マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

この手順の全体的な目標は、マウス脾臓から採取した異なるナチュラルキラーTまたはINKT細胞を増殖させることです。これは、最初に脾臓単核細胞を単離し、続いて磁気細胞分離によってCDの5つの陽性リンパ球集団を濃縮することによって達成されます。次に、脾臓INKT細胞画分を蛍光活性化細胞ソーティングによりさらに単離します。

最終ステップでは、選別したINKT細胞をin vitroでの増殖のために座らせます。最終的に、拡大したINKT細胞のサイトカインプロファイルは、Elizaによって評価できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、INKT細胞の精製と増殖にさまざまな技術の組み合わせが必要なため、苦労するでしょう。

この手順は、私の研究室の大学院生に依頼します。脾臓を採取した後、組織を70ミクロンのナイロンフィルターに移し、次に2ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーを介して脾臓を50ミリリットルの円錐管に優しくつぶし、フィルターを5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、3ミリリットルの石炭パックを15ミリリットルのチューブに加え、密度勾配を5ミリリットルの細胞懸濁液と重ね合わせます。

遠心分離により細胞を分離し、界面を新しい15ミリリットルチューブに移します。次に、細胞を10ミリリットルの冷たいPBSで洗浄し、ペレットを2ミリリットルのファックスバッファーに再懸濁して、CDの5つの陽性脾臓リンパ球を濃縮します。細胞の希釈を90マイクロリットルあたり10倍から7番目の細胞に調整し、より多くのファックスバッファーを使用し、10マイクロリットルの抗CDファイブマイクロビーズを細胞に加えます。

摂氏4度で15分後、細胞を4ミリリットルのファックスバッファーで洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なファックスバッファーに再懸濁します。メーカーの推奨に従って、磁気セル分離によりCDの5つの陽性細胞を単離します。次いで、濃縮されたCD5個の陽性リンパ球を1回10個で希釈し、抗CD16、CD32、およびPE結合αガル空気CD1D四量体を室温で室温で30分後に暗所で含有する20マイクロリットルあたり6個の細胞に希釈し、さらに30分間、暗所で4°Cで目的の抗体と細胞をインキュベートする。

次に、細胞を新鮮なファックスバッファーで洗浄し、6つの細胞に1×10のDPIのDPIの20マイクロモルの作業溶液10マイクロリットルで5分間染色します。室温では、フローサイトメーター上の5つの陽性リンパ球イベントの約1倍10〜4倍を獲得し、低細胞で前方散乱を電子的にゲーティングし、細胞のダブレットおよび凝集体を電子的に排除する。人口が少ない前方散乱子内のDAPI陽性CD8個の陽性CD19陽性細胞をゲートアウトし、側方散乱図と前方散乱図の面積プロットを使用します。

リンパ球を電子的に選択するために、α gal SER CD 1D四量体をCD 3つのイプシロンごとにプロットし、示されているようにα gal ser、CD 1D四量体陽性CD3、イプシロン陽性INKT細胞を電子的にプロットする。次いで、5つの陽性濃縮リンパ球の10倍から第5のCDの2倍以下を取得し、濃縮細胞画分中に存在するαgal、SER、CD、1D、テトラマー、陽性CD、3つのイプシロン陽性INKT細胞の割合を決定する。このゲートローソートを用いて、αアルサーCD 1Dテトラマー陽性CD3つのイプシロン陽性INKT細胞を、ソートの最後に1ミリリットルのウシ胎児血清を含むファックスチューブに入れる。

ファックス管の側面から単離されたNKT細胞を10ミリリットルのRPMI 1640培地ですすいでください。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを1ミリリットルのRPMI 1640に再懸濁し、40マイクロリットルの細胞アリコートを使用して、選別された細胞の純度を評価します。同じゲーティング戦略を使用します。

INKT細胞を増殖させるためのソートパラメータの設定については、細胞をスピンダウンし、IL、2、IL 12、および抗CD28を添加した完全なRPMI 1640培地で、細胞をスピンダウンし、単離細胞を1ミリリットルあたり5倍から5倍で再懸濁します。次に、96ウェル平底の抗CD3イプシロンコーティングプレートで、ウェルあたり10〜5番目のINKT細胞に細胞を1回播種し、細胞培養インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。2日後、細胞をコーティングされていない新鮮な平底96ウェルプレートに移し、完全なRPMI 1640で休静条件下で培養します。

さらに2日間のインキュベーションのための中程度。選別後4日目に、各ウェルの上清を静かにピペットで動かして細胞を取り除き、15ミリリットルの円錐管にプールします。遠心分離後、口蓋を1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍に5回で再懸濁します。

完全なRPMI 16培地にILを7個添加し、ウェルあたり5個目の細胞に10回10個をシードする。新しい平底の96ウェルプレートで、4日後に細胞をインキュベーターに戻し、遠心分離のために新鮮な15ミリリットルの円錐管に引き込みます。可溶性抗CD 28を含有する完全なRPMI 1640培地にペレットを懸濁し、抗CDでコーティングされた96ウェル平底板に細胞を播種し、ウェルあたり5番目の細胞のうち10個で細胞を1回、さらに3日間、4日間、11〜18の間、細胞をインキュベーターに戻す。

19日目に示したように、IL7抗CD28および抗CD3イプシロン治療を繰り返します。細胞を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。それらをスピンダウンし、完全なRPMI 1640.Mediumでミリリットルあたり5番目の細胞に10倍でペレットを再懸濁します。

次いで、平底96ウェルプレートにウェルあたり10〜5個の細胞を1回ずつ播種し、細胞を細胞培養インキュベーターで2日間休ませる。IL、2つのIL 12、および可溶性抗CD 28の存在下で、プレート結合した抗CD 3イプシロンで選別されたINKT細胞を刺激すると、2日間の培養後にINKT数が約3倍に拡大します。その後、IL 7の存在下でINKT細胞を増殖させると、培養4日目に存在するINKT細胞の数が3〜4倍に増加します。

特に、これらの培養条件を繰り返すと、2回の増殖後に7番目のINKT細胞に平均7倍の10の細胞が得られ、異なる日の培地の変更間で細胞が目に見える損失になることはなく、18日間で少なくとも70倍の拡大が得られます。プレート結合組換えマウスで活性化されたさらに増殖したINKT細胞。α alserを充填したCD 1Dは、刺激後48時間でIL 2、IL 4、IFNガンマ、TNFアルファ、およびIL 6を産生し、INKT細胞が増殖後もTH 1およびTH 2のサイトカインを産生する能力を保持していることを実証しています。

この手順を試みる際には、フローサイトメトリー中にINKT細胞を同定するためには、アルファセラミドを充填したCDREによるINKT細胞の適切な染色が不可欠であることを覚えておくことが重要です。もちろん。