Name: マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶマウス脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離・拡張する方法。磁気細胞分離と蛍光活性化細胞分選を用いてiNKT細胞を効率的に増殖させ、免疫学研究に応用可能です。

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D.E.とM.B.D.は、ゲント大学の学際的研究プラットフォーム(MRP)と、炎症性疾患における折り畳まれていないタンパク質に関するゲント研究者(GROUP-ID)コンソーシアムのメンバーです。

本研究では、成体（6-8週）の雌C57BL / 6マウスを使用しました。マウスは、ゲント大学のビバリウムのガイドラインに従って飼育し、飼育しました。すべての動物の手順は、動物実験倫理委員会によって承認されました。 マウスの脾臓から単核細胞（MNCを）の調製<ol><li>頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>バックダウン解剖ボード上にマウスを置き、ピンと後肢と前足を修正。 </li><li> 70％で皮膚表面を殺菌（体積/体積）エタノール/ H 2 O </li><li>胸部に腹部正中線に沿って皮膚をカットし、無菌手術器具を使用して脾臓を露出させます。 </li><li>周囲の脂肪組織をトリミングした後、室温で1ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む24ウェルプレートに脾臓を配置します。 </li><li>滅菌メスを用いて脾臓を解剖し、50mlの浴槽内に配置された70ミクロンのナイロンフィルターに作品を転送しますE。 </li><li> 2ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して、静かにセルストレーナーを通して脾臓片をマッシュアップし、5mlの1×PBSで洗浄します。 </li><li> 15mlチューブにフィコール - パックの3ミリリットルを追加し、5ミリリットルの細胞懸濁液と密度勾配媒体をオーバーレイ。 </li><li>ブレーキなしの室温で20分間、400×gで遠心分離します。 </li><li> 、新鮮な15mlチューブに相間を移し、4℃で10分間300×gで10ミリリットルの冷1×PBSおよび遠心分離機を追加します。 </li><li> 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（FACS緩衝液）を含むPBS 1×2mlの細胞を再懸濁。小さなチューブに移し、細胞懸濁液10μlを、0.4％の10μLと混合</li></ol> 2.濃縮、検出とマウスのiNKT細胞の精製<ol><li>マウス脾臓CD5positive（CD5 +）リンパ球の濃縮。 <ol><li> （オプション）染色で10 5細胞のFITC結合抗CD5（4μlの1：30希釈の/ 10 6細胞 ）暗所で4℃で30分間、200μlのFACS緩衝液および500で再懸濁し、FACS緩衝液μlの洗浄。 1×PBS中の4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の20μMの作業溶液を調製し、FACS緩衝液中に10μlのその5個の細胞を1追加し、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで10 4前濃縮された細胞を取得します。 <ol><li> （ 図1A）、細胞ダブレットと凝集体を排除するためにFSC-WのLO細胞にFCS-HとFCS-Wを使用して、電子的にゲート。そして、電子的にゲートアウトDAPI + FSC-W LO集団内（死）細胞（ 図1B）、および電子的に大きさ（ 図1C）によってリンパ球集団を選択するために、SSC-AとFCS-Aを使用しています。 </li><li>リンパ球ゲート内の細胞を用いて、CD5対SSC-Aをプロットし、 図1Dに示すように、電子的にゲートCD5 +リンパ球。フローサイトメーターのプレ濃縮されたサンプルの残りを取得します。 </lI&gt; </ol></li><li> FACS緩衝液に90μlのあたり10 7細胞に細胞数を調整し、10μlの抗CD5マイクロビーズを追加します。 </li><li> 15分間4ºCでインキュベート、FACSは、500μlの冷たいFACS緩衝液中に再懸濁緩衝液および4ミリリットルで1回洗浄。製造業者の推奨に従って磁気細胞分離（MACS）カラムを使用して、CD5 +リンパ球を濃縮します。 </li><li> FITC結合抗CD5とオプション）染色は、10 5細胞 （2.1.1のように1:30希釈/ 10 6細胞 ）およびDAPI4μlの。フローサイトメーター上の10 4濃縮リンパ球を取得し、2.1.1で作成した電子ゲートことを確認します。濃縮された細胞画分に、CD5 +リンパ球を選択します。フローサイトメーター上の10 5個の細胞を取得し、 図1（e）に示すように富む画分に存在する割合CD5 +リンパ球を分析- H。 </li></ol></li><li>検出およびマウスのiNKT CEの単離FACSによるLLS。 <ol><li>抗CD16 / CD32を含むFACS緩衝液中に約10 6個の細胞 20当たりμLおよびPE結合αGalCerの（1:50希釈/ 10 6細胞の4μL）の濃度で濃縮CD5 +リンパ球を再懸濁/のCD1d四量体（1μgの/ 10 6細胞 ）。 </li><li>暗所でRTで30分間インキュベートします。 </li><li>のマウス抗体（mAb）抗CD3εV500（午前1時20希釈の4μL/ 10 6細胞 ）、抗CD19 E450（1:50希釈の4μL/ 10 6細胞）および抗CD8αのE450（4μLを希釈FACS緩衝液で1:50希釈/ 10 6細胞 ）、CD5 +リンパ球に加え、暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 10 7細胞/ mlの最終濃度で4mlにFACS緩衝液を4℃で10分間、300×gで遠心分離し、再懸濁することによって1mLのFACS緩衝液で細胞を洗浄します。 </li><li> 30μmのセルストレーナーを通して細胞を濾過し、細胞を氷上に置きます。 </li><li>メーカーの推奨14,15に従って細胞選別のためのフローサイトメーターを調整します。 注：細胞選別のためのフローサイトメーターのキャリブレーションは、トレーニングを必要とし、経験豊富なオペレータ、または訓練を受けた技術者により行うことができます。 </li><li> 10 6個の細胞あたりDAPI20μMのワーキング溶液10μlを加え、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで約10 4濃縮CD5 +リンパ球を取得します。 FSC-WのLO細胞の電子的にゲートが、細胞ダブレットと集合体（ 図2A）を除外します。その後、FSC-W LO集団内のゲートアウトDAPI + CD8 + CD19 +細胞 （ダンプチャンネル）（ 図2B）、電子的、および2.1.1.1に記載されているように電子的にリンパ球（ 図2C）を選択し 、SSC-AとFCS-Aを使用します。 <ol><li> CD3εと電子的にゲートαGalCerの/ CD1dのことでプロットαGalCerの/のCD1d四量体図2Dに示すように、四量体+CD3ε+ iNKT細胞。割合αGalCerの/のCD1d四量体+濃縮された細胞画分に存在CD3ε+ iNKT細胞を決定するために、2×10 5 CD5 +濃縮リンパ球よりも多くを獲得しません。 </li></ol></li><li> 「1.5」の流速で70μmのノズルを用いて、70 psiで、フローサイトメーターで2.2.7で作成された電子ゲートを使用して、FACSソートαGalCerの/のCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞。 1ミリリットルの100％FCSを含むFACSチューブにソートされたiNKT細胞を収集します。続いて、4℃で10分間、300×gで細胞を10 mlのRMPI 1640培地および遠心分離機を用いてFACSチューブの側面から選別iNKT細胞をすすぎます。 </li><li>再懸濁し、1mlのRPMI 1640培地にiNKT細胞を選別し、ソートされたiNKT細胞の純度を評価するために、フローサイトメーター上でμLその40を獲得。リンパ球- FSC-W LO DAPIを選択2.2.7で説明したように、S。 （ 図2E - G）と電子的にゲートαGalCerの/のCD1d四量体+CD3ε+ iNKT細胞図2Hに示すように。 </li></ol></li></ol> 3.文化とマウスのiNKT細胞の増殖 0日目<ol><li>コー​​ト室温で1時間、ウェルあたり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレート。 200μlの1×PBSおよび一度200μlで完全RPMI 1640培地（10％容量/容量のFCS、100U / mlのペニシリン - ストレプトマイシン、5.5μMのβメルカプトエタノール）で2回洗浄します。 </li><li> 1.11のように0.4％血球計数器を使用して実行可能なソートiNKT細胞（ステップ2.2.8）の数をカウントし、完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで4℃で10分間、300×gで遠心分離及び再懸濁組換えマウスIL-2（10ng / ml）を、組換えマウスIL-12（1 ngの/ ml）および可溶性抗マウスCD28（5μg/ ml）を含有します。プレートの抗CD3εコートしたプレートにウェル10 5細胞 /でiNKT細胞をorted、2日間のCO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li></ol> 2日目<ol start="3"><li> 2日間の新鮮なコーティングされていない平底96ウェルプレートと文化のCO 2インキュベーター内で37℃での完全RPMI 1640培地中で静止条件下での細胞に細胞を移します。 </li></ol> 4日目<ol start="4"><li>穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を除去し、新鮮な15mlチューブに細胞を移します。 4°C、組換えマウスIL-7（5 ngの/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで再懸濁し、で10分間、300×gで遠心分離し、フラット10 5細胞/ウェルをプレートCO 2インキュベーター中、37℃で4日間、96ウェルプレートの底。 </li></ol> 8日目<ol start="5"><li> 300 xにおける新たなチューブに細胞を回収し、遠心分離可溶性抗CD28（5μg/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 5細胞/ mlで4℃で10分間再懸濁のために、G。 </li><li>コー​​トウェル当たり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレートとは3.1のように洗います。プレート10 5細胞/ウェル中の抗CD3εコーティングされたプレートとは、11日目までのCO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li></ol>日11から18 <ol start="7"><li>繰り返しは3.6から3.4のステップ。 </li></ol>日19-20 <ol start="8"><li>完全RPMI 1640培地中に5×10 5細胞/ mlで300×gで再懸濁で新鮮な15mlチューブ、遠心分離機に細胞を移します。 </li><li>平底96ウェルプレート中にウェル10 5細胞 /プレートで細胞と細胞を実験に使用する前にCO 2インキュベーター中、37℃で2日間休息することを可能にします。 </li></ol> 4.サイトカイン産生のCD1dぷらっとを用いて、マウスのiNKT細胞による電子結合アッセイ<ol><li>コー​​ト平底96ウェルあたり組換えマウスCD1dの100μlの（1×PBS中10μg/ ml）でプレートし、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li> 200μlの1×PBSで4回洗浄し、ウェル当たり1×PBS中の2％FCS（ブロッキング溶液）200μlを添加し、37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、ウェルあたりαGalCerの200μlの（5 ngの/μl）を追加し、16時間、37℃でプレートをインキュベートします。 [αGalCerの溶液の調製のために、車両が96 mg / mlのスクロース、10 mg / mlのデオキシコール酸ナトリウム及び5 mg / mlのTween 20を含むに溶解αGalCerの55μgのに1,085μ1×PBSを追加]。 </li><li>インキュベーション後、αGalCerの液を捨て、200μlの完全RPMI 1640培地に続いて、PBS 1×200μlでも二回洗浄します。 </li><li>完全なRで遠心細胞300×gで10分間4℃で再懸濁し、21日目にin vitroで拡大iNKT細胞を収集0.5×10 6細胞/ mlの濃度でPMI 1640培地。 </li><li>ウェル当たりのiNKT細胞の再懸濁液の200μlを添加し、CO 2インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートします。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって関心の上澄み液と測定サイトカインを収集します。 </li></ol>

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<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
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</ol>

著者には開示すべき競合する利益はありません。

現在のプロトコルにおける重要なステップは、分離およびCD5 +リンパ球 （第1＆2）、（3節）とiNKT細胞の初期めっき（第4節）をFACSソーティングのその後の濃縮を含みます。第1節で実行されるステップの、慎重に異なる細胞間期を遠心分離後に生成されるような密度勾配媒体を介して脾臓細胞懸濁液をレイヤーすることを忘れないでください。磁気細胞分離（第2節）により、CD5 +リンパ球に対するその後の濃縮を染色するために必要な試薬と時間を最小限に抑えるためのその増加のiNKT細胞収量を後の並べ替えをするのに役立ちますFACSソートiNKT細胞（第3節）。最後に、細胞のアポトーシスをもたらすことがiNKT細胞の高い数字でウェルを播種とし ​​ての文化（第4章）の最初の2日間ウェル当たりせいぜい10 5 iNKT細胞をシードしないことが重要です。 および/またはtroubleshooを変更する際の考慮事項の数が重要ですティンこのプロトコル：最初に、使用される動物の年齢が重要です。どちらか古すぎる、または付属の感染症を持っている動...

ネズミ不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞は、CD1dの発現皮質胸腺細胞1,2-によって胸腺内で選択された生来のTリンパ球の異なる集団です。 iNKT細胞は、Vβ8、Vβ7またはのCD1dの文脈における内因性ならびに外来脂質抗原を認識することができるVβ2TCRは3のいずれかと対に不変Vα14-Jα18TCR鎖からなるT細胞受容体（TCR）を発現します。例えば、マウスのiNKT細胞を認識し、内因性isoglobotrihexosylceramide（のiGb3）4と呼ばれる脂質抗原と同様に、αガラクトシルセラミド（αGalCerの）5,6、海綿から単離された糖脂質によって活性化されます。 iNKT細胞のTCR依存性活性化は、適応免疫応答のプライミングを促進し、その結果、iNKT細胞は、リウマチ性疾患7及び癌を含む病理の範囲の改善や開発に機能的関与することが示されています&lt;SUP&gt; 8。現在、合成のiNKT細胞リガンドは、免疫病理学的条件の数を調節することが可能である有望な新しいワクチンアジュバントを構成しています。 これは、以前にiNKT細胞しかしマウス組織から単離した後、in vitroで生成することができることが実証されています。これらの研究の多くは、Vα14TCRトランスジェニック（Tg）は、マウス10、またはのiNKT細胞由来のハイブリドーマ11,12を生成するための胸腺腫、主要な抗原提示細胞（APC）、及び/又は細胞株の使用9を用います 。さらに、マウスの多くは、αGalCerのロードされたCD1dダイマー、および長い培養時間などの試薬 ​​の高いボリュームがいくつか公開されたプロトコル少ない倫理的および経済的に9,13をアピールしてください。 この報告では、単離のために、マウスの脾臓からiNKT細胞の体外拡大して適応する方法を説明します。より具体的には、プロトコルは、方法が記載されていますFACS細胞選別のために必要なマウス、試薬および時間を減少させ、in vitroで 、ソート脾臓iNKT細胞を拡大するために最適化されたアプローチを提案しているマウス脾臓からiNKT細胞を濃縮します。

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>精製 抗マウス CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>精製抗マウスCD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD8&alpha;(53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC標識抗マウスCD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500標識抗マウスCD3&epsilon;(500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD5 (Ly-1) マイクロビーズ</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>精製抗マウス CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS カラム</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640中</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG&</td><td></td></tr><tr><td>beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート Fボトム</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Greiner-bio</td><td>one 665-180 665-180</td><td></td></tr><tr><td></td><td>655-180</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml falconチューブ</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ファルコン チューブ</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m</td><td>フィルターGreiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro;m フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレーター</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>ウォータージャケット付き CO2 インキュベーター</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖キット</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAriaIII</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーt細胞を単離および拡張するための最適化方法

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

急速に刺激によりサイトカインを分泌する能力は、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞系統の機能的な特徴です。 iNKT細胞は、したがって、免疫応答を活性化し、ステアリング適応可能な生来のT細胞集団として特徴づけられます。マウスiNKT細胞の培養および増殖のための改良された技術の開発は 、in vitro および in vivo モデル系でのiNKT細胞生物学の研究を容易にします。ここでは、マウスの脾臓iNKT細胞の単離および拡張のための最適化された手順を説明します。 C57BL / 6マウスから脾臓を取り出し、解剖し、緊張し、得られた細胞懸濁液を、密度勾配媒体を介して積層されています。遠心分離後、脾臓単核細胞（MNC）収集され、CD5陽性（CD5 +）リンパ球は、磁気ビーズを使用するために濃縮されます。 CD5 +画分内のiNKT細胞は、その後^で染色します5; GalCerを負荷されたCD1d四量体および蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製しました。 FACSは、組換えマウスサイトカインの組み合わせを用いてインビトロで、その後、最初に培養し、プレートに結合したT細胞受容体（TCR）の刺激を、マウス組換えIL-7の存在下で拡張される前に、iNKT細胞を選別しました。この技術を用いて、約10 8 iNKT細胞は、それらが、インビトロでの機能アッセイのために、または、マウスにおけるインビボ移入実験のために使用することができ、その後、培養の18-20日以内に発生することができます。

密度勾配を使用して、脾臓単核細胞の単離は、約1時間を要し、赤血球（RBC）を溶解するのに必要な試薬の使用を排除します。生存細胞の高い収率が除去される器官の緊張時に発生するこの方法及び破片を用いて得られます。典型的には、脾臓リンパ球のプール内のiNKT細胞の頻度は、しかし、これは使用される動物の年齢、性別、健康状態に応じて変えることができる総Tリンパ球の1と5％の間の範囲です。約10 6 iNKT細胞は、3匹のマウスのプールした脾臓から取得することができ、iNKT細胞の最高収率は、6〜8週齢のマウスの脾臓から得られます。 マウス抗CD5磁気ビーズの使用が著しくCD5抗原を発現するBリンパ球の小集団から離れて、脾臓MNC画分内のiNKT細胞のために富化、および、この手順を使用して単離された細胞の大部分は、CD5 +のリンパを構成します球。例えば、CD5濃縮後に得られた多国籍企業の5〜8％は、CD5陰性（ 図1H）です。 αGalCerの/のCD1d四量体および抗がマウスCD3εしかし98％を超えるのiNKT細...

ここでは、マウスの脾臓から大量のマウス不変ナチュラルキラーT細胞を生成するために使用できる適応プロトコルを紹介します。このプロトコールは、脾臓iNKT細胞を限られた数の動物および試薬を用いてin vitroで濃縮し、単離および増殖させることができるアプローチを概説しています。

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

本手順の総合的な目的は、マウス脾臓から回収した不変自然殺害T細胞（iNKT細胞）を増殖させることです。まず脾臓単核細胞を単離し、次いで磁気細胞分離法によってCD5陽性リンパ球集団を濃縮することでこれを達成します。その後、フローサイトメトリー（FACS）を用いて脾臓iNKT細胞分画をさらに単離します。最終ステップとして、分取されたINKT細胞をin vitroでの増殖のために播種します。最終的に、増殖させたINKT細胞のサイトカインプロファイルはELISAで評価することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、INKT細胞の精製と増殖に異なる複数の技術の組み合わせが必要となるため、習得に苦労することがあります。この手順は、私の研究室の大学院生によって実演されます。脾臓を採取した後、組織を70 µmのナイロンフィルターに移し、2 mLシリンジのプランジャーを使用して、脾臓をストレーナー越しに50 mLコニカルチューブへ緩やかに押し出し、フィルターを5 mLのPBSで洗浄します。次に、3 mLのコーンパックを15 mLチューブに加え、密度勾配の上に5 mLの細胞懸濁液をオーバーレイします。遠心分離により細胞を分離し、界面を新しい15 milliliterチューブに移します。次に、10 millilitersの冷PBSで細胞を洗浄し、ペレットを2 millilitersのfax bufferに再懸濁して、CD5陽性脾臓リンパ球を濃縮します。さらにfax bufferを加え、細胞濃度を1×10⁷ cells/90 µLに調整し、10 µLの抗CD5マイクロビーズを細胞に添加します。4°Cで15分間静置した後、細胞を4 mLのFAXバッファーで洗浄し、ペレットを500 µLの新鮮なFAXバッファーで再懸濁します。製造元の推奨に従い、磁気細胞分離法を用いてCD5陽性細胞を単離します。次に、濃縮したCD5陽性リンパ球を、anti-CD16、CD32、およびPE接合alpha gals air CD1Dテトラマーを含むFAXバッファーを用いて、1×10⁶ cells/20 µLとなるように室温・暗所で希釈します。30分後、目的の抗体とともに細胞を4°C・暗所でさらに30分間インキュベートします。次に、細胞を新鮮なfaxバッファーで洗浄し、1 × 10⁶個の細胞に対し20 µMのDPI作動液10 µLを用いて5分間染色します。室温で、フローサイトメーターを用いて約1 × 10⁴個の濃縮CD5陽性リンパ球イベントを解析します。この際、前方散乱光（forward scatter）の低値細胞に電子的なゲーティングを行い、細胞のダブレットや凝集物を電子的に除外します。前方散乱光の低値集団内で、DAPI陽性、CD8陽性、およびCD19陽性の細胞をゲートアウトし、側方散乱光（side scatter）と前方散乱光のエリアプロットを使用します。リンパ球を電子的に選択するため、CD3εおよびα-GalCer CD1Dテトラマーでプロットし、指示通りにα-GalCer CD1Dテトラマー陽性かつCD3ε陽性のiNKT細胞を電子的にゲートします。次に、CD5陽性の濃縮リンパ球を2×10⁵個以下で取得し、濃縮細胞分画中に存在するα-GalCer CD1Dテトラマー陽性かつCD3ε陽性のiNKT細胞の割合を決定します。このゲートを用いて、α-GalCer CD1Dテトラマー陽性かつCD3ε陽性のiNKT細胞をソートし、ソート終了時に1 mLの胎児牛血清を含むファコチューブに回収します。分離したNKT細胞を、faxチューブの側面から10 millilitersのRPMI 1640培地で洗浄します。その後、細胞を遠心分離し、ペレットを1 milliliterのRPMI 1640に再懸濁させ、その細胞の40 microliter分を取り出して、同一のゲーティング戦略を用いてソートされた細胞の純度を評価します。iNKT細胞を増殖させるためのソートパラメータの設定については、細胞を遠心分離し、IL-2、IL-12、およびanti-CD28を添加した完全RPMI 1640培地を用いて、単離した細胞を5×10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、anti-CD3εコーティングを施した96ウェル平底プレートに、1ウェルあたり1×10⁵個のiNKT細胞を播種し、細胞培養インキュベーターにて37°Cで培養します。2日後、細胞をコーティングされていない新しい平底96ウェルプレートに移し、完全RPMI 1640中で静止条件下で培養します。さらに2日間培養するための培地を添加します。ソーティングから4日後、各ウェルの上清を穏やかにピペッティングして細胞を剥離させ、15 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離後、ペレットを5 × 10⁵ cells/mLの濃度で再懸濁します。IL-7を添加した完全RPMI 1640培地を用い、1×10⁵ cells/wellの密度で播種します。新しい平底96ウェルプレートを使用し、細胞をインキュベーターに戻します。4日後、細胞を回収して新しい15 mLコニカルチューブに入れ、遠心分離を行います。ペレットを可溶性anti-CD28を含む完全RPMI 1640培地で再懸濁し、anti-CD3εでコーティングした96ウェル平底プレートに1×10⁵ cells/wellの密度で播種します。その後、細胞をさらに3日間インキュベーターに戻します（4日目、11〜18日目）。19日目に示した通り、IL-7、anti-CD28、およびanti-CD3εによる処理を繰り返します。細胞を新しい15 mLコニカルチューブに移します。遠心分離で回収し、完全RPMI 1640培地を用いて、細胞密度5×10⁵ cells/mLでペレットを再懸濁します。次に、平底96ウェルプレートに1 × 10⁵ cells/wellの密度で細胞を播種し、細胞培養インキュベーター内で2日間静置します。プレート結合抗CD3εを用い、IL-2、IL-12、および可溶性抗CD28の存在下でソート済みiNKT細胞を刺激すると、2日間の培養後にiNKT細胞数が約3倍に増加します。その後、IL-7の存在下でiNKT細胞をさらに増殖させると、培養4日目までにiNKT細胞数が3〜4倍に増加します。注目すべき点として、これらの培養条件を繰り返すことで、2回の増幅後に平均7×10⁷個のiNKT細胞を得ることができ、異なる日の培地交換の間に目に見える細胞の減少は認められませんでした。これにより、18日間で少なくとも70倍の増幅が達成されました。さらに、プレート結合性のα-GalCer負荷組換えマウスCD1dで活性化した増幅後のiNKT細胞は、刺激から48時間後にIL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、およびIL-6を産生し、増幅後もiNKT細胞がTh1およびTh2サイトカインを産生する能力を保持していることが示されました。本手順を実施する際は、フローサイトメトリーでiNKT細胞を同定するために、$\alpha$-ceramideをロードしたCD1dでiNKT細胞を適切に染色することが不可欠であるという点に留意してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

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腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

我々は、マウス脾臓から不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞を濃縮し、インビトロおよびインビボ研究に適した数にそれらを拡大するための迅速かつ堅牢なプロトコルを記述する。...

インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。...

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

学ぶマウス脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離・拡張する方法。磁気細胞分離と蛍光活性化細胞分選を用いてiNKT細胞を効率的に増殖させ、免疫学研究に応用可能です。

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

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