Name: ヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件づけ法。円筒型トレッドミル上で歩行を許容しながら正確なヒゲ刺激を行い、学習と記憶の神経生物学的メカニズムを解明する。この手法は遺伝的操作マウスを用いて記憶障害治療の可能性を探る。

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この作品は、国防総省（W81XWH-13-01-0243）と国立衛生研究所（R37 AG008796）によって賄われていました。我々は、ヘッド固定シリンダ装置を構築するためのノースウェスタン大学の機械工場でアラン・ベイカーに感謝します。私たちは、MATLABとSolidWorksで彼の指導のために博士Shoai服部に感謝します。我々は実験を制御LabVIEWソフトウェアのためのドクター・ジョンの電源を感謝します。

マウスを含むすべての手順は、国立衛生研究所によって発行されたガイドラインに基づいて、ノースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。 1.シリンダー（図2A） <ol><li> Chettih らとHeiney らによって記載されているようにシリンダーを構築します。長い泡シリンダー14-15から。 12.7ミリメートル金属棒、シリンダの10cmの長さをカットし、車軸に合わせて中央に穴をあけ（0.5インチ）の直径で。 Heiney らによって記載されているように、金属の光学ブレッドボード上にその軸を有する円筒をマウントします。または、別の支持体（ 例えば、プレキシグラス）15。 </li><li>シリンダの両側に、直径12.7ミリの2つの垂直な金属棒を立てます。 </li><li>金属棒の上に2の直角マウントを取り付けます。 </li><li>直角マウントで（長さ5cm、直径12.7ミリメートル）2以上のロッドを固定します。ベベル番目eは、これらのロッドの端部とシリンダ（ 図2G）の中央の上に、その端部を平ら。 </li><li> （ 図2G）場所でコネクタの翼を保持する2 4-40機械ねじに合うようにロッドの平ら両端に穴をドリルとタップします。 </li></ol> 2.組み立てウィスカ刺激システム（図2B） <ol><li>定期的な毛の櫛からコームの10歯のセグメントをカットします。 </li><li>スリットをカット2〜3mm程度、幅約5mm 2層長方形の曲げアクチュエータを受け入れるようにコームの上部に深いです。 </li><li>曲げアクチュエータの各表面に1線をハンダ付けします。メーカーが提供するはんだとフラックスを使用してください。電流からのマウスとユーザーを保護するために電気テープとアクチュエータとはんだをカバーしています。 </li><li>曲げアクチュエータストリップは、コームの平面に対して垂直に座っているように、櫛にカットスリットにアクチュエータストリップをスリップ。角それは4で傾斜するように櫛5°、より自然には、マウスの顔の曲線に従います。 </li><li>急エポキシとコームの上部にアクチュエータストリップの端部を固定します。 注：曲げアクチュエータストリップに半田付けワイヤはアクチュエータに40ボルトを提供するレオスタットに接続する必要があります。以前の実験は、40ボルトのコンディショニングのために有効であるが、任意の驚愕応答を誘発しないことを示しています。 </li><li>可動マウント上の曲げアクチュエータとコームを置きます。通常のin vitro電気生理学リグのために使用される磁気ベースに装着されたピペットホルダーはうまく動作します。 </li></ol> 3.シリンダー（図2C、2E）上記ロッドにマウントコネクタの組立注：コネクターは、3-DはワイスとDisterhoftとガルベスらによりテザーに使用アンフェノール221シリーズのナイロンストリップからモデル化された7穴ストリップを印刷している10,17。 <ol><li> 0-80 X-1のためにストリップの最初の穴をタップします「小ねじ。これは、コネクタにヘッドピースを固定する固定ネジとして機能します。手でネジを回し容易にするために、シアノアクリル接着剤で固定ネジの頭に0-80ナットを貼付。 </li><li> （0-80マシンナットのスペースを確保するために、）タップ穴の後に空の穴を残し、残りの5つの穴を通って5金メッキrelia-TACソケットを押してください。 </li><li>ソケットの両端に5長い配線（イーサネットケーブルから得られた線材）とはんだオフコーティングをはがし。 注：最初の2本のワイヤは、アンプからの信号のフィルタリングと増幅後の瞬目の応答を検出する筋電（EMG）信号を記録するために使用されます。第2は、刺激アイソレータからの衝撃信号を提供します。最後の線はグランド接続として機能します。これらのワイヤは、時限CS-USの送達のために使用されるシステムに接続されます。 </li><li> MULTと線とソケットとの間の電気的接続性を確保imeter。継続設定にマルチメータを入れて、ピンと電線の被覆の末端に他のプローブにプローブの1つを保持します。抵抗が低く、マルチメータは、音を出すときにピンと配線が電気的に接続されています。 <ol><li>マルチメータは、連続設定がない場合は別の方法として、ピンと線間の抵抗を測定します。測定はほとんど抵抗がある場合、電気的導通があります。 </li></ol></li><li> 2 TO-220スタイルのトランジスタからコネクタの翼を準備します。トランジスタのエミッタ、ベース、コレクタリードを遮断し、それがコネクタに固定することができるように、表面を平ら。 </li><li>タブは、ねじの頭の下に滑ることができるように穴を突破するために取り付けタブの端をカットします。 </li><li>コネクタにトランジスタをエポキシ。取り付けタブの穴は、シリンダ、上記ロッドにコネクタを固定するために使用されます。 </li><li> PRワイヤーのベースにエポキシ樹脂を適用しますソケットからotrudingとエポキシを乾燥させます。エポキシは、接続を絶縁し、保護します。 </li></ol> 4.ヘッドピースを準備する（図2D、2E） 注：ヘッドピースストリップ3-Dは、ワイスとDisterhoftとガルベスらによりヘッドピースに使用アンフェノール221シリーズのナイロンストリップからモデル化された7穴ストリップを印刷されている10,17。この作品は、もはや商業的に製造されていません。プリンタファイルは、この雑誌のウェブサイトからダウンロードすることができます。 <ol><li> 0-80×1 &quot;小ねじ用のストリップの最初の穴をタップして、最初の穴の後に空の穴を残します。 </li><li> （狭い端部を介して）残りの5つの穴の底部を通って5金メッキピンを押してください。均等にストリップにピンを押し込む容易にするために、万力を使用してください。 </li><li>熱ストリッパーを使用して、ワットのむき出し部分をはんだ付けし、ステンレス鋼線（直径0.005）の末尾からポリイミドコーティングの約0.5cmを削除ピンの1つの開口部への怒りとは0.6〜0.7センチメートルにワイヤーをカット。 </li><li>現在は動物に渡すことができるように、ワイヤの端から約0.2センチはがし。 </li><li>繰り返して、残りの3本のワイヤのための4.3から4.4を繰り返します。 注：第2は、動物にショックを与えるのに役立つだろうしながら最初の2本のワイヤは、EMGの応答を記録します。 </li><li>最後（五）ワイヤはアース線として機能するように、（0.005インチ径）コーティングされていないステンレス鋼線の約5センチカットし、残りのピンにハンダ。 </li><li>ワイヤとマルチメータとピン間の連続性を確保。 （コーティングされていないアース線の場合には、マルチメータのプローブは、ワイヤに沿って任意の場所に配置することができます。） </li></ol> 5.外科的準備（図2F） <ol><li>ヘッドピースを含め、すべての手術器具を滅菌します。アルコールに浸漬した後、滅菌生理食塩水ですすぐことによりヘッドピースを滅菌します。 </li><li>三から四パーセントvで誘導室でマウスを麻酔毎分酸素の1-2 Lの流量と混合イソフルランaporized。 </li><li>動物はつま先のピンチと完全に麻酔をかけていることを確かめます。それはつま先のピンチに反射的に応答しないときにマウスが完全に麻酔をかけています。 </li><li>動物が完全に麻酔された後、動物の頭の上を剃る、鎮痛剤（0.05から2ミリグラム/ kg、皮下）としてブプレノルフィン塩酸塩の投与量を注入定位フレームのベースに覆われた加熱パッドの上に置きます、動物が完全に麻酔されていることを確認し、フレームに頭部を固定します。毎分酸素の1-2 Lの流量で2％への切り替え、動物に気化イソフルランの流れを維持します。角膜に眼軟膏の少量を適用します。 </li><li>両者の間に交互に、ポビドンヨードとアルコール3時間ごとに頭皮を消毒します。 </li><li>番号10または15手術用メスの刃で、トンの正面から頭蓋骨を露出させ、頭皮の正中線に沿って切開を作ります頭頂間骨（〜1.5〜2センチメートル）過去に、彼の目を。 </li><li>マイクロクリップで皮膚のフラップを控えます。目の上1つのクリップ、吻側-尾側軸の中央に沿って、そして両側性頭蓋骨の背面に1つずつ（ すなわち、すべての6つのクリップを使用）を配置します。かぶと裂離を防止するために、側面と背面を含め、可能な限り頭蓋骨の多くを公開します。これは、接着剤合着セメントの適用のための表面積を増加させます。 </li><li>メスを用いて、骨膜を除去し、清潔で乾燥した作業面を確保するために頭蓋骨の上部に沿ってこすり。 3％過酸化水素3回頭蓋骨の上部を清掃してください。 </li><li> 00から90本のネジを受け入れるようにサイズ34逆円錐バリまたは1.6ミリメートル彫刻カッタードリルビットで（で0.0625を。長い）頭蓋骨に二つの穴を開けます。ネジは、電気的接地接続を提供します。時RIGHコンディショニング1ブレグマの前方の穴、およびラムダの前で他を置き、正中線の左トンの目。各穴にネジを1本置きます。各フルターンのための頭蓋骨にネジ0.28ミリメートルを下げ、 2つの完全なターンで十分です。 </li><li>セメント表面積および握力を高めるために頭蓋骨に直径が0.75程度ミリの複数の小さなくぼみを作ります。 </li><li>完成したヘッドピースを取ると2本のネジの周りに八の字構成でアース線を巻きます。ヘッドピースは、後に適切に配​​置することができるように、アース線にいくらかのたるみ（ヘッドピースとネジの間~1.5センチ）を許可します。 注：図8は、通常のワイヤとグランドスクリュー間の良好な電気的接続を確実にします。ワイヤはまた、電気的接続を確実にするために、スクリューに半田付けすることができます。 </li><li>接着剤合着セメントを適用します。接着剤合着セメントを混合するための製造元の指示に従ってくださいまたはL-パウダーミックスの4スクープ、ベースの8滴、冷セラミック混合皿中の触媒の2滴を混ぜて（温度ストリップOを確保nは混合料理は完全に黒です。）冷たい温度はセメントの作業時間を延長します。 <ol><li>コー​​ト頭蓋骨とネジ自由に合着セメントと、セメントを乾燥させます。これは、わずか数分かかります。 </li></ol></li><li>セメントが乾燥した後、ピンは頭蓋骨の上に、立って、垂直方向にヘッドピースを置きます。コネクタに似ホルダーを所定の位置にヘッドピースを保持します 注：「3.コネクタのアセンブル」を参照してください-Theホルダーはヘッドピースのピンを受けるために、金メッキソケット付き5ホールのストリップである必要があります。ホルダは、定位フレームのアームに取り付けられています。ホルダーとアームの使用は、ヘッドピースとワイヤの配置を容易にします。 </li><li>ヘッドピースが配置された後、眼窩周囲の周りの皮膚をバック剥離し、エンドを剥奪0.2センチメートルがEYに直接尾を皮膚の下に休み、約2〜4 mmまで可能にするために2ショックワイヤを配置電子。 2本のワイヤの端部が互​​いに接触しないようにしてください。眼窩の上に筋眼輪筋上の2つのEMGワイヤを配置します。 <ol><li>必要であれば、彼らが長すぎると思われる場合、彼らは直接軌道を傷つけ、感染をもたらす可能性があるかのように、ワイヤの端を切り落としました。ワイヤーの両端を切断した場合、露出した十分な裸線があることを確認してください。また、ワイヤが長すぎるように見える場合は、バック彼らはヘッドピースの外に拡張するベース、でワイヤーを曲げます。 </li><li>接着剤合着セメントの小さな広がりと頭蓋骨上の場所でのワイヤのベース（ヘッドピースに近いすなわち 、end）をセメントと、（先に説明した部分の半分を使用）乾燥させます。 </li></ol></li><li>マイクロクリップを外し、そっと背中セメント上の皮膚のフラップを折ります。皮膚が瞬目反応のまぶた、予防の歪みを回避するために、皮膚の任意の部分に張力を防止するために、 自然に沈ませ、そして動物に苦痛。 </li><li>セメントとヘッドピースの上部の縁に切開皮膚からのすべてをカバーする、歯科用セメントで露出面積をシール。目やヘッドピースのピン上にセメントを滴下避けるために細心の注意を払ってください。部分的に硬化したセメントは、平滑化し、歯科用セメントの溶剤を浸した綿棒で操作することができます。セメントは、ヘッドピースホルダーを取り外す前に完全に乾燥することができます。 </li><li>動物がケージに戻って動物を交換する前に、温め表面に麻酔から回復することを可能にします。メタカム（1ミリグラム/キログラム、SQ）を管理し、再びそのケージに動物を配置します。 </li><li>回復の動物5-7日は、テストやトレーニングの前に許可します。あなたの機関のガイドラインに従って動物に標準的な術後ケアを維持します。それは手術から回復した後の動物は、1日あたり少なくとも1回チェックする必要があります。貧しい食および/または飲酒と物憂げな行動の兆候を監視します。痛みの場合緩和まで疑われ、メタカム24時間ごと（術後の終了時と同じ用量）を提供します。リドカインは、局所的に動物が傷または不快の徴候を示している場合、創傷に適用することができます。 </li></ol> 6.シリンダーとトレーニング（図2G）にマウスを置きます<ol><li>シリンダーの上にマウスを配置するには、片手で尾によって、それを保持し、その後、他と人差し指と親指で肩の後ろにマウスをつかんで簡単に手でマウスを拘束。マウスの腹部と胴体の周りに残りの指を包みます。 </li><li>手がマウスを拘束されないと、マウスの頭部にヘッドピースにコネクタを取り付け、ネジを回します。 </li><li>シリンダーに静かにマウスを置き、フレームにコネクタを装着しながら、所定の位置に保持します。シリンダー上記バーにコネクタを固定する2本のネジを使用してください。 </li><li>コネクタは、シリンダフレームに固定された後、RELEマウスのホールドアーゼ。シリンダーにマウスを馴化の二つのセッションの1日を与えます。各馴化セッションを各コンディショニングセッションと同じ時間を許可します。 <ol><li>レコードの自発的なまばたきの馴化中レートとプレ公開驚愕応答の発生を最小限にするために、ウィスカー振動CSにマウスを。しかし、電気ショック米国せず、実際のコンディショニングセッション中としてCSを適用します。 </li><li>ウィスカ刺激CSは、個々のウィスカー以上の櫛の歯を滑りながら、マウスの馴化側（右側）にピエゾ方式の近く（約0.5cm）を配置することによって適用されます。同じウィスカが日ごとに同じ位置にピエゾシステムを配置することによって、日々刺激されることを確認してください。 </li></ol></li><li>古典的条件の上でマウスを訓練し始めます。 5日間、1日あたりのトレーニングの二つのセッションを提供します。各トレーニングセッションの間に約2時間を残します。 <ol><li>エアコングループ、デリへ（ - WPIのA385R刺激アイソレータから配信3ミリアンペア、0.3ミリアンペア）100ミリ秒の長い電気パルス米国と対に250ミリ秒の長いウィスカの振動CS（60ヘルツ）のセッションごとに30トライアル版。海馬（ 図1）23上のタスクに依存するために250ミリ秒長く刺激のないトレース間隔でCSと、私たちを引き離します。 </li><li>まばたきが誘発されるように、それぞれの動物のための電気ショックの強さを調整します。 30-60秒のランダムな試行間間隔で区切り試験（45秒、セッションごとに30分の合計時間の平均値。） </li><li>エアコングループについて述べたのと同じ刺激パラメータを使用して、pseudoconditionedグループに一人で30不対CSを提供し、米国（60試行の合計）は、単独での試験それぞれ。 CS単独および米国単独試験は全く刺激が複数回行で提示されていないようpseudorandomizedされていることを確認してください。 22.5秒の平均試行間間隔で各試験を区切ります。 </li></ol></li><li>デウィスカの刺激によって発生する振動の任意のノイズをマスクするために、慣れや訓練を通じて65デシベルで肝臓バックグラウンドノイズ。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

古典的な瞬目のコンディショニングは、学習と記憶の基礎となる神経基盤を理解するために有用なツールである連想学習の一形態です。マウスなどのげっ歯類の瞬目のコンディショニングのために使用前の方法は、動物が約自由に移動するのを許可されたチャンバーを関与します。シーゲルらに光誘発トレース瞬目コンディショニングにChettih らとHeiney ら。そして最近で利用することにより記載された装置を使用して、マウスにおける瞬目のコンディショニングのためのヘッド固定準備は、このような特定を可能にするなど、いくつかの利点を提供していますことができなかったのか、14-16（ 生体内二光子カルシウムイメージングでは 、例えば ）過去に制限されていた瞬目コンディショニング中に実行する手順と実験。調製のこのタイプはまた、四極アレイとのin vivo電気生理学のような他の技術の使用を容易にします。マウスはdistreになるように見えるように拘束からssed、この頭部固定準備が必要な拘束の量を削減しながら、安全なヘッドを維...

瞬目のコンディショニングは、パブロフの条件付けと連想学習と記憶の神経機構を調査するためのモデルシステムの一形態です。それは、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、およびマウスを含む様々な種において研究されています。パラダイムは、2つの対になった刺激の提示を含む：ニュートラル条件刺激（CS; 例えば 、音、光のフラッシュ、またはウィスカ刺激）、および顕著な無条件刺激（米国; 例えば 、目への空気パフを、または眼窩周囲ショック）。米国は無条件、反射的瞬目反応（ すなわち 、UR）を誘発します。最終的には、対になったCS-USのいくつかのプレゼンテーションの後、被験者は、米国でCSを関連付けることを学びます。この学習は条件反応（CR）、米国のプレゼンテーションの前にCS単独によって誘発された瞬目の形で現れます。 トレース形式で瞬目のコンディショニングは、数時間の刺激のない間隔を含み、CSと米国（ 図1）を分離undredミリ秒。それは刺激の偶発1の認識を必要とするので、トレースコンディショニングは、宣言的な学習の一形態です。時間的なギャップは、関連1-6になるために米国とCS用のために、このような海馬のような前脳領域ではCSの神経「トレース」を維持するために動物を必要とします。前脳領域に加えて、痕跡条件はまた、小脳7に依存しています。 瞬目のコンディショニングは、したがって、買収、統合、および検索を含むメモリの複数のファセットの調査のための有用なパラダイムです。瞬目条件付けの間、動物の対照群は、米国のプレゼンテーションだけではなく、学習したCS-US協会によって引き起こされる可能性がCSにpseudoconditioningまたは感作された応答をテストするランダムな順序で不対刺激が提示されます。 一般的に使用されるapparaTUSげっ歯類における瞬目のコンディショニングの調査のために齧歯類が訓練プロセス8-10の間、約自由に移動することが許可されているチャンバです。この種の装置では、テザーは、通常、げっ歯類の頭蓋骨に固定されているヘッドピースに取り付けられています。テザーは、米国（そして時にはCS）の送達のために、それらの刺激に対する動物の反応（ すなわち、瞬目反応）10を送信することができます。テザー自体は配信刺激のタイプに基づいて修正されてもよいし、瞬目の応答を記録する方法。 瞬目のコンディショニングのために「自由に動く」係留マウスを使用する理由は、マウスが拘束闘いということです。他の種の拘束により適してもよいが、瞬目条件付け実験において、マウスを使用することの主な利点は、利用可能な遺伝的に改変された変異株の大部分はマウス系統であることです。苦労に加えて、完全な解像度マウスのtraintは、急性苦痛になります。応力を最小限にヘッド固定マウスの調製は、瞬目のコンディショニング中に得られる生体情報を増加させます。例えば、このシステムは、2光子顕微鏡11と皮質ニューロンの画像化を可能にします。 頭部固定製剤は、また、マウス11における瞬目のコンディショニングのためのプラットフォームとして、四極アレイ、二光子カルシウムイメージングで齧歯類の脳の生体内電気生理学的記録に 、取り外し可能な頭蓋インプラントを介して皮質の光学的画像化のために、前の実験で使用されています-16。 頭部固定システムでは、信頼性の刺激と記録は、マウス（ 図2）を完全に拘束することなく確保されています。自在移動系で使用されるようなヘッドピースは、マウスの頭蓋骨に固定されています。トレーニング中に、ヘッドピースは、上バーに取り付けられているコネクタに取り付けられていますげっ歯類の頭（ 図2A）を安定化するために、円筒状のトレッドミル。円筒状のトレッドミルは、マウスを快適に休息することができますが、マウスがそう望む場合、また、それを実行するか、歩くことができます。このシステムを使用することで、マウスはCSや米国のような穏やかな眼窩周囲の電気ショックなどのウィスカー振動（ 図1）を用いて訓練することができます。米国は、外科的に目には横方向の皮膚の下に配置配線を介して配信されます。 CSは、2層の矩形曲げアクチュエータ（ 図2B）に接続されている櫛を介して配信されます。櫛曲げアクチュエータは次いで、トレーニング中に適切な位置に移動させ、それぞれの個々の動物のための最適な送達のために調整されている磁気ベースに取り付けられています。櫛は、選択したウィスカーを跨ぐように配置されています。 CSの配信中に、信号が櫛を置換し、ウィスカ17の振動につながる曲げアクチュエータに送信されます。 16,18,19のマウスで効果的な条件刺激として使用されています。ウィスカの刺激は、この実験パラダイムでCSのために選択される理由は、探査中の体性感覚情報入力のための彼らの鼻毛上のマウスの動物の依存性です。ウィスカ刺激は、信頼性と効果的なCS 20であることが示されています。 CSは瞬目コンディショニング20,21の学習に関連した皮質の変化と可塑性をマッピングするためのエレガントなツールを提供するようさらに、鼻毛システム（ すなわち 、バレル皮質）の十分に確立し、組織化皮質基板、ウィスカ刺激を与えられました。頭部固定システムは、刺激ニューロンおよび非刺激ウィスカーからの入力を受けるニューロン間の応答を比較するために選択したウィスカーの正確な刺激を可能にします。最後に、マウスの多くの株は、年齢関連難聴などの比較的若年成人を示します<su（視覚CSは驚愕応答16の問題を改善していますが）エアコン点滅中のp&gt; 22、およびまぶたの閉鎖は、視覚的なCSを変化させます。ウィスカの刺激は、これらの合併症のいずれかに影響されません。 ここで提示CSと米国の送達のための方法、および瞬目レスポンスの取得など、瞬目のコンディショニングのために他のヘッド固定製剤、時のユニークで重要な変更があります。この装置と瞬目コンディショニングの訓練パラダイムの信頼性は、エアコン、マウスとpseudoconditioned対照動物（ 図7A）から比較的平坦な学習曲線から曲線を学習することによって実証されています。

<table><tbody><tr><td>Exervo TeraNova フォームローラー 36インチ x 6インチ&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B002ONUM0E</td><td>シリンダー用</td></tr><tr><td>プレキシガラス</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド; 厚さ 1 cm</td></tr><tr><td>金属棒 (12.7&nbsp;mm径)</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>4-40小ネジ(.25&nbsp;で。長い)</td><td>シリンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の古典的な設計の毛櫛Conair</td><td></td><td>93505WG-320</td><td>のためのアマゾン供給B00F33Q8QO ひげの刺激</td></tr><tr><td>のための2層の長方形の曲がるアクチュエータ</td>ーの<td>ピエゾ システム</td><td>T220-A4-303X&nbsp;</td><td>ウィスカ刺激用</td></tr><tr><td>はんだおよび流束キット</td><td>ピエゾ システム</td><td>MSF-003-NI</td><td>ウィスカー刺激用</td></tr><tr><td>磁気ベース ト</td><td>ールラボ</td><td>MB175</td><td>ウィスカー刺激用</td></tr><tr><td>磁気ベース</td><td></td><td></td>用ネジ付きロッド <td></td></tr><tr><td>エレクトロニック・コネクター・コーポレーションの221シリーズ・ナイロン・ストリップ・コネクターをベースにしたカスタムメイド・ストリップ</td><td></td><td></td><td>WeissとDisterhoftに基づくカスタムメイド、2008</td></tr><tr><td>TO-220スタイルトランジスタ</td><td>Amazonサプライ</td><td>B0002ZPZYO&nbsp;</td><td>コネクタ用、翼用</td></tr><tr><td>Relia-TACソケット電子</td><td>コネクタ株式会社</td><td>220-S02</td>コネクタ<td>用</td></tr><tr><td>Relia-Tac Pins</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-P02</td><td>ヘッドピース</td></tr><tr><td>用 0-80 ステンレス製小ネジ (長さ 1 インチ)</td><td>Amazon Supply</td><td>B000FN68EE</td><td>ロッキングスクリュー</td></tr><tr><td>0-80 ステンレス製小ネジ 六角ナット (厚さ 5/32 インチ)</td><td>Amazon Supply</td><td>B000N2TK7Y</td><td>ロッキングスクリューヘッド</td></tr><tr><td>ロックタイト スーパーグルー-液体</td><td>ロックタイト</td><td>1365896</td><td>シアノアクリル接着剤; ロッキングスクリュー用</td></tr><tr><td>クイックセッティングエポキシ</td><td>エースハードウェア</td><td>18613</td>コネクタ<td>およびウィスカ刺激システム用</td></tr><tr><td>イーサネットケーブルワイヤーイーサネット</td><td></td><td></td><td>ケーブルは、コネクタポリ</td></tr><tr><td>イミドコーティングされたステンレス鋼線(2&nbsp;で。ロング、.005インチdiameter)</td><td>PlasticsOne</td><td>005sw/2.0 37365 S-S&nbsp;</td><td>ヘッドピース、EMG、ショックワイヤー用</td></tr><tr><td>ステンレス鋼のコーティングされていないワイヤー(.005&nbsp;で。直径)</td><td>AMシステム</td><td>792800</td><td>ヘッドピース、アース線用</td></tr><tr><td>Tenma 可変単巻変圧器</td><td>Tenma</td><td>72-110</td><td>ウィスカー刺激用;曲げアクチュエータへの電流を調整するレオスタット</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>AMシステム</td><td>1700</td><td>EMG信号のフィルタリングと増幅用アンプ</td></tr><tr><td>WPI A385R刺激アイソレータ</td><td>ワールド精密機器</td><td>31405</td><td>電気ショック</td></tr><tr><td>Isothesia(イソフルラン)</td><td>Henry Schein: Animal Health</td><td>50031</td><td>手術用; 麻酔</td></tr><tr><td>Buprenex 注射可能 CIII</td><td>Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>手術用; 鎮痛剤</td></tr><tr><td>アクワ 涙: 潤滑剤 眼科用軟膏&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>麻酔下でドライアイを防ぐための人工涙液</td></tr><tr><td>ポビジン-ヨウ素準備パッド</td><td>PDI</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td>手術用;消毒</td></tr><tr><td>剤 アルコール準備パッド</td><td></td><td></td><td>任意の標準的な薬局から購入することができます</td></tr><tr><td>ステンレス鋼の外科用メスハンドル(no.3)</td><td>インテグラミルテックス&nbsp;</td><td>4-7.</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ステンレス製外科用メス刃</td><td>インテグラ・ミルテックス</td><td>4-310または4-315</td><td>手術用 10番または15番 メス刃</td></tr><tr><td>3% 過酸化</td><td></td><td></td>水素 <td>標準的な薬局から購入可能</td></tr><tr><td>マイクロクリップ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5459</td><td>手術用、皮膚を抑える</td></tr><tr><td>00-90 ステンレス製小ネジ (0.0625&nbsp;で。long)</td><td>Amazon Supply</td><td>B002SG89X4&nbsp;</td><td>手術用、アース線を巻き付ける</td></tr><tr><td>専門の回転用具</td><td>クルミのくり空</td><td>29637</td>外科<td>のための手のドリル、頭蓋骨の穴をあける</td></tr>ために <tr><td>逆円錐形のBurr</td><td>Roboz</td><td>RS-6282C-34</td><td>逆円錐形のぎざぎ穴のサイズ34; 外科のため、頭蓋骨の穴をあけるために</td></tr><tr><td>彫版カッター 彫版のカッター</td><td>ドレメル</td><td>106</td><td>彫版カッター; 1.6 mmのビット; 外科用、頭蓋骨の穴をあけるため</td></tr><tr><td>C&B メタボンド-クイック!セメントシステム "B" クイックベース</td><td>パーケル</td><td>S398</td><td>手術用;接着剤ルティングセメントシステム;ヘッドピースの剥離を防ぐために重要</td></tr><tr><td>C&B メタボンド-クイック!セメントシステム クリア L-パウダー</td><td>パーケル</td><td>S399</td><td>手術用;接着剤 ルティングセメントシステム;ヘッドピースの剥離を防ぐために重要</td></tr><tr><td>C&B メタボンド-クイック!セメントシステム "C" ユニバーサルTBB触媒 0.7 ml</td><td>パーケル</td><td>S371</td><td>手術用;接着剤 ルティングセメントシステム;ヘッドピースの剥離を防ぐために重要</td></tr><tr><td>C&B メタボンド-クイック!セメントシステム セラミックミキシングディッシュ 温度ストリップ付き</td><td>パーケル</td><td>S387</td><td>手術用; 接着剤 luting セメントシステム; ヘッドピースの剥離を防ぐために重要</td></tr><tr><td>スイスのピンセット、スタイル #5</td><td>世界の精密機器</td><td>504506</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ピューリタン コットンチップ アプリケーター</td><td>VWR インターナショナル</td><td>10806-005&nbsp;</td><td>手術用</td></tr><tr><td>歯科用コーキンググリップセメントキット</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>手術用;歯科用セメント</td></tr></tbody></table>

ヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

まばたきの条件付けは、学習と記憶の根底にある神経メカニズムを調査するための一般的なパラダイムです。細胞レベルでの学習と記憶を研究するために利用可能な科学的手法の広範なレパートリーをより有効に活用するには、安定した頭蓋プラットフォームを持つことが理想的です。マウスは拘束を容易には許容しないため、通常、チャンバー内を自由に動き回りながら訓練されます。条件刺激(CS)および無条件刺激(US)の情報が配信され、マウスの頭部に接続されたテザーを介してまばたき反応が記録されます。ここで紹介する頭部固定装置では、マウスは実験を容易にするために頭部を固定したまま、マウスを好きなように走らせることができます。このトレーニング装置では、まばたき反応の信頼性の高いコンディショニングが得られ、CSとしてのウィスカー刺激、USとしての眼窩周囲電気ショックの配信、まぶたからの筋電図(EMG)活動の分析によるまばたき反応の検出が可能になります。

8-10週齢の雄のC57Bl6 / Jマウスは、ヘッド固定された円筒状のトレッドミル装置上のトレース瞬目コンディショニングに訓練しました。 8匹のマウスがペアCS-USのプレゼンテーション（エアコングループ）と9マウスと訓練したが、不対CSおよび米国プレゼンテーション（pseudoconditioned基）で訓練しました。 馴化マウス由来の馴化応答の例EMG記録は、 図3及び4に示されています。各試験のための筋電図記録を整流し、10ミリ秒の時定数と統合された。 図5を整流し、統合されたEMG応答トレースは（A）の馴化とpseudoconditioned（B）マウスの両方のための10のセッションごとに、すべての試験にわたって平均を示しています。馴化応答の進化は、応答が近い米国の発症に大きくなって、 図5（a）に見られま...

ここで提示されている、頭部固定マウスのウィスカー信号によるまばたきコンディショニングのための調製物は、特定のウィスカを正確に刺激し、マウスが円筒形のトレッドミルで歩き回ることを可能にしています。ウィスカー刺激条件刺激(CS)と眼窩周囲衝撃無条件刺激(US)を組み合わせると、この装置で信頼性の高い連想学習が得られます。

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

本プロトコルの総合的な目的は、マウスにおける遺伝学的進歩と、我々のひげシステムに関する知見を利用して、学習と記憶を研究するための翻訳可能なパラダイムである眼瞼反射条件付けの神経生物学的基盤を調査することです。この手法では、条件付けの間に特定のひげを刺激しながら、遺伝子操作マウスを用いてカルシウムイメージングおよび電気生理学的な解析を行うことで、学習と記憶におけるメカニズム的な疑問への回答を得ることができます。本技術の主な利点は、円筒形トレッドミル上でマウスが自分のペースで歩行できるようにすることで、ストレスを最小限に抑えつつ、マウスの頭部を固定できる点にあります。この技術の意義は、加齢に伴う記憶障害やアルツハイマー病に関連する記憶障害などの治療法への応用にまで及びます。シリンダーおよびひげ刺激システムの準備については、それぞれテキストプロトコルで説明しています。本セクションでは、ヘッドピースの準備について説明します。ヘッドピースストリップは、すでに市販されていないAmphenol 221シリーズのナイロンストリップをモデルに3Dプリントした7穴ストリップです。3Dプリントしたパーツのストリップにある最初の穴に、0-80インチの機械ネジ用タップを立て、最初の穴の次の1穴は空けておきます。次に、バイスを使用して、残りの5つの穴に金メッキピンを5本挿入します。ピンをプラスチックの狭い穴に通します。次に、サーマルストリッパーを使用して、ポリイミドコーティングを0.5 cm剥離します。その後、ピンに開口部がある箇所のピンのいずれかに、剥離した端をはんだ付けします。はんだ付けしたワイヤーを6〜7 mmの長さに切り、末端を約2 mm剥いて絶縁被覆を取り除きます。この操作を繰り返し、5本のピンに計4本のワイヤーを取り付けます。最初の2本のワイヤーは眼瞼のEMG応答を記録し、残りの2本のワイヤーは眼窩周囲領域に電気刺激を与えます。5番目のピンに、電気的グランドとして使用する絶縁されていない5 cmのステンレス製ワイヤをはんだ付けします。すべての接続を完了した後、マルチメーターで各接続を確認し、電気的導通を確保してください。足指へのピンチ刺激で麻酔が完全にかかっていることを確認した動物で開始します。鎮痛剤として塩酸ブプレノルフィンを投与します。次に、少量の眼軟膏を角膜に塗布し、動物の頭頂部を剃毛します。続いて、動物の頭部を脳定位固定装置に固定し、ポビドンヨードとアルコールで交互に3回洗浄して頭皮を消毒します。10番または15番のメスを用いて、頭皮の正中線に沿って切開し、眼窩前方から頭頂骨の間を越えて頭蓋骨を露出させます。6つのマイクロクリップで皮膚フラップを牽引し、側面と後頭部を含め、可能な限り広く頭蓋骨を露出させます。次に、メスを使用して頭蓋骨から骨膜を掻き出します。次に、頭蓋骨の頂部を3%過酸化水素で3回洗浄します。頭蓋骨が乾燥したら、脳を傷つけないように注意しながら、34番の逆円錐形バーを用いて2つの穴をあけます。1つの穴はブレグマの前方に、もう1つの穴はラムダの前方（右眼を条件付ける場合は正中線の左側、逆の場合は右側）にあけます。これらの穴は、ネジが適切に適合するように慎重に穿孔し、脳を損傷させないよう細心の注意を払ってください。穴に電気接続用のネジを挿入します。ネジを1回転させるごとに0.28ミリメートルずつ深く入るため、2回転させれば十分です。次に、セメントの表面積を増やすために、頭蓋骨にいくつかの小さな窪みを作ります。完成したヘッドピースから、接地線を2本のネジの周りに8の字型に巻き付けます。ヘッドピースを適切に配置できるよう、接地線にはある程度の余裕を持たせてください。次に、コールドルーティングセメントを塗布します。頭蓋骨とネジにセメントをたっぷりと塗り、乾燥させます。セメントが乾燥したら、ピンが頭蓋骨の上に立つようにヘッドピースを垂直に配置します。ヘッドピースを、フレームのアームに取り付けられたホルダーで固定します。ホルダーには、ヘッドピースのピンを差し込むための金メッキソケットが5つ備わっている必要があります。2本のEMG電極線を、眼窩上の眼輪筋に配置します。次に、2本の刺激電極を配置します。被覆を剥いだ末端を、眼の直後方 2〜4 mm の皮膚下に挿入します。このとき、電極の末端同士が接触しないようにしてください。電線が長すぎて動物の眼を傷つける可能性がある場合は、切り詰めるか後ろに曲げてください。一部の裸線は露出させておく必要があります。次に、少量のルーティングセメントを使用して電線の基部を頭蓋骨に固定し、乾燥させます。以前に使用した量の約半分を使用します。次に、マイクロクリップを取り除き、皮膚を reposition します。皮膚に緊張が生じると眼蓋が歪んでまばたきが抑制され、実験が台無しになるため、皮膚が自然に落ち着くまで待ちます。皮膚が固定されたら、ヘッドピースホルダーを取り外し、露出した部分を歯科用セメントで封鎖します。セメントが眼やヘッドピースのピンに滴り落ちないように注意してください。その後、歯科用セメント溶剤で湿らせた綿棒を使用して、必要に応じて部分的に硬化したセメントを平滑に整えたり、調整したりします。セメントが完全に乾燥したら、動物を脳定位固定装置から取り外し、暖かい場所で回復させてからホームケージに戻します。少なくとも5日間の回復期間を設けた後、マウスの馴化を開始してください。マウスを固定するには、尾を短時間保持し、肩の後ろを軽くつまんで固定します。次に、マウスを腹部と胴体の下から持ち上げます。続いて、ヘッドピースにコネクターを取り付け、ロックねじを回します。その後、マウスを静かにシリンダーの上に置き、固定したまま、2本のねじを使用してコネクターをシリンダー上のバーに固定します。その後、マウスを放します。最初の2回のセッションでは、条件付けセッションと同じ時間、マウスをシリンダーに慣らしてください。馴化中に、自発的な瞬目率を記録します。また、電気刺激を与えずに、マウスをウィスカー振動刺激装置に慣れさせておきます。ピエゾシステムを条件付け側の近くに配置し、個々のウィスカーにコームの歯を滑り込ませます。セッションごとに同じウィスカーを選択してください。その後、本文に記載されている古典的条件付け訓練を行います。生後8〜10週のC57 Black 6J雄マウスを、頭部固定式円筒形トレッドミルを用いてトレース眼 blink 条件付けで訓練しました。各試行のEMG記録を採取しました。EMGは10ミリ秒の時定数で整流・積分され、その後すべての試行で平均化されました。10回のトレーニングセッションにおける条件反射の推移からは、徐々に反応振幅が増大し、反応潜時が短縮したことが示されました。このような推移は、刺激をランダムな順序で提示した擬似条件付けマウスの反応では見られませんでした。適切にタイミングが調整され、したがって十分に学習された条件反応の進化は、CS開始後の反応ピークまでの時間のヒストグラムからも確認できます。このビデオを視聴することで、頭部固定式まばたき条件付けのために、ヘッドピースの準備、マウスへのヘッドピースの外科的埋植、および円筒形トレッドミルへのマウスの設置方法を十分に理解できるはずです。条件付けが進むにつれて、マウスは日を追うごとに良好な学習曲線を示すはずです。この手法を習得し、適切に実施すれば、1時間で完了させることができます。本手順を行う際は、動物に苦痛が生じていないか細心の注意を払って観察することが重要です。動物へのストレスを最小限に抑えるため、適切な措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

このプロトコルは、ラットが学習と記憶の課題に従事している間に、離散的な脳領域でのニューロン活動を一時的および遠隔的に沈黙させる方法を説明しています。このアプローチは、薬理遺伝学(Designer-Receptors-Exclusively-Activate-by-Designer-Drugs)と、学習のさまざまな要素を区別するように設計された行動パラダイム(感覚プレコンディショニング)を組み合わせたものです。...

学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法

トレース瞬目反射条件づけ (ECC) を用いて評価したラット海馬依存学習投与早期新生児の脳の発達の中にアルコールの高濃度 (11.9 %v/v)。一般的には、ECC...

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

実験用マウスのための新しい改良戦略の開発は、3Rの原則を満たすための挑戦的な課題です。このプロトコルでは、実験用マウスの認知強化プログラムとしてクリッカートレーニングを導入しています。...

実験用マウスのための認知エンリッチメントとしてクリッカートレーニングの紹介

1 歳児の古典的な短い遅延瞬

ここで説明する新しい自動実験システムは、3チャンバーテストの代替を提供し、また、いくつかの注意事項を解決します。このシステムは、社会的嗜好および社会的新規性嗜好試験中に小さなげっ歯類の行動ダイナミクスの厳密な分析を可能にする複数の行動パラメータを提供する。...

小げっ歯類における社会的嗜好行動のダイナミクスを追跡するシステム

私たちは、2つの登山繊維依存連想学習タスク中の動物の行動を追跡するための単一のプラットフォームを開発しました。低コストの設計により、繊維関連小脳活動の登山に向けられた光遺伝学的またはイメージング実験との統合が可能になります。...

小脳依存感覚連想学習を監視するための柔軟なプラットフォーム

恐怖の文脈における飛行行動を研究するために、修正された恐怖条件付けプロトコルを導入します。このプロトコルは、マウスが恐怖条件付けにおける手がかりの提示中に一貫して飛行行動を示すことを保証します。...

マウスの飛翔行動を誘導するための修正された恐怖条件付け

観察的恐怖パラダイムは、げっ歯類の代理凍結を感情的共感のモデルとして評価します。この手順では、観察者のげっ歯類を同種のデモンストレーターにさらし、嫌悪感のある足のショックを受けて、共感的な凍結反応を引き出す必要があります。観察的恐怖アッセイを採用することにより、研究者は感情的共感の根底にある神経メカニズムを調査できます。...

マウスにおける感情的共感のモデルとしての観察的恐怖

このプロトコルは、神経生理学的測定へのタイムロックと互換性のある方法で、げっ歯類の自動眼斜視を経時的に追跡する方法を提供します。このプロトコールは、片頭痛などの疼痛障害のメカニズムを研究する研究者にとって有用であると期待されています。...

マウスの痛みの研究における時間同期行動と脳ダイナミクスのための自動斜視法

このプロトコルは、人間の黄斑に似た網膜の特徴を持つ錐体優性種である13ラインのジリスの光運動反応を測定する方法を説明しています。プラットフォームの設計により、ハンドリングが向上し、不安が軽減され、動物が高くなったプラットフォームにとどまる能力が向上し、視覚機能の変化を非侵襲的に評価できるようになります。...

ジリスの光運動反射の記録を可能にする非嫌悪動物拘束

学ぶヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件づけ法。円筒型トレッドミル上で歩行を許容しながら正確なヒゲ刺激を行い、学習と記憶の神経生物学的メカニズムを解明する。この手法は遺伝的操作マウスを用いて記憶障害治療の可能性を探る。

ヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件

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