Name: AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶAC-6フィーダシステムを用いた形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成法。リンパ球系共通前駆細胞から少量の前駆細胞で大量のpDCを効率的に産生し、自己免疫疾患治療への応用可能性を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、博士に感謝しています。試薬を提供するためのマルクス・マンツとアービングワイズマン。我々はまた、それぞれ、フローサイトメトリー分析によって提供されるサービスとファーストと医学の国立台湾大学で第二のコア研究所とNTU病院の細胞選別基盤施設を認めます。この作品は、科学技術省、台湾（MOST 102から2320-B-002から030-MY3）と国民健康研究所、台湾（NHRI-EX102-10256SIとNHRI-EX103-10256SI）によってサポートされていました。

C57BL / 6野生型マウスは、国立実験動物センター（NLAC）、台湾から購入しました。すべてのマウスは、特定病原体を含まない条件下で飼育し、維持しました。プロトコルおよび動物使用手順を見直し、医学の国立台湾大学（許可番号：20120075）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。実験を行っている間に加えて、研究者は、動物のすべての痛みの可能性を減らすため、苦痛、または苦痛を行いました。手袋を着用して説明されているすべての手順は室温で行いました。 AC-6フィーダー細胞の調製注：（I.ワイズマン、スタンフォード大学によって提供された）AC-6.21（AC-6要するに）間質細胞ライン18は、RPMI中で維持されるべきである15％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。フィーダー細胞として機能するには、AC-6細胞は、γ線を照射している3000ラド（30Gy）1日との共培養の前に、その増殖を防ぐために。注目メンテナンス中に過密放置すれば、AC-6の細胞は、その分化支持能を失う傾向がある、またはその通過数は20を超えている場合。 <ol><li> 1ミリリットルダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）と吸引によってDPBSを削除すると1回洗浄AC-6細胞。 37 O℃で3~5分間、0.8 mlのトリプシン溶液（0.05％トリプシンおよびDPBSで0.5mMのEDTA）とAC-6細胞を、5％CO 2を処理した後、培養液の10容量にして、それを希釈することによって反応を停止させます単一細胞懸濁液を作ります。 </li><li> 5.9x10のAC-6細胞/ウェルを12ウェルプレートに4細胞をシードし、37°C ​​の 、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートします。 注意：AC-6細胞の密度はのCDC生成を有利に働く低密度として非常に重要です。 4細胞/ウェル5.9x10の密度で播種は、AC-6のCLPからのpDCの導出に最適である次の日、によって密集度に到達することができます。 </li><li> γ-照射を使用して3000ラド（30グレイ）のAC-6細胞を照射します。 注意：AC-6を照射するために使用される用量は、増殖から細胞を防ぎ、しかものCLPからのDCの分化に必要なサイトカインおよび細胞 - 細胞接触を提供するのに十分に長い生存を保つために最適化されます。 </li><li>培地を吸引し、1mlの完全RPMI（10％熱不活性化FBS、50μg/ mlのゲンタマイシン、βメルカプトエタノール、50μMを含むRPMI）と交換してください。 </li></ol>マウスから2アイソBM細胞<ol><li> CO 2窒息と頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。解剖トレイにマウスを置き、70％エタノールで滅菌します。半ば腹部に切開を行い、下肢をカバーする皮膚を含むマウスの先端部から皮膚を除去。 </li><li>半無菌フード内でマウスを解剖。大腿骨と脛骨を解除するには、膝関節以下上記の大腿骨と脛骨をクリップ。はさみを使用して、骨から筋肉を外し、完全RPMI 5ミリリットルを含む6センチペトリ皿に骨を置きます。 </li><li>無菌培養フードに移動します。完全RPMIで27G針に接続された3ミリリットル注射器を埋めます。はさみを使用して、骨の両端を切断し、静かにそれぞれの端から一度完全RPMIを注入することによって、骨の外に骨髄をフラッシュするために27Gの針を挿入します。 </li><li>細胞を上下に3-5回、針なし注射器を用いて培養皿で穏やかにピペッティングにより単一細胞懸濁液を準備します。 </li><li> 500×gで5分間、細胞を遠心分離し、上清をデカント。 </li><li> 1ミリリットルACKバッファー（150mMのNH 4 Clを 、10 mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA）で1分間インキュベートし、完全RPMIの10容量で希釈して反応を停止で溶解赤血球。細胞が重力によって死んだ細胞塊および組織破片をダウンペレット化するために、5分間放置します。 注意：これは原因で生細胞の沈降に細胞の損失になりますように5分以上を立たないでください。 </li><li>ゆっくりと破片を残して新しいチューブに細胞含有上清をデカント元のチューブ内の背後にあります。 </li><li>その後、上清を除去し、廃棄し、細胞をペレットに500×gで5分間遠心します。 </li><li> 100μlのFACS緩衝液（1×PBS + 2％FBS + 1mMのEDTA）中（通常は4-6×10 7のBM細胞は、1つのマウスから得られる）総BM細胞を再懸濁します。 </li></ol> 3のCLPのFACS分析およびソート<ol><li> Fc受容体をブロックするために、1〜2分間抗CD16 / 32（ハイブリドーマ上清クローン2.4G2、50μL/反応または1-2μgの/反応）、FACS緩衝液中の細胞への（ステップ2.9）を追加します。 注：抗CD16 / 32はまた、顆粒球、単球およびBリンパ球などのFc受容体を発現する細胞に対する抗体の非特異的結合を防止するために添加されたFcブロックと呼ば​​れます。 </li><li>同時に周囲光を回避し、氷上で15分間（4×10 7細胞）以下の蛍光色素標識抗体で細胞を染色します。抗体：抗CD3を含むPE結合系統マーカー（0.2μgの各）（17A2）、抗CD8（53-6.7）、抗B220（RA3-6B2）、抗CD19（eBio1D3）、抗CD11b（M1 / 70）、抗GR-1（RB6-8C5）、抗Thy1.1（HIS51）、抗NK1.1（PK136）、抗TER119（TER-119）、および抗MHC-II（NIMR-4）、0.2μgの抗c-Kitの-PerCPを-のCy5.5 （2B8）、1μgの抗SCA-1-FITC（D7）、0.4μgの抗M-CSFR-APC（AFS98）、および0.2μgの抗IL-7Rα-PE-Cy7の（A7R34）。 </li><li> 3ミリリットルFACS緩衝液で細胞を洗浄し、500×gで5分間遠心します。 </li><li> 40μMのセルストレーナーを通して300μlのFACS緩衝液およびフィルタ細胞で細胞を​​再懸濁します。 </li><li>残りの細胞を回収し、同じセルストレーナーを使用してチューブをソートする無菌FACSにフィルタリングするために、追加の100μlのFACS緩衝液でチューブを洗浄します。 </li><li>信号検出のための適切なフィルタおよび電圧を使用して染色した後すぐにフローサイトメトリー分析を行います。 PE-およびPE-Cy7の-labelded抗体および633nmのラスを検出するために561 nmレーザー、FITC-、PerCPを-のCy5.5標識抗体を検出するために488nmのレーザーを使用してERは、APC標識抗体を検出します。 </li><li>セルソーターを用いて、IL-7Rα+（ステップ3.2で染色されたように） -のc-kit は int SCA-1 INT ​​M-CSFR -以下のマーカーLINに従ってソートアウトのCLP。クッションとして完全RPMI 8 mlを含む15mlチューブで選別された細胞を収集します。 </li><li>実行終了時にセルソーターによって示されるように選別された細胞の絶対数を記録します。一般的に、5×10 4のCLPは1マウスのBMから取得することができます。 </li></ol> 4.共培養のCLPとAC-6 <ol><li> 、500×gで10分間、ステップ3.7からの選別された細胞を遠心分離し、上清を除去し、5×10 4細胞/ mlの周りに細胞密度を得るために十分な完全RPMIで細胞ペレットを再懸濁します。シード500細胞/ウェルのステップ1.4で調製したフィーダー細胞を含む12ウェルプレートに。 </li><li> 100 ngの追加/ mlのFL 19（HU-のFlt3L-IgはM.マンツ、Universiによって提供される発現系を使用して、社内で発生しましたTY病院チューリッヒ、スイス）と37°Cの 、顕微鏡下でのDC開発の定期的な視覚的な監視と5％CO 2でインキュベートします。 注：市販の組換えヒトまたはマウスFL FLは、DCの発達をサポートするHU-のFlt3L-Igのための代替物として使用することができます。 </li><li> 12日目に上清中の細胞を収集し、得​​られた上清を組み合わせた0.5ミリリットル完全RPMI培地で1回、ウェルを洗浄します。 0.5ミリリットルに新鮮な培地を追加し、セルスクレーパーで接着細胞をスクラップ。 </li><li> 500×gで5分間の部品や遠心機の両方からの細胞含有培地を組み合わせます。 </li><li> 50μlのFACS緩衝液中で上清をデカントし再懸濁した細胞。 50μlの抗CD16 / 32ハイブリドーマ上清を加え、Fc受容体をブロックするために1~2分間インキュベートします。 </li><li>列挙し、次抗体（0.05μgの各）抗CD11cの-APC（N418）、抗CD11b-FITCおよび抗B220-PEで、すべての細胞を染色。 </li><li>洗って説明するように、細胞を遠心分離ステップ3.3でD。 </li><li> 、100μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁したCD11c +の上のゲートとのCDC（のCD11c +のCD11b + B220 - ）のために分析したpDC（CD11cの+のCD11b - B220 +）の17。 </li></ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここでは、のCLPの少数から、特にDCの堅牢な世代のためのin vitro培養系を説明し、pDCに。この培養系の独自性は、フィーダーとしてのAC-6細胞、ストローマ細胞株の使用によるものです。このアプローチは、IL-7、SCF、M-CSFおよびFL 20などのサイトカインが、また、DCの発達をサポートするのに必要な細胞-細胞接触21だけでなく、提供することが示されています。 AC-6細胞は、いくつかの前駆体8,16,22からインビトロ DCの発達の研究を容易にするために以前に使用されてきました。我々は、のCLPからのpDCの効率的な分化をサポートするためにAC-6フィーダー細胞の最適な密度に播種することが重要であることを見出しました。具体的には、pDCの開発に適しており、次の日、密集度で5.9x10 12ウェルプレートの結果で4γ線を照射し、AC-6細胞を播種します。下部AC-6細胞密度（3.9x10 4 /ウェルで12ウェルプレート中）のCDC developmenを支持する傾向がありますト...

樹状細胞（DC）は、1免疫応答の制御に重要な役割を果たしているプロフェッショナル抗原提示細胞です。 DCは不均一であるが、それらは、大きく2つの集団に分類することができ、従来のDC（のCDC）および形質のDC（pDCに）2,3。リンパ器官に加えて、のCDCとのpDCは、肺、腸および皮膚2を含む組織中に見出されます。 CDCとのpDCの形態はのCDCは、デンドライト状の突起と以上のプラズマ細胞様であることのpDCの形状を呈すると、異なります。また、一般的なマウスDCマーカーCD11cのは、より高度のpDC上でのCDCより上で発現されます。 pDCに2が行うよりも、MHCクラスIIの高いレベルと共刺激分子を発現どちらのCD24 +のCDC、 -のCDCとのCD11b -また、のCDCは、さらにのCD11b + CD24に分けることができます。成熟のpDCは、一方で、選択シグレックHおよびBST2 4を発現することが示されています。 Functionally、のCDCは、pDCにはよりも優れた抗原提示細胞です。しかし、pDCには、私は、ウイルス感染または炎症性刺激5時に型インターフェロンの膨大な量を生成することができます。 両方のCDCとのpDCは短命であるため、常に骨髄（BM）6,7内の前駆細胞から補給する必要があります。致死的に照射したマウスに共通の骨髄前駆細胞（のCMP）とリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）の養子移入はのCDCとのpDCは、両方の系統8-10から生成することができることを実証しています。しかし、RAG1 / 2を発現し、IgH遺伝子座11,12に再配置DJセグメントを所有するpDCのサブセットがあります。これらの細胞はまた、B220マーカーの発現は、核酸感知受容体（TLR7 / TLR9）、および転写因子（SPIBとBcl11a）13を含む Bリンパ球との分子の類似性を共有すると、すべてがリンパ系列の署名であると考えられています。したがって、CLPsがあるため、系統の類似のpDCのインビトロ生成のための良い選択かもしれません。 ヒトおよびマウスの両方でのCDCとのpDCの頻度が非常に低いが6、DCは、特にたCDCは、（例えば、GM-CSF 11,14またはFlt3リガンドなどのサイトカインの存在下で、BMまたは前駆細胞からインビトロで生成することができるFL ）フィーダーフリーシステム11,15,16を使用 。しかし、残念ながら、それは、FL 11,15,16 を用いてインビトロでのpDCの多くを生成することは不可能です。以前に我々は、pDCには、効率的にAC-6フィーダシステム17を使用してのCLP からインビトロで生成することができることを実証しました。培養系においてAC-6間質細胞株を使用することの利点は、それが細胞 - 細胞接触とのCLPからのpDCの多数の生成をサポートするサイトカインの分泌を提供することです。このシステムの生産は非常に堅牢ですが、下記の手順を慎重にレプリケーションが私を必要とされますn個の順序のpDCの効率的な生成を確実にします。

<table><tbody><tr><td>抗マウス Ly6g/Ly6c (PE)、クローン RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>系統マーカー</td></tr><tr><td>抗マウス NK1.1 (PE)、クローン PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>系統マーカー</td></tr><tr><td>抗マウス&nbsp;CD11b (PE)、クローンM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>系系マーカー</td></tr><tr><td>抗マウスCD19 (PE)、クローン eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>系図マーカー</td></tr><tr><td>抗マウスB220 (PE)、クローン RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>系図マーカー/FACS</td></tr><tr><td>抗マウスCD3 (PE)、クローン 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>系図マーカー</td></tr><tr><td>抗マウス CD8a (PE)、クローン 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>系図マーカー</td></tr><tr><td>抗マウスMHC-II(PE)、クローン NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>系図マーカー</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119 (PE)、クローン TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>系図マーカー</td></tr><tr><td>Anti-mouse Thy1.1 (PE)、クローン HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>系位マーカー</td></tr><tr><td>Anti-mouse M-CSFR (APC)、クローン AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗マウスc-Kit(PerCP/Cy5.5)、クローン2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗マウスSca-1(FITC)、クローンD7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗マウスIL-7Ra(PE/Cy7)、クローンA7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗マウスCD11c(PerCP/Cy5.5)、クローンN418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>抗マウスCD11b(FITC)、クローンM1/70</td><td>Biolegend</td><td></td><td>101206 FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>セルソーター</td></tr><tr><td>FACS ソーティングチューブ&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>フロー解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ac-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

形質細胞様樹状細胞（pDC）感染に応答して、または炎症応答の間に活性化された細胞を産生Iインターフェロン強力型（IFN-I）です。残念ながら、pDCの機能の研究は、リンパ器官で、その低周波によって妨げられ、in vitroでのDC生成のための既存の方法は、主にpDCを超えるのCDCの生産を好みます。ここでは、効率的にin vitroでのリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）からのpDCを生成するためのユニークなアプローチを提示します。具体的には、プロトコルは、骨髄からのCLPを浄化し、Flt3リガンドの存在下でγ線を照射し、AC-6フィーダー細胞との共培養により、pDCにを生成する方法の詳細を説明しました。この培養系のユニークな特徴は、のCLPは、AC-6細胞の下に移動して、石畳の領域形成細胞になることのpDCを拡大するための重要なステップです。形態学的に異なるDCは、すなわちたpDCとのCDCは、7の組成物で約2週間後に生成されました最適な条件の下で0から90パーセントのpDCに。通常、この方法によって生成されたpDCの数はおおよそのCLPの数の100倍がシードされます。したがって、これは、確実に、これらの細胞の発達と機能にさらなる研究を容易にするために必要なのpDCを大量に生成すると、新規システムです。

4-6x10 7 BM細胞の総数は、典型的には、大腿骨一6~8週齢の野生型C57BL / 6マウスの脛骨から単離されます。 CLPを整理するには、総BM細胞は、系統マーカー（CD3、CD8、B220、CD19、CD11bの、GR-1、Thy1.1、NK1.1、TER119、およびMHC-II）に対するPE結合抗体で染色され、抗-c-Kitの-PerCPを/ Cy5.5を、抗SCA-1-FITC、抗M-CSFR-APCおよび抗IL-7Rα-PE / Cy7の、分析し、セルソーターでソート。 CLPのための選別戦略は、図1に示されている。典型的には、5×10 4のCLP一つC57BL / 6マウスから得られます。より多くのCLPを取得するには、並べ替えの前に3-4マウスからの骨髄細胞を組み合わせてもよいし、プロトコルは、それに応じて調整。 5.9x10 6 AC-6フィーダー細胞と500のCLPの共培養後、石畳の領域形成細胞（CAFC）は一日3-4によって現れ始めます。 8日目では、...

この研究では、Flt3リガンドの存在下で、一般的なリンパ系前駆細胞とAC-6フィーダー細胞を共培養することにより、効率的にpDCを生成できるin vitro培養システムを紹介します。

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

本手順の目的は、形質細胞様樹状細胞（PDC）の分化研究に向けた、効率的なPDC生成法を提供することである。この手法は、「PDCの分化はどのように制御されているのか」といった免疫学分野における重要な問いを解明するのに役立つ。本手法の主な利点は、少数の前駆細胞を用いて、大量のPDCを効率的に生成できる点にある。本手法の意義は、全身性エリテマトーデス、舞踏運動、乾癬などのPDCに関連する自己免疫疾患の治療に向けられています。本手順の実演は、研究室の学生にとって非常に有益となるでしょう。骨髄細胞採取の前日に、AC6ストローマ細胞株を5.9 × 10⁴ cells/wellの密度で12ウェルプレートの各ウェルに播種し、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌朝、AC6細胞に3000 radのγ線照射を行い、培地を1 mLの完全培地に交換します。次に、適切な数の野生型C57BL/6成マウスを解剖皿に入れ、70% ethanolで動物を滅菌します。その後、皿をセミステライルフードに移動させ、各動物の中腹部に切開を加え、下肢を含む末端部の皮膚を除去して大腿骨と脛骨を露出させます。膝関節の上方で大腿骨を、下方で脛骨をクリップで切り出し、回収しながらハサミで骨から筋肉を切り離します。これらの骨を5 mLの完全RPMIを含む6 cm Petri dishに入れ、Petri dishを滅菌培養フードに移します。次に、27ゲージの針を装着した3 mLシリンジに完全RPMIを満たし、ハサミで各骨の両端を切断します。針を各骨に挿入し、両端からそれぞれ1回ずつ完全RPMIを緩やかに注入して、骨髄を洗い流します。その後、針を外し、培養皿の中で細胞を3〜5回緩やかに吸引および分注し、単一細胞懸濁液を作成します。細胞を遠心分離した後、1 mLのCKバッファーを用いて赤血球を溶血させ、10倍量の完全RPMI培地を加えて反応を停止させます。1分後、死細胞の凝集塊やデブリを5分間静置して沈殿させ、上清を新しいチューブに慎重にデカンテーションします。その後、再度細胞を遠心分離し、全骨髄細胞を100 µLのfaxバッファーに懸濁させ、フローサイトメトリーにより共通リンパ球系前駆細胞（CLP）を解析します。次に、anti CD 16 to 32を用いて細胞を1〜2分間FCブロックし、続いて適切な抗体カクテルで細胞を同時染色します。氷上で15分間置いた後、3 mLのfax bufferで細胞を洗浄し、ペレットを300 µLの新鮮なfax bufferに再懸濁します。その後、細胞懸濁液を40 µmストレーナーでろ過し、適切なフィルターと電圧を用いてフローサイトメーターで直ちに細胞をソートします。8 mLの完全RPMIを含む15 mLチューブに、目的の細胞を回収します。高度に濃縮されたPDCM集団を生成するには、Z6フィーダーシステムを用いたin vitro培養に向けて、採取した骨髄細胞から適切なCLP集団を分取することが極めて重要です。ソート終了後、細胞を遠心分離し、細胞密度が約5×10⁴ cells/mLになるまで、十分な量の完全RPMIでCLP細胞ペレットを再懸濁します。次に、AC sixフィーダー細胞を含む12ウェルプレートに、1ウェルあたり500個の細胞を播種し、共培養系に100 ng/mLのFL threeリガンドを添加します。その後、細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、顕微鏡下で樹状細胞（DC）の発達を定期的に視覚的にモニタリングします。12日目に、共培養上清中の細胞を回収し、各ウェルを0.5 mLの完全RPMI培地で1回洗浄して、得られた上清と洗浄液をまとめます。その後、各ウェルに0.5 mLの新鮮な培地を加え、セルスクレイパーを用いて接着細胞を剥離させます。剥離した細胞と浮遊細胞を合わせ、得られた細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを50 µLのfax bufferで再懸濁します。その後、細胞数を計測し、Fcブロックを行った後、CD11c、CD11b、およびB220の発現を染色します。上述の通り、共培養細胞を解析し、常规的なCD11c陽性CD11b陽性B220陰性DC集団およびプラズマサイトイドCD11c陽性CD11b陰性B220陽性DC集団の存在を確認することができます。通常、6〜8週齢の野生型C57BL/6マウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を分離し、マウス1匹あたり5×10⁴個のCLPを得ます。上述のフローサイトメトリーによる分取後、AC6フィーダー細胞との共培養3〜4日目にコブルストーン領域形成細胞（cobblestone area forming cells）が現れ始め、その上部に円形のプラズマサイトイドDCが懸濁した状態で観察されます。8日目までに、プラズマサイトイドDCの数は12日から14日目にかけてピークに達し、その後、細胞が完全に分化したことでアポトーシスが始まり、その数は徐々に減少します。コンベンショナルDCのコロニーは、より遅い6日から8日目に現れ、より大きな紡錘形の形態を持つ接着細胞として観察されます。フローサイトメトリー分析では、共培養細胞の91%がCD11c陽性、CD11b陰性、B220陽性のプラズマサイトイドDCであり、6%がCD11c陽性、CD11b陽性、B220陰性のコンベンショナルDCであることが示され、この方法により、元のCLP集団からプラズマサイトイドDCの数が100倍に増殖したことが明らかになりました。この手順を行う際は、現像後にclpを添加する前に、a c six cellの状態が良好であり、C densityが適切であることを確認することが重要です。この手法は、DC生物学の研究者が、異なるprojectorからのDC分化を研究する際に、少数のprojectorしか使用できないという制限を克服する道を開きました。このビデオを視聴することで、C six BEATシステムを用いてCLPからin vitroでPCを生成する方法について深く理解できるはずです。

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL -...

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

樹状細胞による二次リンパ器官における抗原提示がT細胞媒介免疫応答の開始に重要です。ここでは、マウス樹状細胞を骨髄由来の文化、活性化、および2光子イメージングのための標識を示す。...

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

このビデオは、成体マウスの骨髄から樹状細胞(T細胞を活性化する主要な抗原提示細胞)を生成するためのプロトコルを説明しています。...

骨髄由来樹状細胞の作製:マウス骨髄から樹状細胞を作製する方法

出典: Cruz-Adalia、A.、 et al. T細胞は樹状細胞からのトランス感染により細菌を捕捉する J. Vis.

免疫学的シナプス形成を介したT細胞のin vitro細菌トランス感染

このビデオは、一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)から形質細胞様樹状細胞(pDC)を生成するin...

一般的なリンパ系前駆細胞からの形質細胞様樹状細胞のin vitro作製

このプロトコルは、FACSを介した細胞の分離、流体力学的遺伝子導入、およびパイエル板の免疫サブセットのフロー分析を含む技術を使用して、一般的な樹状細胞前駆体からのパイエル板での形質細胞様樹状細胞の分化を評価するための実験手順について説明します。...

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

明確な樹状細胞サブセットは、リンパ器官に稀な集団として存在するため、免疫学的実験に十分な数と純度で単離することが困難です。ここでは、マウス脾臓樹状細胞の現在知られている主要なサブセットをすべて単離するための高効率、高収率の方法について説明します。...

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

未成熟樹状細胞は、免疫と耐性のバランスを調整するために、寛容性または成熟性樹状細胞に選択的に分化させることができます。この研究は、未熟な単球由来樹状細胞(moDC)、代謝表現型が異なるin...

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de...

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

学ぶAC-6フィーダシステムを用いた形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成法。リンパ球系共通前駆細胞から少量の前駆細胞で大量のpDCを効率的に産生し、自己免疫疾患治療への応用可能性を示す。

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

さらに動画を探す