セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

この手順の全体的な目的は、FCIマウスとして知られる蛍光ユビキチン細胞周期トランスジェニックマウスの脳室下帯から単離し、ソートした神経幹細胞およびその娘細胞の細胞周期進行を追跡することです。これはまず、トランスジェニック成体マウス脳の脳室下帯を摘出することで行います。次のステップは、パパイン処理を用いて神経組織を単一細胞懸濁液に解離させることです。

次に、静止期神経幹細胞、活性化神経幹細胞、一過性増殖細胞、および未成熟または遊走中の神経芽細胞を同定するため、抗体を用いて側脳室下帯の異なる神経原生細胞集団を標識します。最終ステップとして、FACSを用いて細胞を新鮮な培養液に直接分取し、poly-D-lysineコーティングプレートに播種します。最終的に、連続タイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、播種した細胞の細胞周期の進行を観察します。これは、さまざまなトランスジェニック細胞が細胞周期の異なる時点で蛍光を発するためです。

細胞ソート技術とFujiテクノロジーを組み合わせることで、脳室下帯からの異なる細胞集団の可視化および単離が可能となり、成体脳における特性とダイナミクスの研究が可能になります。この手法は、老化や脳疾患の文脈における重要な問いへの答えを得るのに役立ちます。実験の前日に、滅菌済みの黒色壁96ウェルプレートの各ウェルに、10 µg/mLのポリDリシン溶液を約200 µLずつ加え、ウェルの底面をコーティングします。プレートに蓋をして、37 °Cで一晩インキュベートし、翌日に使用します。

poly D lysine溶液を除去し、ウェルを滅菌蒸留水で3回洗浄した後、クリーンベンチ内の層流下でプレートを少なくとも2時間乾燥させます。すぐに使用しない場合は、乾燥後のコート済みプレートを4°Cで最大7日間保存してください。

次に、パパイン解離溶液を調製し、混合液を0.2 µmフィルターでろ過して滅菌します。使用前に溶液を37 °Cに予熱しておきます。また、滅菌済みTM F 12培地にトリプシンインヒビタータイプ2を0.7 mg/mL添加して、プロテアーゼ阻害剤溶液を調製します。

溶液を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、使用前に37°Cに予熱します。成体fucci redマウスの脳から新鮮に摘出した脳室下帯を、0.6% Glucose含有PBSを入れたペトリ皿に移し、大きな塊がなくなるまで組織を細切します。その後、すべてを15mLチューブに移し、200×gで5分間遠心分離します。

組織をペレットにした後、上清を捨てて再懸濁します。あらかじめ温めておき、0.01 mg/mL の DNase I を添加したパパイン 1 mL に組織を懸濁させます。この混合物を 37 °C のウォーターバスで 10 分間インキュベートします。

その後、200 ×gで5分間、再度遠心分離し、上清を捨てます。酵素消化を停止させるため、あらかじめ温めておいたOVO MOID溶液を1 mL加えます。次に、P1000マイクロピペットチップを使用し、ピペッティングしながら20回ほど緩やかに吸い上げと吐き出しを繰り返し、細切した組織を機械的に解離させて単一細胞懸濁液にします。

細胞への過剰なストレスの原因となるため、混合液に気泡が入らないようにしてください。細胞懸濁液を滅菌済みの20 micronフィルターに通し、新しい15 milliliterチューブに回収します。細胞の損失を防ぐため、0.15%BSAを含むPBS 2 millilitersで細胞フィルターを洗浄してください。

次に、細胞懸濁液を200 ×gで10分間遠心分離します。上清を捨てます。各マウスから回収した細胞を、0.15%BSAを含む100 µLのPBSに懸濁し、Fcstainingを行います。

付属のテキストプロトコルに従い、1匹のマウスから得られた細胞の10分の1量を用いて、4つのコントロールをそれぞれ準備します。ここに記載されている一次抗体を、セルソーティングに使用した各チューブに添加し、4°Cの暗所で20分間インキュベートします。一次抗体によるインキュベーション後、0.15% BS, Aを含むPBS 1 mLで細胞を洗浄し、200×gで10分間遠心分離します。

脳1個につき0.15% BSAを含むPBS 200 microlitersで細胞を再懸濁し、適切なセルソーター用チューブに移します。セルソーター用チューブを氷上に置き、死細胞と生細胞を区別するため、セルソーティングの直前にHoechst 333258などの生存染料を2 micrograms per milliliterの濃度で細胞に添加します。

次に、陰性コントロールチューブの細胞をフローサイトメーターで解析し、サイドスキャッター（SS）とフォワードスキャッター（FS）のパラメータを用いて細胞を選択します。陰性分画のゲート設定により死細胞を除去し、また陰性分画のパルス幅を選択することでダブレットを除去します。シングルカラーコントロールを解析し、必要に応じて光電子増倍管（PMT）の電圧を調整します。

ソフトウェアのコンペンセーションウィンドウで、カラー補正を行います。3つの蛍光シングルスタイン（minus one）コントロールを測定し、ソーティングゲートを設定します。すべてのゲートの設定が完了したら、標識した細胞を100 µLの培地へ直接ソーティングします。

分取直後の細胞を、1ウェルあたり1000〜3000細胞の密度で、ポリリシンコートした96ウェルプレートに300 µLの培地とともに播種します。培養プレートを37 °C、5% CO2条件下で少なくとも1時間インキュベートします。

細胞接着を可能にするため、付属の温度制御チャンバーを5%二酸化炭素雰囲気下、37°Cに予熱し、共焦点レーザー走査顕微鏡をイメージング用に準備します。予熱した顕微鏡チャンバー内に96ウェルプレートを配置し、最初のウェルの焦点を合わせます。次に、イメージングソフトウェアを開き、メインウィンドウを右クリックして「acquire acquisition controls」および「DEAC acquisition」を選択します。

TIパッドを開き、次に Plan A PO VC 20 XDIC 対物レンズを選択するには、[acquire acquisition controls] をクリックし、[time-lapse] オプションを開きます。各ウェルの中心をステージ位置に設定し、[large image] オプションを 7 by 7 millimeter squared に設定します。各中心付近のモザイク画像を確認してください。

大きなモザイク画像のオーバーラップを5%に設定し、24時間にわたって20分ごとに撮影されるよう頻度を設定します。One Plus設定において、メニューバーに表示されている各蛍光についてフォトマルチプライヤー管（PMT）の電圧レベルを選択します。512×512ピクセルのフォーマットで高速共焦点レゾナンススキャナーを用いて画像を撮像し、細胞の可視化にはDICを使用するように選択します。

次に、データファイルを保存するフォルダを選択します。ND取得ウィンドウの「run now」ボタンを選択して、取得を開始します。すべてが正常に動作していることを確認するため、少なくとも1ループ分はコンピュータの操作を確認しながら進めてください。

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いて赤色蛍光によりG1期を追跡するため、Fuji redマウスを使用した。単離された細胞は、第1成長期には赤色蛍光を発し、合成期である第2成長期および有糸分裂期には我々のカラーリストの通りとなる。Lex陽性eeg FR陽性およびeeg。

若年成人および中年マウス由来のFR陽性細胞を播種し、顕微鏡を用いて追跡した。S期およびG2/M期の期間は、若年マウスおよび中年マウスのいずれにおいても、Lex陽性EGFR陽性細胞とEGFR陽性細胞の間で差は見られなかった。しかし、初回分裂から赤色蛍光が消失するまでの次なる成長期の期間は、G1期の期間が延長したため、高齢の細胞においてより長いことが判明した。

播種から5日後に得られたニューロスフェアは、高齢マウスから得られたLex陽性EGFR陽性細胞において小型になります。12匹のマウスを用いる場合、解剖およびFACs準備に3時間以内、細胞ソートにさらに3時間以内というスケジュールで全プロトコルを完了させる必要があります。同日に多数のマウスを扱うと、細胞ソートの時間が延長し、結果として細胞死や細胞分化が増加する可能性があることに留意してください。