Name: 結腸幹細胞変異の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ結腸幹細胞におけるG6PD遺伝子の体細胞変異の定量法。マウスを用いた遺伝毒性物質処理後の変異頻度測定と組織染色解析により、大腸発がん研究に重要な手法を確立する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は何の確認応答がありません。

実験手順や動物の倫理的な治療は、ピッツバーグ大学IACUC（プロトコル＃1104674）によって承認されました。 G6PDの染色用混合物の調製注：次のように各試薬の最終濃度であることを確認してください。 5mMのグルコース-6-リン酸（G6P）。 2mMのNADP、5mMのMgCl 2、0.35 mMの1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート（MMPMS）及び0.8mMのNBTの初期濃度は40 mlの最終容積のために導出された各試薬については1,8,9。溶液を、新たに調製し、毎日使用しました。 <ol><li> 50mlのチューブに10月培地35 mlに200mMのpH7.4のリン酸緩衝液（PB）の2ミリリットルを加え、激しく振ります。ソリューションは、pH約7.4であるpH試験紙で確認してください。そうでない場合は、解決策を捨てます。 </li><li> 61ミリグラムG6Pが200mm PBの0.94ミリリットルに溶かし追加、61ミリグラムNADPは、200mMのPBの0.94ミリリットルに溶解し、41mgの塩化マグネシウムは 0.96ミリリットルの100mMのPBに溶解しました。 pHがあることを再確認〜7.4ウィット時間pH試験紙。ない〜7.4場合は、ソリューションを破棄します。 </li><li> 200mMのPB（pH7.4）での0.25ミリリットルに溶かしMMPMS 5mgを追加します。精力的に透明な暗赤色のホモジネートを生成するために、得られた反応混合物を振ります。解決策が濁っている場合、混合物は捨ててください。反応混合物を含むチューブは、光への暴露を最小限に抑えるためにホイルで包まれています。最後のコンポーネント、NBTは、用意されている間、室温で反応混合物を保管してください。 </li><li> Oリングと蓋2 mlチューブにNBTの164 mgの0.4 mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF）と0.4 mlの無水エタノールを添加することにより、別々に5mMのNBT溶液を調製します。 loosely蓋を閉じます（しっかりと密封されていない）と、NBTが溶液になるまでオイルバスで活発な沸騰の解決策をもたらす。8 </li><li>可溶化されたNBTを室温まで冷却した後、10月の反応混合物へのソリューションのすべてを追加し、透明な溶液を得るために、積極的に振るようにします。暗赤色またはパープに最初の橙赤色から溶液の色の変化を観察経時ル色。これは正常です。 </li><li>使用前に1時間37℃の暖かい部屋で、最終的なG6PD染色混合物を置きます。 </li></ol> 2.動物の治療や組織採取<ol><li> DNA損傷剤 、例えばで6週齢のC57BL / 6雄マウスを治療、腹腔内注射により200μlのPBSの容量で10mg / kgのアゾキシメタン（AOM）。腹腔内注射により200μlのPBS対照マウスを扱います。 </li><li> IACUCプロトコルによって承認され、90日には、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを安楽死させます。 </li><li>外科的胸骨のベースにちょうど肛門上から腹腔を開きます。体腔から小腸に移動し、それを切除しないでください。ちょうど直腸に盲腸以下の低い腸を切除。10 </li><li>慎重にマイクロ解剖ハサミを使用して、コロンの一辺に沿ってスライスし、きれいな滅菌PBSで洗浄することによって開かれたコロンから糞便を削除します。物品税スイスロールDの外側に向け腔側とコロン、および組織型内の場所。10 </li><li>完全に10月の媒体にコロンを浸すと、液体N 2を含むデュワーに金型を配置します。プラスチックベースはちょうど10月の媒体が固体凍結されるまで液体N 2と接触するように金型を持ちます。 </li><li>凍結切片を切断するまで-80で凍結組織ブロックを格納します。 G6PD酵素の不活性化をもたらす任意の固定液を、使用しないでください。 </li></ol>凍結切片の調製<ol><li> -25℃でクライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さで凍結組織切片をカットします。 4連続した7μmのセクションをカットし、同じスライド（ 図1）上でそれらのうちの2つを配置します。コロン（ 図1）の1つのレベルを表すために2スライド、または4つの連続した7μmの切片を作製。 </li><li> PRの最後のセクションから&gt;50μmの最小距離と次のレベルのために繰り返しeviousレベル。この距離は、各レベルについて評価陰窩が互いに重複していないことを確実にしました。 </li><li>よく切断中に蓄積する10月の残留物を除去するために、100％エタノールでクライオスタットブレードを拭きます。切片が再開される前に、乾燥したブレードは、蓄積された静電荷を消散させる帯電防止ドライヤーシートで拭きます。 C. O -80で凍結切片と店舗スライド</li></ol>凍結切片の組織の4染色<ol><li>湿度の高い37℃の暖かい部屋で、酵素組織化学反応を実行します。 注：インキュベーションオーブン内またはスライドウォーマー上の酵素反応をしようとは、貧しい人々や一貫性のないG6PD染色につながりました。 </li><li>シリコーングリース（ 図1）を使用して一緒に結合された2つの1.5センチメートルのx 0.15センチメートル鋼ワッシャー（内径×高さ）を使用して、組織染色用の井戸を構築します。中心とウェルのベースに合わせてパラフィルムをカット切り取り、井戸の場所スライド上の組織切片の上にD。 注：洗濯機の底部にパラフィルムは、スライドし、組織切片上の粘性G6PD染色混合物を維持して座金との間にシールを作成します。研究では、各組織切片は、G6PD反応染色混合物の同じ体積を受信するように、0.5ミリリットル容量 - この構築物は0.4とよくを与えます。 </li><li> 10分間、暖かい部屋で37°Cの時に凍結した組織スライドをインキュベートします。 37℃で、45〜50分間、各組織切片ウェル（ス​​ライドあたり2つのセクション）にG6PD染色反応混合物を追加します。暖かい部屋からスライドを取り外し、慎重にスライドオフステンレス製の井戸を持ち上げます。 </li><li>反応媒体を排出できるようにするために彼らの長いエッジでスライドを設定します。組織染色を乱すことなく組織からG6PD染色反応混合物を除去するために30〜60分間、100mMのPB（pH7.4）中置きスライド。 PB塩を除去するために5〜10分間蒸留水中でスライドを沈めます</li><li>追加することによって、組織をシール組織上にスポイトからフルオロゲルをると、それが乾燥するために〜30分を待っています。変異した陰窩の識別を混乱させるできる気泡を避けてください。 注：気泡が形成した場合は、手順は、蒸留水に浸漬してフルオロゲルを除去した後に繰り返すことができます。彼らはトラップ気泡に傾向があるように、カバースリップを使用しないでください。 </li></ol> 5. G6PD変異陰窩の決意と変異頻度<ol><li>光学顕微鏡下でG6PD変異陰窩のためのスライドを分析します。 注：完全に変異クリプトを識別するために使用される基準は、（ⅰ）全体陰窩は青色を欠いていました。 （ii）の陰窩の外部構造（iii）は、変異体のcryptは、（iv）の二人の観察者は、変異体と同じ地下室を識別しなければならなかった、隣接する7μmの切片で観察した、無傷でした。隣接7μmの切片で観察された変異体は、1つの変異体としてカウントされます。 </li><li>画像各G6PD変異40倍の倍率でcryptと5.0メガピクセルのカメラとを使用して画像をカタログイメージングソフトウェア。 </li><li> 10倍の倍率（図1C）で最小の表面積とイメージを持つレベルから各マウスについての代表的な部分を選択してマウスで調べた陰窩の合計数を定量化します。 注：レベルは、その近接にしばしば複数のセクションに陰窩変異SHOW 4つの連続7μmの切片（ 図1D）を表します。レベルは、コロンの異なる領域から陰窩を可視化するためにミクロン50&gt;で分離されています。 </li><li>各画像ファイルを開いて、視覚的に（ 図1Cにボックスとして示されている）ファイルを解析することにより、レベルに陰窩の数を数えます。画像ファイルは、一つのファイルに20〜300&gt;に陰窩ような低いから観察陰窩の数が異なります。 </li><li>各コロンのためのG6PD変異陰窩についてスクリーニングレベルの数によって各マウスのために選択されたレベル（ 図1C）から陰窩の合計数を掛けます。例えば、の総数変異陰窩についてスクリーニング8レベルを乗じ選択されたレベルごとに1,250陰窩10,000陰窩の合計数に等しいです。統計分析のために各コロン10,000陰窩の最小値を評価します。 </li><li>各治療のため、MFを計算するためにスクリーニング陰窩の総数ですべての動物で観察された変異体の数を組み合わせます。未処理マウスにおける背景幹細胞MFレベルが&lt;0.1x10 -4以前にC57BL / 6マウスで報告されているものに近い（ 表1）、。11であります</li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
<li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+%28g6pd%29+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry%3A+a+consumer%E2%80%99s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li>
<li>Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
<li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li>
<li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li>
<li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多くの場合、化合物の遺伝毒性作用はDNAを改変する能力によって決定されます。これは通常、組織を単離し、DNA付加体の全体的なレベルを測定することによって行われます。 AOMの場合、これはOを結腸6 -メチルグアニン付加物を定量伴います。そのような幹細胞ニッチのような特定の細胞型内の損傷に対するこのアプローチの情報を使用して、失われます。付加体の小さなサブセットのみが最終的に固定された変異に変換されているのでまた、DNA付加体は、変異と同じではありません。12私たちは再現可能グリフィスによって記述最初の方式に基づいて、結腸中の幹細胞変異を定量化するために、本 ​​明細書に詳細を提供ら 1とVanNordenによって開発されたG6PD染色に基づく。4,8,9,13,14 定量化の結果を生成するには、この酵素の組織化学法のためのいくつかの重要なステップがあります。一つは、組織の切片です。かなり多くの組織派イオンが生成され、典型的には、H＆E組織学的分析で行われるであろうものよりも分析...

大腸癌は、DNAに損傷を与えることができ、環境エージェントと食物成分への曝露を伴い、（ 例えば 、APC）の腫瘍抑制遺伝子に変異を癌遺伝子に体細胞変異を活性化（例えば、β-カテニン）または不活性化生成すると考えられています。これは、これらの重要な突然変異は結腸幹細胞において生じることが想定されます。なぜなら結腸上皮の固有の暗号アーキテクチャのために、それは、結腸発癌に関連する化学物質に動物を曝露した後に、結腸中の幹細胞の変異を測定することができます。突然変異がクリプト内の全ての細胞に存在することになるなど、いくつかのX連鎖酵素は、幹細胞で起こる突然変異のための指標としての役割を果たすことができます。 以前は、手順は、マウスにおいて結腸腫瘍を誘発する化学物質はまた、X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子の突然変異の分析によって結腸における体性幹細胞の突然変異を生成することを実証掲載されました。1-3この方法は、任意選択圧なしで結腸幹細胞におけるランダムな体細胞変異の発生率を定量化します。手順は、処理されたマウスおよび対照マウスからの未固定凍結された大腸セクションの生産と機能G6PD活性を産生する細胞を欠いている陰窩の同定を含みます。 、白く見えるこれらの変異した陰窩は、変異はまた、変異したG6PD遺伝子を有する子孫を生じさせた幹細胞で発生したことを示しています。酵素アッセイでは、G6PD欠損変異体の陰窩は、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の還元のために必要とされるグルコース-6-リン酸を酸化することができません。 G6PD酵素が機能している場合には、染色用混合物中のNBT青色酵素及び「染色」は、細胞の位置に蓄積し、不溶性のホルマザン沈殿物に還元されます。 G6PDの変異体である細胞は青く染色された野生型陰窩とは対照的に白っぽいまま。この方法は、「ヌル」表現型を有する変異を測定します。 enため、zymes、例えば、G6PDとして、切片を水溶液中に置かれた場合に非固定組織切片上で細胞外に拡散することができ、それは分析されるべき組織切片中の酵素を安定化するために必要であり、図4中の酵素の安定化組織は、G6PD酵素反応に必要な試薬の小分子の拡散を妨害してはなりません。 私たちは、元のプロシージャに大幅な変更の数を行いました。重要な酵素染色培地は、pH制御およびアッセイにおいて使用される成分の可溶化を容易に最適切削温度化合物（OCT）にポリビニルアルコールから変更されています。それぞれの組織切片は、G6PD反応混合物の同じ量を受信するようにスチールワッシャからなる0.5 mlのウェル - 染色は、0.4を用いて行われます。手順がなくても、結腸組織の大規模なサンプリングを提供して撮像されたセクション内の陰窩の数を推定するために開発されましたmanually&gt;各コロンのための10 5陰窩をカウントします。隣接7μmの組織切片の分析は、潜在的な染色アーチファクトを低減する複数のスライド上の変異陰窩の視覚化を提供します。これらの変更は、手順がより効率的かつ再現可能にします。 この修正されたプロトコルを使用して、我々は、げっ歯類においてよく知られている結腸の発癌物質のアゾキシメタンをC57BL / 6マウスの曝露後の結腸幹細胞の突然変異頻度を定量化している。5-7

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr>:<tr><td>ニトロブルー、テトラゾリウム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース-6-リン酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、1-メトキシ-5-メチルフェナジニウム、メチル硫酸塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、リン酸緩衝液(pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>最適切削温度コンパウンド(OCT)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5メガピクセルカメラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td></td><td></td><td></td></tr>を備えた<tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr>光顕微鏡<tr><td>ウォームルーム&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

結腸幹細胞変異の定量

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

幹細胞の変異を測定する能力は、化学物質が潜在的に癌を引き起こす突然変異を誘発することができた場合、どの程度に重要な細胞集団に定量化するための強力なツールです。 X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で幹細胞変異を定量化するための酵素アッセイの使用は、以前に報告されている。1この方法は、得られる反応混合物と切片の組織の凍結切片とのインキュベーションの準備が必要青色細胞は、機能的なグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）酵素を生成した場合。そうでない場合、細胞が白っぽく見えます。我々は、ポリビニルアルコールの代わりに、最適切削温度化合物（OCT）培地を用いて反応混合物に変更しました。これは、pH測定を容易にG6PD染色成分の可溶化を増加させ、G6PD酵素の拡散を制限します。突然変異は、幹細胞で生じたことを実証するために、全体の陰窩はG6PD酵素を欠いている必要があります活動。幹細胞が抱いている場合のみ、表現型G6PD変異は陰窩における子孫のすべては、G6PD酵素活性を欠くであろう。幹細胞変異を有する陰窩を識別するために、4つの連続した​​隣接する凍結切片（レベル）が7μmの厚さで切断しました。隣接するカットを作るこのアプローチは、同じ変異した地下室は、隣​​接するセクションで観察されるので、地下室が完全に変異させたコンホメーションを提供します。 50μmより離れた組織サンプルとスライドは、マウスあたり&gt; 10 4陰窩の合計を評価するために調製しました。突然変異頻度は、治療群では、野生型（青）陰窩の数で÷観測された変異した（白）陰窩の数です。

動物に結腸幹細胞変異を測定する能力は、癌誘発に変異を相関させるユニークな方法を提供します。通常、これは、発癌における重要な段階は、癌遺伝子における突然変異を活性化および/または腫瘍抑制遺伝子における変異を不活性化することを含むものとします。私たちは、200μlのPBSまたはPBS200μl中10mg / kgのAOMとC57BL / 6マウスに注射。 AOMは、既知の大腸発がん性物質である。コロンは、幹細胞の変異について分析した90 ​​日目で5-7。この時間は、幹細胞は完全に地下室を移入できるようにするために必要とされ、G6PDを生成しません全体の陰窩は、幹細胞の変異体として同定された地下室がある場合のみ。完全変異陰窩の例は、 図2に示されている。この図は、凍結切片の調製に生じる陰窩の垂直方向と水平方向の二つの異なる方向を示しています。水平側面図を提供しながら、垂直ビューは、陰窩の長軸を見下ろしています。叫び杯細胞からの粘液産生に起因しているいくつかの白と青のG6PD染色のために、野生型であり、PTS。スライド上の陰窩の数（ 図1）および変異陰窩...

私たちは、マウスが潜在的なDNA損傷剤に曝露した後の体細胞結腸幹細胞の突然変異の再現性測定のための大幅な改善を報告します。

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

本手順の全体的な目的は、結腸幹細胞におけるグルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PD）遺伝子の表現型体細胞突然変異を定量化することである。潜在的な遺伝毒性物質を投与した動物を用いてこれを実施するには、まず動物に当該物質を投与し、G6PD突然変異を持つ幹細胞の子孫が陰窩を完全に占有するまで適切な時間を待機させる。その後、動物を屠殺して結腸を摘出し、スイスロール状に形成して組織を液体窒素で凍結させる。第2のステップでは、クライオスタットを用いて結腸から7 µm厚の凍結切片をスライド上に作製する。組織を37 °Cまで加温し、組織切片の周囲に組織染色用のウェルを作成します。最終ステップとして、組織切片をG6PD染色混合液でインキュベートし、その後、光学顕微鏡下で切片を解析します。G6PD活性のある細胞は青色に染色され、表現型変異を持つ細胞は白っぽく見えます。最終的に、変異したクリプトの定量化を行い、変異頻度を決定します。本手法では、結腸の癌化において極めて重要な細胞集団である幹細胞におけるグルコース-6-リン酸脱水素酵素の体細胞変異を測定します。幹細胞の体細胞変異を特定することで、処理した動物における変異頻度と結腸癌の発生率との相関関係を明らかにすることが可能です。この方法は、結腸の幹細胞変異に関する知見を提供しますが、他のモデル生物や器官系にも適用できます。幹細胞ニッチを同定できる場合、一般的にこの方法に不慣れな方は、MBT溶液の調製に苦労することがあります。溶解についてですが、MBT溶液の調製には詳細な指示への細心の注意が必要です。組織染色液の調製を開始するには、50 mLチューブにpH 7.4のリン酸緩衝液 2 mLと最適凍結切片用包埋剤（OCTコンパウンド）35 mLを加え、pH試験紙を用いて確認しながら、激しく振とうして混合します。溶液が約pH 7.4であることを確認します。次に、テキストのプロトコルに記載されている通り、リン酸緩衝液に溶解したグルコース-6-リン酸、ATP、および塩化マグネシウム溶液を加え、再度、溶液のpHが約pH 7.4に維持されていることを確認します。M-M-P-M-S溶液を加え、激しく混合します。これにより、透明な濃赤色のホモジネートが得られます。光への曝露を最小限に抑えるため、溶液をアルミホイルで包んでください。溶液が濁った場合は、オイルバスの加熱中に廃棄する必要があります。別途、0.4 mLのジメチルホルムアミド、0.4 mLの無水エタノール、およびMBTをOリング付き蓋の2 mLチューブに入れ、5 mMのnitro blue to teraz oleum（MBT）溶液を調製します。チューブの蓋を軽く閉め、MBTが溶解するまでオイルバスで激しく沸騰させてください。次に、MBT溶液を室温まで冷却し、OCT反応混合物に添加します。時間の経過とともに、溶液の色が初期のオレンジレッドから濃い赤色または紫色に変化することがあります。本文のプロトコルに従って動物への処理および凍結切片の作成を行った後、シリコングリースで接着させた2枚のスチールワッシャーを用いて組織染色のためのウェルを作成します。ワッシャーの底部にフィットさせ、溶液を配置する中心部分を切り抜いてください。凍結組織スライドを37°Cの加湿室で10分間予熱します。次に、スライド上にウェルを配置して組織切片を囲み、各組織切片ウェルに、あらかじめ調製したG6PD染色液を約0.5 mLずつ加え、45〜50分間インキュベートします。スライドを予熱室から取り出し、スライドからステンレス製ウェルを注意深く取り除きます。スライドを長辺で立てて反応混合液を排出し、続いて100 mMリン酸緩衝液で30〜60分間洗浄します。G6PD染色液の最終的な痕跡を除去するため、スライドを脱イオン水で5〜10分間すすぎ、残留したリン酸緩衝液を取り除きます。最後に、スライドにフルオロゲルを滴下して組織を封入し、30分間乾燥させてから、後の解析に向けた画像を取得します。スライドを光学顕微鏡に設置し、4倍の対物レンズで倍率を調整します。次に、5.0メガピクセルのカメラで染色した組織切片を撮影し、検査した陰窩の総数を推定します。各マウスについて、表面積が最小となる部位の切片を選択し、10倍の倍率で撮影します。変異したクリプトの数を数えます。以下の基準に従い、クリプト全体に青色が見られず、かつクリプトの外構造が保持されているものをカウントします。変異体は隣接する7 µmの切片で観察し、2名の観察者が同じ陰窩を変異体として特定します。この切片内の陰窩数を視覚的にカウントし、それに各結腸でスクリーニングしたレベル数を掛け合わせます。DNA損傷剤であるアゾキシメタンで処理したマウスで観察された変異陰窩の例がここに示されており、左側には変異陰窩を垂直方向または上から見た図が表示されています。右側は水平方向または側面のビューですが、クリプトを変異体と判定するには、クリプト内のすべての細胞が残っている必要があります。少量の白色を含む白いクリプトは、杯細胞による粘液産生によるものです。変異頻度は、観察された変異体の数を、非変異体を含むスクリーニングしたクリプトの総数で除して算出します。対照群のマウスの結腸では、変異頻度が1×10⁻⁵未満のCripsが観察されましたが、アゾキシメタン投与マウスでは、本手順に従った結果、幹細胞の変異頻度が4.44×10⁻⁴でした。化学物質がどのように変異を誤コードさせるかといったさらなる疑問に答えるために、グルコース-6-リン酸脱水素酵素の変異型の遺伝的解析などの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、潜在的な変異原性および発がん性化合物で処理したマウスにおける体細胞幹細胞変異の測定方法について十分に理解できるはずです。

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

PMS2及び/または全体の陰窩におけるERCC1の減少/不在の式はおそらく結腸腺癌、高い可変性​​と癌への進行による視野欠損の基礎の各辺が10 cm以内頻繁にイベントです。...

大腸癌への進行中に視野欠損欠損PMS2、ERCC1、Ku86、CcOI

我々は、その後、表面抗原（DotScan...

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。...

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

ここでは、幹細胞移植前の DNA...

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

提示された診断FL-DNAキットは、大腸癌病変の存在の信頼性の高い確率を決定するための時間を節約し、ユーザーフレンドリーな方法です。...

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

この記事では、所定の患者から異なる検体間のクローンおよびサブクローンの変化を同定する方法について説明する。ここで説明する実験は特定の腫瘍タイプに焦点を当てていますが、このアプローチは他の固形腫瘍に広く適用可能です。...

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。...

HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。...

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

このプロトコールは、サイトカインなどの細胞傷害性摂動に応答してヒト結腸オルガノイドの細胞死を調査および定量するためのシンプルで費用対効果の高い方法について説明しています。このアプローチでは、蛍光細胞死色素(SYTOX Green Nucleic Acid...

生蛍光顕微鏡を用いたヒト結腸オルガノイドにおけるサイトカイン誘発性細胞死の定量化(英語)

学ぶ結腸幹細胞におけるG6PD遺伝子の体細胞変異の定量法。マウスを用いた遺伝毒性物質処理後の変異頻度測定と組織染色解析により、大腸発がん研究に重要な手法を確立する。

結腸幹細胞変異の定量

さらに動画を探す