運動の時空間マッピングで

ex vivo 腸管の包括的な時空間マップを作成する全体的な目的は、腸管セグメント全体の腸壁の詳細な動きを観察することで、管腔内容物に対する反応を研究することです。この手法の主な利点は、同一組織セグメント内の異なる領域における活動を空間的および時間的に記録して比較できるため、単純な収縮や弛緩ではなく、複雑な運動パターンを特定できることです。この方法は正常な腸管運動に関する知見を提供できるだけでなく、さまざまな薬剤や、栄養素などの管腔内物質がもたらす影響や運動パターンの特定にも適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、当初、時空間マップの解釈が困難であるため苦労することがあります。しかし、時間をかければ、複雑なパターンを一目で識別できるようになります。まず、安楽死させたモルモットから結腸または小腸を取り出します。

温めたKrebs液中でピンで固定します。解剖トレイの中で、内腔にKrebs緩衝液を穏やかに灌流させ、内腔の内容物をすべて除去します。先端が鈍いカテーテルを装着したシリンジを使用し、灌流中に結腸セグメントを過度に拡張させないように注意してください。

次に、長さ2〜3 mmのポリエチレンチューブ2本を、直径3 mmの火炎研磨済みガラス管カテーテル2本に取り付けます。加熱した解剖トレイ内で、一方のカテーテルを組織標本の口腔端に挿入し、サージカルノットを用いて、カテーテルを囲むようにチューブの短い断片の後方で縫合糸を縛ります。カテーテルをゆっくりと引き戻し、結び目がしっかりと固定されているか確認してください。

ポリエチレンチューブの小さな断片を用いることで、縫合糸の滑落を防ぎます。組織の遠位端にあるもう一方のカテーテルを使用して、この工程を繰り返します。その後、組織標本から腸間膜を取り除きます。

両方のカテーテルを固定した後、解剖トレイから準備した組織をGIMM臓器浴のいずれかに移し、口側が操作者とは反対方向を向くように組織を配置します。次に、ガラス管カテーテルの端を浴槽の側面に粘土で固定するか、カメラ固定用のポールにプラスチッククリップを用いてカテーテルを固定し、ガラス管カテーテルを臓器浴に固定します。その後、各カテーテルの開放端に5 cmのチューブを接続します。

経口カテーテルについては、短いチューブ片をルアーロック継手を用いて長いチューブ片に接続します。次に、5 mLシリンジをルアーロック継手に接続します。これを使用して、組織標本に緩衝液を注入します。

口端側カテーテルについては、チューブを用いて管腔内の流出液を回収容器へ導きます。次に、付属のシリンジを使用して、温めたKrebs緩衝液で組織をゆっくりとフラッシュし、口端側カテーテルから液体が出ていることを確認して、良好な流れが確保されていることを確かめます。その後、組織を30分間平衡化させている間に、ビデオ録画システムのキャリブレーションを行ってください。

GIMMソフトウェアを使用して、カメラの設置高さ、ビデオ設定（明るさとコントラスト）、および水平距離を校正します。校正するカメラの実験タブをクリックします。次に、「ファイル」メニューから「校正」をクリックします。

キャリブレーション・ワークステーション・ウィンドウにビデオが表示されたら、結腸腔内に挿入されたカテーテルの先端が画像に含まれる高さにカメラを設置します。次に、各バスに貼付されている半透明の定規ステッカーを使用して、画面上の画像で表示される水平距離のキャリブレーションを行います。同じキャリブレーション・ワークステーション・ウィンドウで、赤色の垂直ガイドラインの間隔が10 millimetersになるように設定します。

次に、この距離をディスタンスカーソルのウィンドウに入力し、Calボタンをクリックします。続いて、キャリブレーションワークステーションウィンドウ内のゲイン、明るさ、およびシャッターのスライダーを調整し、組織セグメントが明るい背景上の暗いシルエットとして表示されるようにします。その後、カメラ本体のフォーカスノブと絞りノブを調整し、さらに画像を改善します。

画像キャリブレーションを完了するには、[Save]をクリックし、次にポップアップ画面で[Yes]をクリックします。最後に、[Exit]をクリックします。30分間の平衡化時間の後、実験を開始します。

まず、実験試行に名前を付けます。次に、腹側カテーテルから突出しているチューブのルーメンをプラスチッククランプで遮断します。その後、約 7 milliliters の Krebs buffer を近位結腸ルーメンに注入します。

目的は、推進性収縮を開始させるのに十分な拡張を与えることです。管腔液によってセグメントが拡張されたら、ビデオ録画を開始します。ソフトウェアで、指定した試行をダブルクリックして実験用カメラビューを開き、トグルスイッチをオンにしてカメラ視野を表示します。

あらかじめ定めた長さのビデオデータを収集します。この最初の対照的な拡張試験の終了時に、クランプを緩めるか取り外し、組織セグメントが拡張液を管腔外へ押し出すようにします。組織を10〜20分間再平衡化させた後、処置を用いて同様の手順を繰り返します。

適切な休息時間を設ければ、1つの組織標本に対して1回10分の処理を最大5回まで行うことができます。組織の劣化を示す粘膜の剥離に注意してください。記録を解析するには、特定の試行名（trial）をダブルクリックして解析ウィンドウを開き、STマップを作成します。

ビデオ再生エリア内で、コントラストと明るさのスライダーを調整し、解析に適した画像にしてください。明るい背景の上に組織の黒いシルエットを作成します。次に、ビデオ画像ウィンドウ内の水平および垂直の赤色ガイドラインを設定し、解析対象となる組織領域を分離し、アーティファクトを含む領域を除去します。

次に、解析時間を設定します。タイムスライダーを適切な位置に合わせ、緑色のAボタンをクリックして開始点を、黄色のBボタンをクリックして終了点を選択します。続いて、Motor Analysisタブを選択してSTマップウィンドウを開き、ストップウォッチボタンをクリックします。

組織の黒いシルエット内にある十字カーソルをクリックして、STマップの生成を開始します。マップの生成が完了するまで数分かかる場合があります。STマップが構築された後、ズーム機能を選択して画像を拡大してください。

次に、カラーオプションを選択して、画像をグレースケールではなくカラーで表示します。続いて、「有効（enable）」を選択し、カーソルで解析するピクセルを選択できるようにします。選択したピクセルに関連付けられた組織について、管腔径の経時的な変化が解析され、STマップの右側に粒子径トレースとして表示されます。

解析後、「Exit」を選択します。次に、「File」から「Export Data」を選択し、「Metafile」を選択して、他の目的のためにSTマップをエクスポートします。ファイル名を指定し、「Save」をクリックしてemfファイルとして保存します。

この手法によって生成されたマップは、組織の管腔径の変化を距離と時間の両面から示しています。X軸は水平距離を、Y軸は時間を表しており、上端が開始時間、下端が終了時間となります。右上隅にある凡例には、管腔径の最小値と最大値、およびX軸とY軸の両方のスケールが表示されています。

したがって、グレースケール画像内の異なるピクセル陰影は、異なる管腔径に対応します。暗いピクセルはより広い直径に、明るいピクセルはより小さい直径に対応します。環状筋の収縮波は、管腔径の減少により、より明るいピクセル領域として現れます。

対照的に、輪状筋の弛緩または大量の液体塊による管腔の拡張は、より暗いピクセルで表示されます。伝播する収縮波に加えて、分節運動として知られる混合運動パターンも可視化できます。小さな静止的な収縮が、同時に異なる領域で発生します。

時間の経過とともに、これらの小さな収縮は口側から対口側の肛門端へと移動します。組織に残存している腸間膜は、暗い垂直線として現れるアーティファクトの原因となります。これらのアーティファクトによる垂直線の水平方向の動きを利用して、縦走筋の運動タイミングを決定することができます。

このビデオを視聴することで、ビデオ記録用の腸管切片の調製方法と、それに続く腸管運動の時空間マップとしての表現方法について十分に理解できるはずです。この手順に従い、腔内溶液にさまざまな栄養素を添加することで、天然成分が消化・吸収を促進するためにどのように特定の運動パターンを誘導するかを決定できます。また、神経性体液因子の受容体に対する特定の薬理学的アゴニストやアンタゴニストを用いることで、運動が開始され伝播するメカニズムを明らかにすることができます。

この手法は、運動機能障害の治療に有用な化合物を特定するための有用なデータの作成に寄与すると考えられます。