AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

本手順の目的は、形質細胞様樹状細胞（PDC）の分化研究に向けた、効率的なPDC生成法を提供することである。この手法は、「PDCの分化はどのように制御されているのか」といった免疫学分野における重要な問いを解明するのに役立つ。本手法の主な利点は、少数の前駆細胞を用いて、大量のPDCを効率的に生成できる点にある。

本手法の意義は、全身性エリテマトーデス、舞踏運動、乾癬などのPDCに関連する自己免疫疾患の治療に向けられています。本手順の実演は、研究室の学生にとって非常に有益となるでしょう。骨髄細胞採取の前日に、AC6ストローマ細胞株を5.9 × 10⁴ cells/wellの密度で12ウェルプレートの各ウェルに播種し、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌朝、AC6細胞に3000 radのγ線照射を行い、培地を1 mLの完全培地に交換します。

次に、適切な数の野生型C57BL/6成マウスを解剖皿に入れ、70% ethanolで動物を滅菌します。その後、皿をセミステライルフードに移動させ、各動物の中腹部に切開を加え、下肢を含む末端部の皮膚を除去して大腿骨と脛骨を露出させます。膝関節の上方で大腿骨を、下方で脛骨をクリップで切り出し、回収しながらハサミで骨から筋肉を切り離します。これらの骨を5 mLの完全RPMIを含む6 cm Petri dishに入れ、Petri dishを滅菌培養フードに移します。

次に、27ゲージの針を装着した3 mLシリンジに完全RPMIを満たし、ハサミで各骨の両端を切断します。針を各骨に挿入し、両端からそれぞれ1回ずつ完全RPMIを緩やかに注入して、骨髄を洗い流します。その後、針を外し、培養皿の中で細胞を3〜5回緩やかに吸引および分注し、単一細胞懸濁液を作成します。

細胞を遠心分離した後、1 mLのCKバッファーを用いて赤血球を溶血させ、10倍量の完全RPMI培地を加えて反応を停止させます。1分後、死細胞の凝集塊やデブリを5分間静置して沈殿させ、上清を新しいチューブに慎重にデカンテーションします。その後、再度細胞を遠心分離し、全骨髄細胞を100 µLのfaxバッファーに懸濁させ、フローサイトメトリーにより共通リンパ球系前駆細胞（CLP）を解析します。

次に、anti CD 16 to 32を用いて細胞を1〜2分間FCブロックし、続いて適切な抗体カクテルで細胞を同時染色します。氷上で15分間置いた後、3 mLのfax bufferで細胞を洗浄し、ペレットを300 µLの新鮮なfax bufferに再懸濁します。その後、細胞懸濁液を40 µmストレーナーでろ過し、適切なフィルターと電圧を用いてフローサイトメーターで直ちに細胞をソートします。

8 mLの完全RPMIを含む15 mLチューブに、目的の細胞を回収します。高度に濃縮されたPDCM集団を生成するには、Z6フィーダーシステムを用いたin vitro培養に向けて、採取した骨髄細胞から適切なCLP集団を分取することが極めて重要です。ソート終了後、細胞を遠心分離し、細胞密度が約5×10⁴ cells/mLになるまで、十分な量の完全RPMIでCLP細胞ペレットを再懸濁します。

次に、AC sixフィーダー細胞を含む12ウェルプレートに、1ウェルあたり500個の細胞を播種し、共培養系に100 ng/mLのFL threeリガンドを添加します。その後、細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、顕微鏡下で樹状細胞（DC）の発達を定期的に視覚的にモニタリングします。12日目に、共培養上清中の細胞を回収し、各ウェルを0.5 mLの完全RPMI培地で1回洗浄して、得られた上清と洗浄液をまとめます。その後、各ウェルに0.5 mLの新鮮な培地を加え、セルスクレイパーを用いて接着細胞を剥離させます。

剥離した細胞と浮遊細胞を合わせ、得られた細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを50 µLのfax bufferで再懸濁します。その後、細胞数を計測し、Fcブロックを行った後、CD11c、CD11b、およびB220の発現を染色します。

上述の通り、共培養細胞を解析し、常规的なCD11c陽性CD11b陽性B220陰性DC集団およびプラズマサイトイドCD11c陽性CD11b陰性B220陽性DC集団の存在を確認することができます。通常、6〜8週齢の野生型C57BL/6マウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を分離し、マウス1匹あたり5×10⁴個のCLPを得ます。上述のフローサイトメトリーによる分取後、AC6フィーダー細胞との共培養3〜4日目にコブルストーン領域形成細胞（cobblestone area forming cells）が現れ始め、その上部に円形のプラズマサイトイドDCが懸濁した状態で観察されます。

8日目までに、プラズマサイトイドDCの数は12日から14日目にかけてピークに達し、その後、細胞が完全に分化したことでアポトーシスが始まり、その数は徐々に減少します。コンベンショナルDCのコロニーは、より遅い6日から8日目に現れ、より大きな紡錘形の形態を持つ接着細胞として観察されます。フローサイトメトリー分析では、共培養細胞の91%がCD11c陽性、CD11b陰性、B220陽性のプラズマサイトイドDCであり、6%がCD11c陽性、CD11b陽性、B220陰性のコンベンショナルDCであることが示され、この方法により、元のCLP集団からプラズマサイトイドDCの数が100倍に増殖したことが明らかになりました。

この手順を行う際は、現像後にclpを添加する前に、a c six cellの状態が良好であり、C densityが適切であることを確認することが重要です。この手法は、DC生物学の研究者が、異なるprojectorからのDC分化を研究する際に、少数のprojectorしか使用できないという制限を克服する道を開きました。このビデオを視聴することで、C six BEATシステムを用いてCLPからin vitroでPCを生成する方法について深く理解できるはずです。