フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

この手順の全体的な目標は、フィーダーフリー条件でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞またはIPCを生成することです。この手法は、IPS細胞を臨床応用する方法など、再生医療分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、IPS細胞を潜在的な害リファクタリングを含めることなく治癒できるため、病原性のリスクが軽減されることです。

この技術の意味は、この侵襲的な細胞サンプリングと組み合わせた、開発IPS細胞を未定義の病原体にさらすリスクを減らすため、世界の臨床的に関連性のあるIPS細胞ベースの治療法を拡張します。したがって、この方法は、IPSサービスの臨床療法に関する洞察を提供することができます。また、疾患モデリング条件などの他の領域にも適用できます。

活性化ヒトT細胞の調製を開始するには、10ミリリットルのヘパリン処理全血を10ミリリットルのDPBSピペットで希釈し、15ミリリットルのFOL溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに希釈します。希釈した血液をチューブの内壁に沿ってゆっくりとピペットで動かし、溶液の上に重ねます。

インターフェースを邪魔しないように注意してください。チューブをGの400倍で室温で30分間遠心分離します。遠心分離後、下部の透明層、単核細胞を含む薄い白色の層、上部の乳白色のプラズマ層の3つの層を観察します。

単核細胞層を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、フィットホール溶液を移さずにします。次に、DPBSを追加して、総容量を10ミリリットルにします。チューブをGの200倍にして室温で5分間遠心分離します。

上清を捨て、細胞を10ミリリットルのDPBSで洗浄し、チューブをGの200倍で5分間遠心分離し、上清を取り除きます。次いで、1ミリリットルのKBM 5 0 2培地を細胞に加え、ヘモサイトメーターを用いて細胞培養皿を調製し、6ウェルプレートのウェルを1ミリリットル当たり10マイクログラムの抗ヒトCD3抗体溶液PBSでコーティングする。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で少なくとも30分間インキュベー

インキュベーション後、抗体溶液をプレート8から取り出し、PBSシードで1平方センチメートルあたり10〜5番目の細胞の密度で単核細胞を1平方センチメートルあたり2.5倍に洗浄し、KBM5 0 2培地をコーティングした6ウェルプレートで、培地を変更せずに細胞を3〜7日間インキュベートし、 その時点で、T細胞は3〜7日後にコンフルエントに達するはずです。活性化T細胞を培地で15ミリリットルのコニカルチューブに移し、Gの200倍で5分間遠心分離します。SNATを取り外し、1ミリリットルの新鮮なKBM 5 0 2ミディアムを追加します。

抗CDの2ミリリットルのKBM5 0 2培地中の6つの細胞を抗CD3抗体被覆6ウェルプレートの各ウェルに1.5×10の細胞とプレートをカウントし、次にOC3、SOX2、KLF4、およびC-M-Y-C-HおよびLセンディウイルス溶液を氷上で各ウェルに個別に溶かし、各ウェルに10の感染の多様性を溶かします。摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。次に、感染した細胞をピペットで収集し、15ミリリットルの円錐管に移します。

細胞をGの200倍で5分間遠心分離します。上清を取り除き、2ミリリットルの新鮮なKBM 5 0 2培地を追加します。6ウェルプレートのウェルで細胞を交換し、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。

細胞を後退させるには、まず基底膜マトリックス溶液を摂氏4度で一晩解凍し、DMM F12中プレート10ミリリットルの思考溶液0.2ミリリットルを溶かし、基底膜マトリックス溶液5ミリリットルを100ミリメートル皿に溶解します。プレートを室温で少なくとも30分間放置して、細胞を播種する前にマトリックスが皿をコーティングできるようにします。その間、SAIウイルスに感染したT細胞を15リットルの円錐管に集め、Gの200倍で5分間遠心分離します。

次に、1ミリリットルの新鮮なKBM 5 0 2培地に口蓋を再懸濁し、30分間のインキュベーション期間後にヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。基底膜マトリックス溶液を2つのプレートから取り出し、次に1×10を5番目の細胞に再懸濁し、1×10を6つの細胞に別々に10ミリリットルの新鮮なM-T-E-S-R培地、ipsc用のフィーダーセルフリー培養培地に再懸濁します。各細胞懸濁液を別々の100mmプレートにピペットで移します。

プレートを細胞培養インキュベーターでインキュベートします。20〜30日後に隔日で媒体を交換します。胚性幹細胞のコロニーに似たコロニーが現れるはずです。

IPSC増殖用の6枚のウォールプレートを調製するには、各ウェルに1ミリリットルの基底膜マトリックス溶液を室温で30分間インキュベートします。その間、IPSCコロニーを含む培養プレートを実体顕微鏡で観察し、20マイクロリットルのピペットでコロニーを掻き集めて個々のコロニーを分離します。各コロニーをウェルと20マイクロリットルのM-T-E-S-R培地を含む96ウォールプレートに移します。

コロニーを移した後、各ウェルに200マイクロリットルのM-T-E-S-R培地を追加し、コロニーを破壊するために上下にピペットで動かします。6つのウェルプレートから基底膜マトリックス溶液を除去した後、個々のコロニーから各ウェルに細胞を移し、次に2ミリリットルのM-T-E-S-R培地を追加し、細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートし、フィーダーフリー培養および無血清培地を使用して培地を隔日で交換しました。免疫蛍光染色により、nano T 3、4、SSEA four、TRA one 60、およびTRA 180 1を含む典型的な多能性細胞マーカーの発現が明らかになりました。

これらの派生IPSEラインで。この手順を試みる際には、すべての重要な無菌性とバイオセーフティの考慮事項をすべて考慮して、すべての手順を実行することを忘れないでください。