2.7: 幹細胞生物学入門

その名前が示すように、幹細胞は、多くの異なる細胞タイプが「幹」を形成する前駆体です。それらは、その効力、つまり3つの生殖細胞層すべてから細胞に分化する能力、および再生可能性、つまりより多くの幹細胞を生成する能力によって特徴付けられます。発生生物学と再生医療の分野を進歩させることを望んで、幹細胞研究者は、これらのユニークな細胞がどのようにしてこのような大きな偉業を成し遂げるのかを理解しようとしています。

このビデオでは、幹細胞生物学の分野における主要な発見、この分野の科学者が提起した主要な質問、幹細胞研究者が使用する著名な方法、および幹細胞研究の応用を取り上げています。

幹細胞の概念を紹介したので、幹細胞研究の豊かな歴史に飛び込みましょう。

1960年代、アーネスト・マカロック博士とジェームズ・ティル博士は、成体哺乳類の骨髄に造血幹細胞が存在することを示す最初の決定的な証拠のいくつかを発見しました。これらの細胞は自己複製能力を持ち、多能性であるため、血液系や免疫系の細胞など、複数の限られた種類の細胞に分化することができます。

1988年、Irving Weissmanたちの研究グループは、マウスの骨髄から造血幹細胞を精製する方法を完成させた。

1981年、ゲイル・マーティン教授は「胚性幹細胞」という用語を作り出しました。造血幹細胞とは異なり、胚性幹細胞は多能性であり、体のすべての細胞タイプに分化する能力を持っています。彼女と科学者のマーティン・エバンスとマシュー・カウフマンは、同時に、しかし別々に、マウスの胚盤胞から内部細胞塊を抽出し、それらを幹細胞としてin vitroで培養する方法を開発しました。

1998年、マウス胚性幹細胞の単離から10年以上が経過したジェームズ・トムソン博士は、初のヒト胚性幹細胞株の樹立に成功しました。

2006年、山中伸也博士が考案した人工多能性幹細胞の登場により、大きなブレークスルーが起こりました。ジョン・ガードンの研究を基に、山中博士は、レトロウイルスを用いて「ヤマナカ因子」として知られる転写因子の小さなセットの発現を誘導することにより、分化した細胞を多能性状態に再プログラムする方法を開発しました。 得られた細胞を「人工多能性幹細胞」または「iPSC」と名付けました。これらの実験は根本的に重要であると考えられ、山中氏とガードン氏は2012年にノーベル賞を受賞しました。

現在、いくつかのヒト疾患のiPS細胞モデルと、複数の組織における再生プラットフォームがあります。

今日、幹細胞研究は、いくつかの包括的な問題によって推進されています。

これらの質問の中で最も重要なものの1つは、幹細胞がどのようにして多能性と再生可能性を維持しているのかということです。幹細胞には、これらの特性を付与する2つの関連する特性があります。1つ目は、幹細胞性や自己再生に不可欠な特定の遺伝子の発現です。2つ目は、これらの遺伝子の発現に影響を与える制御因子に対する幹細胞の応答性です。

次の論理的な問題は、幹細胞の分化はどのように指示されるのかということです。幹細胞が成熟細胞に成長すると、特定の分化経路が活性化すると遺伝子発現が変化し、幹細胞遺伝子がオフになり、組織特異的な遺伝子がオンになり、細胞の機能と形態の特殊化が進みます。

最後に、幹細胞研究の資金提供を推進する主な問題、つまり幹細胞を病気の治療に使用できるかどうかについてお話ししましょう。再生医療は、1)研究室で臓器を再生させること、2)移植によって幹細胞を移植して組織変性を治療することの2つの方法でこの問題に取り組んでいます。

幹細胞生物学に関する重要な疑問をいくつか紹介したところで、それらに対処するために使用されたいくつかの重要な方法を見ていきましょう。

マイクロアレイ技術を採用することで、幹細胞にどの遺伝子が効力と再生性を付与するかを発見することができます。この手法では、全RNAが細胞集団から単離され、現在の遺伝子発現のスナップショットとして機能します。一連のステップで、このmRNAは蛍光標識プローブに変換され、ヒトゲノム全体の転写産物を含むチップにハイブリダイズされます。このチップをスキャンすると、相対的な遺伝子発現プロファイルが読み取られます。ご覧のとおり、幹細胞は分化した細胞とは異なる特定の遺伝子セットを発現します。

多能性遺伝子の別のアッセイには、Oct4-GFP検出システムが含まれます。Oct4は自己更新に必要であり、分化中に急速にダウンレギュレーションされます。したがって、その表現は「茎性」の信頼できる指標として機能します。この実験では、細胞はOct4プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現します。その後、これらの細胞を実験的に操作し、GFP発現の変化を解析して、自己再生を調節する新しい遺伝子や可溶性因子を同定します。

in vitroで幹細胞を研究するためには、まず幹細胞の培養方法を理解する必要があります。幹細胞は、幹細胞性を維持するために特定の微小環境を必要とします。これは、幹細胞をマウス胚性線維芽細胞(MEF)などのフィーダー細胞と共培養することで達成できます。MEFは、必要な多能性と自己再生因子の複雑な混合物を分泌します。

時には、幹細胞のフィーダーフリー培養を行うことが望ましい場合があります。フィーダーフリー細胞株を維持する主な方法は、細胞培養培地に増殖因子および阻害因子のストック試薬を補充することです。

in vitroでの幹細胞の分化は、いくつかの方法を使用して行われます。遺伝子発現の違いは、細胞の特殊化に最終的に関与します。ここで見る2ステップの方法では、培養マウス胚性幹細胞をニューロンの運命に備えてから、運動ニューロン誘導培地でさらに分化させます。これらの因子は、遺伝子発現の特定の経路を活性化し、運動ニューロンに特徴的な形態学的およびプロテオミクス的変化をもたらします。

従来のin vitro分化の主な欠点の1つは、フラットプレートが細胞の3D増殖を制限することです。吊り下げ式やマイクロカプセル式は、これらの問題を回避します。吊り下げ式では、幹細胞懸濁液の小滴をペトリ皿の蓋に播種し、逆さまに培養して、胚様体と呼ばれる幹細胞の凝集体を形成します。

マイクロカプセル化法では、幹細胞をアルギン酸と呼ばれる生体適合性の半透膜と混合し、ビーズとして細胞培養プレートに堆積させます。どちらの方法も、ドーパミン作動性ニューロンや心筋細胞などの特殊な細胞へのさらなる分化を可能にします。

分化の方向性を知ることは、幹細胞を再生医療に利用するための大きな一歩です。幹細胞移植療法は、幹細胞で損傷した組織を修復することにより、変性疾患を治療および治癒することを目的としています。この実験では、患者様の体細胞を山中因子のレンチバラル感染によりiPS細胞に再プログラムします。細胞は多能性状態から特定の細胞型に分化し、損傷した組織を修復するために宿主に戻されます。

幹細胞の調査に使用されるいくつかの方法がわかったところで、これらの方法が特定の実験でどのように適用されるかを見てみましょう。

この実験では、多発性硬化症のマウスモデルを用いて、罹患したマウスに神経幹細胞を静脈内注射します。治療したマウスの脳切片を採取し、顕微鏡で画像化して移植の成功を評価します。ドナーニューロン前駆細胞に由来する細胞は、レポーター遺伝子LacZを使用して追跡されます。ご覧のとおり、多くのドナー幹細胞が分化し、病気のマウスの中枢神経系に統合されています。

すべての病気が全身注射で治療できるわけではありません。たとえば、軟骨の損傷は、周囲を再構築するために特殊な足場を必要とします。この実験では、間葉系幹細胞と凝固因子の混合物を一緒に培養して血栓を形成します。次に、血栓をウサギの損傷した膝軟骨に配置し、統合させます。この手順に続いて、膝の軟骨が滑らかで機能的な関節にリモデリングされるのが観察できます。

時には、幹細胞研究者と組織エンジニアがチームを組み、臓器全体を再構築することもあります。この実験では、霊長類の肺を洗浄して臓器を脱細胞化し、細胞以外の構造成分のみを残します。次に、この「ゴースト」肺をバイオリアクターに移し、そこで血管幹細胞と上皮幹細胞を播種します。自然な肺が経験する圧力と行動をさらに模倣するために、バイオリアクターは媒体を循環させ、圧力とガスのレベルを維持し、肺を膨らませます。

JoVEの幹細胞生物学の概要をご覧になりました。要約すると、このビデオでは、幹細胞とその歴史、メンテナンス、分化と送達の方法、および幹細胞の応用について説明しました。ご覧いただきありがとうございます!