Name: フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ フィーダーフリー条件下でセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞からiPSCを生成する方法。再生医療や疾患モデリングへの応用可能性を示し、従来法より安全性の高い細胞治療開発に貢献します。

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我々は、技術支援のために慶應義塾大学医学部から佳子三宅さやかKanaami、Chihana藤田美穂山口、夏子辺見、とレイ大野に感謝します。この研究の一部は健康研究成果の実用化を加速するために、R＆Dシステムズ支援プログラム、および再生医療の実現のためのハイウェイプログラムによって資金を供給されました。

1.活性化されたヒトT細胞を準備します<ol><li> 10ミリリットルを静脈穿刺によってドナーからのヘパリン化全血を採取します。 <ol><li>静脈穿刺の前にドナーのインフォームドコンセントを取得します。静脈穿刺は、資格や訓練を受けた者が行う必要があります。 </li><li>滅菌装置と、次の適切なバイオセーフティ指針に得られた血液サンプルを処理します。 </li></ol></li><li> 10 mlのD-PBSを用いて全血10 mlのヘパリンを希釈（ - ）。 </li><li>新しい50mlのコニカルチューブに15ミリリットルフィコール溶液（フィコール・パックプレミアム）を置きます。 </li><li>ステップ1.3でフィコール液にステップ1.2で作製した20 mlの血液溶液をレイヤ。電動ピペットを用いて、血液溶液は、管の内壁に沿ってゆっくりとステップ1.2の実行を準備しましょう​​。血液溶液とフィコール溶液を混合しないように注意してください。 </li><li>室温で30分間、400×gで遠心分離します。 「遅い」遠心減速度を設定します。 注：遠心分離した後、白い薄いです層は、上部乳白色の血漿層と下部透明なフィコール層との間に現れます。このホワイト薄い層は、単核細胞が含まれています。 </li><li> 1 mlのピ​​ペットを用いて新しい50mlのコニカルチューブに、単核細胞層を転送します。フィコール液を含まないように注意してください。 </li><li> 10ミリリットルの合計体積に単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）D-PBSを追加します。 </li><li>上清を捨てます。単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）のD-PBS 10ミリリットルを追加します。 </li><li> 、上清を捨て、収集した単核細胞にKBM502培地1mlを追加し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 6×10 5以上の単核細胞を、フィコールを用いて適切な分離と全血をヘパリンmlの10から得ることができます。 </li><li> D-PBS中10μg/ mlの濃度の抗ヒトCD3抗体溶液を調製します（ - ）。サーフソーク、6ウェルプレートに、抗ヒトCD3抗体溶液を加えます各ウェルのエース、少なくとも30分間、5％CO 2インキュベーター中、37℃で皿をインキュベートします。 </li><li>各ウェルからの抗ヒトCD3抗体溶液を除去し、D-PBSで1回洗浄（ - ）細胞を播種する直前に。 </li><li> KBM502培地中の抗ヒトCD3抗体でコーティングした6ウェルプレートに2.5×10 5細胞/ cm 2の密度で、ステップ1.9で調製した種単核細胞。 T細胞がコンフルエントに達するまで、培地交換せずに3-7日、5％-CO 2インキュベーター内で37℃でインキュベートします。この期間中のT細胞が両方懸濁し、接着細胞です。 </li></ol>センダイウイルスベクターを用い2.感染ヒトT細胞<ol><li> 3-7日の培養後、ピペッティングすることによって、既存の媒体と活性化T細胞を収集します。室温で5分間、200×gで15 mlのコニカルチューブと遠心分離機にそれらを転送します。 </li><li>上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。細胞とプレート1をカウントします。5×10 6細胞を、抗CD3抗体でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに（2 mlの新鮮な培地でKBM502）。 </li><li>氷の上に、OCT3 / 4-たSeV /TSΔF、SOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）-sev /TS15ΔFのセンダイウイルスソリューションを解凍します。 </li><li> -sev /TS15ΔFは、感染の多重度（MOI）の各ウェルに個別にSOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）、OCT3 / 4のSeV /TSΔFを含むセンダイウイルスソリューションを追加します。さらに24時間、5％-CO 2インキュベーター内で37℃で10インキュベートの。 </li></ol> 3.ヒトT細胞からのSeVベクターを削除します<ol><li> 24時間感染後、ピペットを用いて感染した細胞を収集します。接着細胞が存在する場合、それらは容易に繰り返して上下にピペッティングして取り外すことができます。 15mlのコニカルチューブにそれらを移し、室温で5分間、200×gで遠心します。 </li><li>センダイウイルスベクターを含む上清を除去し、2ミリリットル新鮮なKBM502媒体を追加します。 EACで細胞をReplate井戸の時間。さらに24時間、5％-CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li></ol> 4.マトリゲル層上の細胞を再播種<ol><li> 4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。 注：マトリックスゲルは、（本研究で用いた特定のブランドのための材料リストを参照してください）​​完全に解凍されるように、4℃でO / Nを解凍する必要があります。使用直前まで氷上で保管してください。 </li><li> 100-mmディッシュにディッシュ当たりプレート5 mlの基底膜マトリックス溶液と、細胞を播種する前に、少なくとも30分間室温で残します。少なくとも二つの100mm皿を一つの実験に必要とされます。 </li><li>ピペッティングによりセンダイウイルス感染細胞を回収し、15mlのコニカルチューブに転送し、室温で5分間、200×gで遠心します。 </li><li>上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。 CEの数を数えます血球計数器を使用してLLSは、100 mmの基底膜マトリックス被覆に100 mmのステップ4.2で作製した料理やプレート1×10 5〜1×10 6細胞（10ml中の新鮮なmTeSR媒体）から基底膜マトリックス溶液を除去料理。最後に、コロニーは簡単にピックアップされたプレートを使用しています。 </li><li> 5％-CO 2インキュベーターO / Nで37℃で皿をインキュベートします。 </li><li>一日おきにmTeSR媒体を肉mlの10に培地を変更します。 注：約20〜30日、感染後、密接に胚性幹細胞（ESC）の似ているコロニーが表示されます。 </li></ol> 5. T細胞由来のiPS細胞を展開<ol><li> 4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。 </li><li>プレート1 6ウェルプレート中でウェルあたり基底膜マトリックス溶液のミリリットルとで室温で残しますコロニーを選ぶ前に少なくとも30分。 </li><li>ウェルあたりmTeSR培地20μlを96ウェルプレートを埋めます。 </li><li> 20μlのピペットを用いて実体顕微鏡下のESCに似たコロニーを選択します。 注： 図1（b）に示すように、ESCのと性IPSCのコロニーをラウンドとフラットです。 </li><li>転送は、ステップ5.3でmTeSR媒体で満たされた96ウェルプレートにコロニーを選択しました。 </li><li> 200μlのピペットを用いて実体顕微鏡下で小さな塊にコロニーを破壊するために上下にピペッティングし、慎重に各ウェルにmTeSRの培地200μlを加え、。 5.2によく準備から基底膜マトリックス溶液を除去し、ウェルあたりmTeSR培地2mlで基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに各コロニーを置きます。 </li><li>一日おきにmTeSR媒体を肉mlの2にメディアを変更します。 </li></ol> 6. T細胞由来のiPS細胞を維持 T細胞由来のiPS細胞を維持することができます人間性IPSCとヒトESCと同様の技術を使用して格納されています。 iPS細胞コロニーが成長したら、同じ手順を繰り返すことによって、より大きな皿にそれらを展開します。 <ol><li> 1〜2日ごとにmTeSR媒体を変更します。 </li><li>コロニーは、細胞は、製造業者の説明書に従って、ヒトiPS細胞およびヒトESCの解離溶液を使用して、毎5~7日経過コンフルエントになったとき。 </li></ol>

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著者らは、開示するいかなる競合や利害を持っていません。

マトリゲル、mTeSR培地、およびSeVベクターの組み合わせを使用して、無血清および無フィーダーの条件下でヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルについて説明します。iPS細胞の臨床応用には、iPS細胞を安定的に生成するためのプロトコルと、低侵襲な細胞サンプリング方法が重要です。マトリゲルとmTeSR培地の組み合わせによるiPS細胞の生成は、ノックアウト血清置換(KSR)培地とフィーダー細胞を使用したものよりも低いリプログラミング効率を示しましたが、この組み合わせはドナーからのiPS細胞の安定した生成を達成します16。安定したiPS細胞生成と低侵襲細胞サンプリングには、iPS細胞生成のためのドナー数を増やすことができるという利点があります。 
マイナス鎖RNAウイルスであるSeVベクターは、宿主ゲノムに組み込まれていません。したがって、腫瘍形成のリスクは、因子誘導20〜24の再プログラミングの段階で回避することができる。さらに、フィーダー層の代わりに定義された培地とマトリゲルの組み合わせを使用するフィーダーフリー条件により、未知の外因性因子への曝露の潜在的なリスクを最小限に抑えることができます。これらの技術の融合により、再生医療に侵襲性が低く、より安全なiPS細胞技術が提供されます16。
このプロトコルの重要なステップは、ヒトT細胞を活性化するステップ(ステップ1)とSeVベクターで感染させるステップ(ステップ2)です。SeV感染後、最適な時期に培養皿中にESC様コロニーが得られない場合は、以下の点を考慮する必要があります。第一に、T細胞の最適な活性化がSeV感染に重要であるため、T細胞活性化前の単核細胞のコンフルエンスは適切ではない可能性があります25,26。単核細胞の密度が高すぎると細胞死につながり、T細胞の適切な活性化が妨げられます。単核細胞の密度が低すぎると、T細胞の適切な活性化と増殖も妨げられます。したがって、単核細胞のコンフルエントをチェックし、それに応じて調整する必要があります。第二に、SeVベクターの投与量が十分ではない可能性があります。iPS細胞コロニーの誘導効率は、ウイルスの投与量に依存します6。SeV感染後にESC様コロニーが観察されない場合は、ウイルス投与量を15〜20のMOIまで増やすオプションを検討する必要があります。iPS細胞コロニー分化の兆候が観察された場合、培地を交換する頻度は、1日おきに、またはコロニーが大きい場合は毎日に増やすことができます。 
このプロトコルの制限は、この方法がウイルスフリーではないことです。細胞リプログラミング用のSeVは簡単に市販されていますが、ユーザーは適切なバイオセーフティレベルに従って機器を準備する必要があります。統合のないiPS細胞を生成する別の方法として、エピソームベクターはこれまで27〜29まで使用されてきました。 エピソームベクターは、バイオセーフティのレベルが低い機器で使用できますが、エピソームベクターは極めて低い速度で宿主ゲノムに挿入される可能性があります。したがって、SeVを使用する場合と同様に、導入遺伝子の消失を確認するために追加のチェックが必要です。
この技術には動物由来の製品がまったく含まれていないという別の制限があります。マトリゲル、抗CD3 mAb、解離溶液、SeV溶液などの一部の基質は動物性食品に由来するため、異種病原体を移すリスクと関連しています。しかし、培養システム中の動物由来の基質の削減は、リスクが低いため、iPS細胞技術の臨床応用にとって意味があります。

性IPSCは、再生医療1-3のための細胞の画期的な供給源として大きな注目を集めています。現在までに、iPS細胞を生成するための多様な方法が4,5報告されています。これらの中でも、ヒトT細胞から生成されたiPS細胞のための細胞採取6~8の低侵襲法の特に注目されています。さらに、T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、したがって抗原特異的T細胞9,10の源です。そのため、安全性T細胞由来のiPS細胞を生成する再生医療の進展のために有用です。 この方法は、予測不可能な病原性の危険性を減少させるという概念に基づいています。性IPSCの安全な臨床応用のためには、病原体11への暴露の危険性を低減することが重要です。以前に多能性幹細胞の多くの培養系において、ウシ胎児血清およびフィーダー細胞を、必須の試薬として使用されています12秒 。 iPS細胞の生成は、予測不可能な病原性の危険性を低減するが、培養系からのこれらの試薬の両方を除去することが好ましいです。 さらに、この方法は、患者からの浸潤性細胞のサンプリングおよびフィーダー細胞の面倒な準備を回避するという利点を有します。 T細胞由来のiPS細胞は、既に疾患研究13,14に首尾よく使用されているため、この方法も適用可能であり、患者の疾患特異的iPS細胞を生成するために有用です。 遺伝子車両としてセンダイウイルス（SeVの）ベクターを用いて、T細胞の再プログラミング方法の中でも、高効率7,16でiPS細胞を生成することができる方法です。センダイウイルスは、一本鎖RNAウイルスであり、複製のためのDNAの相を必要としないため、また、iPS細胞の生成におけるその使用は、宿主ゲノム17-19を破壊が回避されます。したがって、我々は血清FRにおけるヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立していますEEおよびマトリゲル、mTeSR媒体の組み合わせを使用して無フィーダー条件、およびセンダイウイルスベクターです。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>精製NA/LEマウス抗ヒトCD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>ウシアルブミン画分V溶液</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>使用前に室温で温めてください</td></tr><tr><td>解離溶液</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>和光</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV ベクターキット CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>氷上で解凍してから使用</td></tr><tr><td>100mm組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160;ml遠心分離機チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160;ml遠心分離チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢t細胞から人工多能性幹細胞の生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

最近では、性IPSCは、再生医療のための細胞の新しいソースとして注目を集めています。 iPS細胞を生成するための初期の方法は侵襲的生検および導入遺伝子のレトロウイルスゲノムに挿入して得られた皮膚線維芽細胞に依存していましたが、これらの欠点を回避するために多くの努力がなされてきました。ヒト末梢T細胞がiPS細胞を生成するためのユニークな細胞源です。 T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、抗原特異的T細胞の供給源です。さらに、ゲノム中のT細胞受容体の再配置は、個々の細胞株を標識し、移植したドナー細胞とを区別する可能性を有します。性IPSCの安全な臨床応用のためには、有害な薬剤に新たに生成されたiPS細胞を曝露する危険性を最小限にすることが重要です。ウシ胎児血清およびフィーダー細胞は、多能性幹細胞培養のために必須であったが、リスクを軽減するために、培養システムから削除することが好ましいです。予測不可能な病原性の。これに対処するために、我々は、未定義の病原体へのiPS細胞を曝露する危険性を低減するためにセンダイウイルスを用いて、ヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立しました。センダイウイルスを処理することは、適切なバイオセーフティーレベルと機器が必要ですが、センダイウイルスに感染はゲノム挿入せずに、まだ高効率でT細胞を活性化しました。このプロトコルでは、我々は、活性化T細胞培養およびセンダイウイルスの組み合わせを使用して無フィーダー条件でヒト末梢T細胞からのiPS細胞の生成を実証します。

<html>このプロトコルを使用して、ユーザは安定したヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成することができます。センダイウイルスおよびマトリゲルを有するT細胞からのiPS細胞の生成は、約0.002％を示した-いくつかのドナー例とのSeVの間での細胞のリプログラミングの効率の0.005％は、いくつかの通路16の後には検出されなかった。図1（a）は、T細胞由来を生成するためのプロトコルの概略図を示します。マトリゲルとmTeSR媒体を用いた無フィーダー条件で性IPSC。センダイウイルス感染後20〜30日の周りに、iPS細胞のコロニーをそれらのESCコロニー様形態（ 図1B）によって認識されます。免疫蛍光染色は、無フィーダー条件（ 図1C）の下で生成されたT細胞由来のiPS細胞に典型的な多能性細胞マーカー（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）の発現を明らかにしました。 &quot;幅=&quot; 700 &quot;/&gt; 図1（A）：この研究では、フィーダーフリー条件下での再プログラミングT細胞のためのプロトコルの概略図。 （B）：典型的なESCのようなiPS細胞コロニーフィーダーフリーの条件下で採血後27日目に。 （C）：T細胞由来のiPS細胞でALP染色および多能性および表面マーカーの免疫蛍光染色（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）は、フィーダーを含まない条件下で生成<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

本手順の全体的な目的は、フィーダーフリー条件下でヒト末梢血T細胞から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を作製することです。この手法は、iPS細胞をどのように臨床応用できるかを含む、再生医療分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、潜在的な有害因子の混入なしにiPS細胞を培養できることであり、これにより病原性のリスクを低減できます。この手法は低侵襲な細胞サンプリングを可能にし、さらにiPS細胞を未知の病原体にさらすリスクを低減できるため、臨床的に意義のあるiPS細胞ベースの治療法へと応用が期待されます。したがって、本手法はiPS細胞を用いた臨床治療に知見を提供し得ます。また、疾患モデリングなどの他の領域にも適用可能です。ヘパリン処理した全血10 mLをDPBSで希釈し、活性化ヒトT細胞の調製を開始します。50 mLコニカルチューブにFOL溶液15 mLを分注します。希釈した血液をチューブの内壁に沿ってゆっくりとピペッティングし、溶液の上に層を形成させます。界面を乱さないように注意してください。チューブを室温で400 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、下層の透明な層、単核細胞を含む薄い白色の層、および上層の乳白色の血漿層の3層が観察されます。単核細胞層を、フィコ密度勾配溶液が混入しないように新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。次に、DPBSを加えて全量を10 millilitersにします。室温にて200 ×gで5分間、遠心分離を行います。上清を廃棄し、10 millilitersのDPBSで細胞を洗浄した後、チューブを200 times Gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。次に、細胞に1 milliliterのKBM 5 0 2培地を加え、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞培養皿を準備するため、6ウェルプレートの各ウェルに10 micrograms per milliliterのPBS希釈抗ヒトCD3抗体溶液をコーティングします。プレートを37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの条件下で少なくとも30分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートから抗体溶液を除去し、PBSで1回洗浄します。コーティング済みの6ウェルプレートに、KBM502培地合計2 mLを用いて、単核細胞を2.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。培地を交換せずに3〜7日間インキュベートし、T細胞がコンフルエントになるまで培養します。3〜7日後、活性化したT細胞を培地と共に15 mLコニカルチューブに移し、200 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、1 mLの新鮮なKBM502培地を加えます。細胞数をカウントし、anti-CD3抗体でコートした6ウェルプレートの各ウェルに、KBM 502培地 2 mLを用いて1.5 × 10⁶個の細胞を播種します。次に、OC3-SOX2、KLF4、c-MYC、およびL-Sendaiウイルス溶液を氷上で融解します。各エンジニアリングSendaiウイルスを、感染多重度（MOI）10で各ウェルに個別に添加します。37 °C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートします。その後、感染した細胞をピペットで回収し、15 mLコニカルチューブに移します。細胞を 200 ×g で 5 分間遠心分離します。上清を除去し、2 mL の新鮮な KBM 5 0 2 培地を加えます。細胞を 6 ウェルプレートのウェルに戻し、細胞培養インキュベーターで 24 時間インキュベートします。細胞を播種するために、まず基底膜マトリックス溶液を4°Cで一晩解凍します。解凍した溶液0.2 mLを10 mLのDMEM/F12培地で溶解させ、基底膜マトリックス溶液5 mLを100 mmディッシュに分注します。細胞を播種する前に、マトリックスがディッシュをコーティングできるよう、プレートを室温で少なくとも30分間静置します。その間に、SAIウイルス感染T細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、200×gで5分間遠心分離します。次に、ペレットを1 mLの新鮮なKBM 502培地で再懸濁し、30分間のインキュベーション後に血球計数計を用いて細胞数を計測します。2枚のプレートから基底膜マトリックス溶液を除去し、1 × 10⁵個の細胞と1 × 10⁶個の細胞を、それぞれiPSC用のフィーダーフリー培養培地である10 mLの新鮮なM-T-E-S-R培地で再懸濁します。各細胞懸濁液を、別々の100 mmプレートにピペッティングします。プレートを細胞培養インキュベーターで培養します。20～30日後から、1日おきに培地を交換してください。胚性幹細胞コロニーに類似したコロニーが出現します。各ウェルに基底膜マトリックス溶液を1 mLずつ分注し、室温で30分間インキュベートして、iPSC拡大用の6ウェルプレートを準備します。その間に、iPSCコロニーを含む培養プレートを実体顕微鏡で観察し、20 µLピペットで掻き取って個々のコロニーを分離します。各コロニーを、20 µLのM-T-E-S-R培地が入った96ウェルプレートのウェルへ移します。コロニーを移した後、各ウェルに200 µLのM-T-E-S-R培地を加え、ピペッティングしてコロニーをバラバラにします。6ウェルプレートから基底膜マトリックス溶液を除去した後、個々のコロニーから細胞を各ウェルに移行させ、2 mLのM-T-E-S-R培地を加えて細胞培養インキュベーターで培養し、フィーダーフリー培養および無血清培地を用いて1日おきに培地を交換しました。iPSCはヒト末梢血T細胞から作製されました。免疫蛍光染色により、Nanog、Oct4、SSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81を含む典型的な多能性細胞マーカーの発現が確認されました。これらの誘導IPSE細胞株において。この手順を行う際は、すべての重要な無菌操作およびバイオセーフティに関する考慮事項を念頭に置いて、すべてのステップを実施することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

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