)および分子技術(16S rRNA遺伝子シーケンシング)により、日常的な診断における希少な細菌性病原体の同定が可能になります。このプロトコルの目標は、両方の手法を組み合わせて、より正確で信頼性の高いデータを実現することにあります。

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

このMALDI-TOF質量分析プロトコルの全体的な目的は、迅速かつ費用対効果の高い手順を通じて、希少病原体のタイピングを改善することです。この手法は、診断微生物学分野における重要な疑問への回答に寄与し、希少な細菌性病原体の迅速な特定を可能にします。本日は、OdoratimimusおよびMyroides属細菌について解説します。本手法を実演し、結果の解釈について説明します。一般に、細菌の転写、マトリックスによるオーバーレイ、および結果の解釈には技術的スキルと微生物学的専門知識が必要であるため、この手法に不慣れな方は困難に感じる可能性があります。我々が、希少細菌のスクリーニングにMALDI-TOF MSを利用するという着想を得たのは、当院にMyroides odoratissimusによる糖尿病性足潰瘍感染症を患う患者さんが入院されたときのことでした。本プロトコルは、テキストプロトコルに記載されている細菌DNAの抽出、16SリボソームDNA PCR、およびサンガーシーケンシングから開始してください。木製つまようじを使用して、単一の細菌コロニーを96ウェルスチールターゲットのウェルに転写します。スチールターゲット上の風乾させた微生物の上に70% formic acidを1 µL滴下し、約2〜3分間乾燥させてください。50%アセトニトリル、2.5%トリフルオロ酢酸、および47.5%の水からなる有機溶媒に50 mg/mlのCHCAを含むマトリックス溶液1 µLをスポット上に重ねます。塗抹試料と重ねたマトリックスをフード内で約5分間風乾させます。サンプルを導入するため、装置のin/outボタンを押して質量分析計のサンプル導入ポートをエアレーションします。ローディングポートを開き、マトリックスとともに細菌塗抹標本を乾燥させたMALDI-TOF MSターゲットプレートを挿入します。ポートを閉じ、再度真空排気を行います。真空度を確認し、4.5 million millibarに達したら測定を開始してください。MMIS解析ソフトウェアを開き、ファイルメニューをクリックします。「New Classification」を選択すると、「MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard」という新しいウィンドウが開きます。「Project Name」のフィールドにプロジェクト名を入力して「New」をクリックし、「New Project」という新しいダイアログボックスでプロジェクト名を確認して、「Okay」ボタンをクリックして進みます。MALDI Biotyper Real Time Classification WizardのAnalyte placementウィンドウを確認します。ターゲットポジションを選択し、選択したポジションを右クリックしてAdd samplesを選択します。自動的に開いたテーブルビューに、サンプル名、サンプルID、および必要に応じてコメントを入力します。「Next」ボタンをクリックして進みます。次に、「selection of MALDI Biotyper methods」ウィンドウを確認してください。「MSPs from Taxonomy Trees」から「Bruker Taxonomy」を選択し、「Next」をクリックして続行します。次に、プロジェクトサマリーウィンドウを確認します。上述の実際の分類プロジェクトに入力されたエントリを確認してください。「Finish」ボタンをクリックして、分類ランを開始します。適切な真空度に達すると、測定が自動的に開始されます。測定が正常に完了するまで、分類ランを追跡してください。測定が完了したら、「View」メニューを開き、「Results」をクリックして、MALDI Biotyper Real Time Classification Project One の結果テーブルを表示します。Bruker-Daltonik MALDI Biotyperの分類結果を、デフォルトのウェブブラウザでhtmlファイルとして表示します。結果を印刷して保存してください。ここでは、MALDI-TOF MSによって得られ、リアルタイムで測定および分類されたスペクトルを示しています。スペクトルには種名と、測定の品質を反映したスコア値が割り当てられます。2.300を超えるスコアは、種同定の確度が高いことを示します。2.000から2.300の間のスコアは、種同定が確実であることを示します。1.700および2.000未満のスコアは、種の同定が濃厚であることを示します。また、1.700未満のスコアは信頼性が低いとされます。固体培地上の純培養で増殖させた細菌病原体の同定には、2～3分かかります。稀な細菌病原体は、装置に適切なスペクトルが確実に登録されている場合にのみMALDI-TOF MSで検出できることに留意することが重要です。そうでない場合は、特性解析済みの分離株の同定株からMaSDAスペクトルを統合して補完する必要があります。スコア結果から株の明確な同定に至らない場合は、生化学的プロファイリングや16S rDNAシーケンシングなどの追加手法を適用することができます。この方法は細菌検出に有用な知見を提供しますが、真菌や嫌気性菌などの他の微生物にも適用可能です。さらに、細菌の薬剤耐性を測定することもできます。有害物質であるマトリックスを取り扱う際は、手袋と保護ゴーグルを着用し、必ずドラフトチャンバー内で作業してください。さらに、分析チャンバー内での飛散を防ぐため、マトリックスと塗抹標本を十分に乾燥させることが不可欠です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

直接血培養液への航空券のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析（MS）の適用は、細菌の同定を促進。提示した方法は、血液培養ブロスから直接、グラム陰性細菌の同定のための迅速かつ信頼できる方法である。...

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

MALDI-TOF質量分析およびカスタムデータベースを使用すると、ユニークな洞窟環境（カーチェナー洞窟、AZ、USA）を常在菌を特徴づけるために

質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。...

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル...

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

IDBacは、細菌コロニーから掻き取られた細胞材料に収集された、無傷のタンパク質と特殊な代謝スペクトルの両方からのデータを統合するオープンソースの質量分析ベースのバイオインフォマティクスパイプラインです。このパイプラインにより、研究者は数百から数千の細菌コロニーを種置分類群に迅速に組織し、特殊な代謝産物生産に基づいてそれらをさらに区別することができます。...

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S...

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。...

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

このプロトコルは、カルチュロミクスとMALDI-TOF MSを組み合わせることで、乳製品中の微生物組成を迅速かつ費用対効果の高い評価を可能にします。従来の培養法よりも短いターンアラウンドタイムで、16S rRNAシーケンシングに匹敵する分類結果を提供します。...

MALDIアプローチ による 細菌プロテオミクスプロファイリングを用いた酪農の微生物安全性の評価

優先細菌性病原体の同定のための簡単​​な方法は、遺伝子組み換えレポーターファージを使用することです。その特定の宿主種に固有のこれらのレポーターファージは、、急速に宿主細胞に生物発光信号応答を伝達することが可能です。ここで、我々は、検出のためのレポーターファージの使用について説明します。...

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している...

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

学ぶMALDI-TOF MSと16S rRNA遺伝子配列決定によるレア細菌性病原体の迅速同定法。Myroides odoratimimusの実例を用いて、診断微生物学における正確な病原体タイピング技術を習得できます。

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

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