結腸幹細胞変異の定量
2015年9月25日
私たちは、マウスが潜在的なDNA損傷剤に曝露した後の体細胞結腸幹細胞の突然変異の再現性測定のための大幅な改善を報告します。
この手順の全体的な目標は、結腸幹細胞のグルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼまたは G 6 PD 遺伝子の表現型体細胞変異を定量化することです。推定遺伝毒性物質による動物の処理後、これは最初に、G 6 PD変異を持つ幹細胞の子孫が陰窩に完全に存在するのを待つ適切な時間を待つ薬剤で動物を治療し、動物を犠牲にし、結腸を取り除き、それをスイスロールに形成し、組織を液体窒素で凍結することによって達成されます。2番目のステップは、クライオスタットを使用して、結腸からのスライド上に厚さ7ミクロンの凍結切片を準備することです。
組織を摂氏37度に温めた後、組織切片の周囲に組織染色ごとのウェルを構築します。最後のステップは、組織切片をG six PD染色混合物でインキュベートし、次に光学顕微鏡下で切片を分析することですG 6 PD活性染色が青色で、表現型変異のある細胞は白っぽく見えます。最終的には、変異したクリップスの定量化を使用して、突然変異の頻度を決定します。
この技術は、幹細胞におけるグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ体細胞変異を測定するもので、これが結腸発がんにおける重要な細胞集団です。体性幹細胞の突然変異を同定することにより、突然変異の頻度を治療動物の結腸がんの発生と相関させることができます。この方法は、結腸の幹細胞変異に関する洞察を得ることができますが、他のモデル生物や臓器系にも適用できます。
幹細胞のニッチを特定できる場合、一般的にこの方法に不慣れな個人は、MBT溶液の調製に苦労します。可溶化します。MBTソリューションでは、詳細な手順に細心の注意を払う必要があります。2 ミリリットルのpH 7.4リン酸緩衝液を最適な切断温度の35ミリリットルまで、または50ミリリットルのチューブ内のOCT培地で組織学的染色溶液の調製を開始し、激しく振とうしてpHペーパーを使用して組み合わせます。
溶液が約pH 7.4であることを確認しました。次に、グルコース6リン酸とDPおよび塩化マグネシウム溶液をテキストプロトコルに示されているようにリン酸緩衝液に溶解し、再び、溶液のpHが約7.4のままであることを確認しました。M-M-P-M-S溶液を加え、激しく混ぜます。
これにより、透明で濃い赤色のホモジネートが溶液をホイルで包み込み、光への曝露を最小限に抑えることができます。溶液が濁った場合は、オイルバスの加熱中に廃棄する必要があります。別に、0.4ミリリットルのジメチルホルムアミド0.4ミリリットルの無水エタノールとMBTをOリング蓋付きの2ミリリットルチューブに混合することにより、5ミリモルのニトロブルーからテラズ発煙硫酸またはMBT溶液を調製し、チューブを緩く密封し、MBTが溶解するまでオイルバスで激しく沸騰させます。
次に、MBT溶液を室温まで冷ましてから、OCT反応混合物に加えます。溶液は、時間の経過とともに、最初のオレンジ色の赤から濃い赤または紫に色が変わる場合があります。動物を治療し、テキストプロトコルに示されているように凍結切片を調製した後、シリコーングリースフィットパルファムで接着された2つのスチールワッシャーを使用して組織染色用のウェルを作製し、ワッシャーのベースに溶液を配置する中心を切り取ります交換します。
戦前、冷凍ティッシュは摂氏37度の湿度の高い部屋で10分間スライドします。次に、ウェルをスライド上に置き、組織切片を、予め調製したG six PD染色混合物の約半ミリリットルで各組織切片ウェルに囲み、45〜50分間インキュベートします。暖かい部屋からスライドを取り外し、スライドからステンレス鋼のウェルを慎重に取り外します。
スライドを長い方の端に置き、反応ミックス混合物を排出した後、30〜60分間の洗浄と100ミリモルのリン酸緩衝液を洗浄します。G six PD染色液の最終的な微量を除去するには、スライドと脱イオン水を5〜10分間すすぎ、残留リン酸緩衝液を除去します。最後に、スライドにフルオロゲルを滴下して組織を密封し、30分間乾燥させて、後で分析するための画像を取得します。
スライドを光学顕微鏡に置き、DX倍率を4倍に調整します。次に、5.0メガピクセルのカメラで染色された組織切片の写真を撮り、調査した陰窩の総数を推定します。マウスごとに、表面積が最小のレベルからセクションを選択し、10 倍の倍率で画像化します。
ミュータントクリップの数を数えます。次の基準によると、地下室全体には青色がありません。地下室の外側の構造は無傷です。
変異体は隣接する7ミクロンのセクションで観察され、2人の観察者が同じ陰窩を変異体として識別します。このセクションの陰謀の数を視覚的に数え、各コロンでスクリーニングされたレベルの数を掛けます。DNA損傷剤であるアゾキシメタンで処理したマウスで観察された変異クリップの例は、ここで見ることができます 左側に、突然変異陰窩の垂直または上から見た図が見えます。
右側は水平または側面の図ですが、陰窩が突然変異体であると宣言されるためには、陰窩内のすべてのセルが残っている必要があります。少量の白を含む白い陰茎は、杯細胞からの粘液産生によるものです。突然変異の頻度は、観察された突然変異体の数を、突然変異体なしでスクリーニングされた陰窩の総数で割ったものとして計算されます。
この処置に続いて、10倍からマイナス5倍までの1倍未満の突然変異頻度を示す対照マウスの結腸にクリップスが観察されたが、アゾキシメタン処理マウスは10の4.44倍からマイナス4の幹細胞突然変異頻度を示した。グルコース×リン酸デヒドロゲナーゼ変異の種類の遺伝的解析などの他の方法を実行して、化学薬品が突然変異をどのように誤ってコードするかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、変異原性化合物や発がん性化合物の可能性があるマウスの体性幹細胞の変異を測定する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、潜在的なDNA損傷物質への曝露後の結腸幹細胞における体細胞変異を定量化する方法を提示します。焦点はグルコース6リン酸脱水素酵素（G6PD）遺伝子と処理されたマウスにおける変異頻度の測定プロセスです。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 幹細胞生物学
背景
- 体細胞変異は細胞機能に影響を与え、疾患に寄与する可能性があります。
- G6PDは細胞代謝にとって重要な遺伝子です。
- 変異頻度を理解することで、遺伝毒性効果の評価に役立ちます。
- 結腸幹細胞は組織再生とホメオスタシスに不可欠です。
研究の目的
- 体細胞変異を測定するための再現可能な方法を開発すること。
- 遺伝毒性物質が結腸幹細胞に与える影響を評価すること。
- G6PD遺伝子の変異頻度を定量化すること。
使用した方法
- 潜在的なDNA損傷物質によるマウスの処理。
- 幹細胞の子孫が結腸暗視細胞に定着する時間を許容。
- 結腸からの凍結組織切片の準備。
- 染色と光学顕微鏡下での切片分析。
主要な結果
- 処理されたマウスにおける変異暗視細胞の成功的な定量化。
- 染色による表現型変異の同定。
- 変異測定のための信頼できる方法の確立。
- 結果の再現性の大幅な改善。
結論
- この方法は体細胞変異を研究するための貴重なツールを提供します。
- 結果は遺伝毒性物質の影響の理解に貢献します。
- 将来の研究は、さらなる洞察を得るためにこの方法論を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying somatic mutations in colonic stem cells enables early detection of genotoxic effects from candidate compounds, directly informing risk assessment in oncology drug discovery. This phenotypic assay provides predictive confidence for mechanistic de-risking at the target validation stage, supporting portfolio triage and prioritization of compounds with lower carcinogenic liability. The method's reproducibility and quantitative outputs strengthen cross-functional decision-making in preclinical safety evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mutation frequency in critical stem cell populations following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by linking genotoxicity to functional outcomes in tissue-resident stem cells.
- Provides quantitative evidence for target validation and early-stage compound triage.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, reproducible enzymatic assay for detecting phenotypic mutations in situ.
- Facilitates standardization of genotoxicity screening across compound libraries.
- Generates quantitative, observer-confirmed outputs suitable for comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mutation frequency data with disease-relevant endpoints in colon carcinogenesis models.
- Enables continuity from discovery-stage genotoxicity findings to preclinical safety assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on stem cell mutation burden.
Pipeline & Workflow Integration
This phenotypic mutation quantification assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early genotoxicity assessment with downstream safety workflows.
- Discovery Biology: Provides a direct readout of somatic mutation induction in stem cells, clarifying compound mechanism-of-action risks.
- Screening: Offers reproducible, quantitative mutation frequency data for compound ranking and selection.
- Analytics: Enables statistical comparison of mutation rates between treatment and control groups, supporting data-driven decisions.
- Translational Research: Connects in vivo mutation data to disease-relevant models of carcinogenesis.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems or model organisms with identifiable stem cell niches.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotoxicity risk and target validation.
- Operational Value: Standardizes mutation detection and quantification for reproducible results.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage attrition due to unforeseen carcinogenicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on stem cell mutation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, cryosectioning, and enzymatic histochemistry.
- Demands access to cryostats, light microscopy, and quantitative image analysis tools.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for solution preparation and scoring criteria.
- Adaptable to other tissues with defined stem cell compartments, pending niche identification.
- Careful solution handling and observer validation are critical for assay reliability.
