ヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件

このプロトコルの全体的な目標は、マウスの遺伝的進歩とウィスカーシステムの理解を使用して、学習と記憶を研究するための翻訳可能なパラダイムであるまばたき条件付けの神経生物学的基礎を調査することです。この方法は、遺伝子操作マウスのカルシウムイメージングと電気生理学を使用し、コンディショニング中に特定のウィスカを刺激しながら、学習と記憶のメカニズムの質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、マウスが円筒形のトレッドミルで自分のペースで歩き回れるようにすることで、ストレスを最小限に抑えながらマウスの頭を固定できることです。

この技術の意味は、正常な老化やアルツハイマー病に関連するものを含む、記憶障害の潜在的な治療法にまで及びます。シリンダーの準備とウィスカー刺激システムは、それぞれテキストプロトコルでカバーされています。このセクションでは、ヘッドピースの準備について説明します。

ヘッドピースストリップは、商業的に製造されなくなったAmphenol 221シリーズのナイロンストリップをモデルにした3Dプリントされた7穴ストリップです。3Dプリントされたピースから、ストリップの最初の穴を0〜80インチずつタップし、最初の穴の後に1つの穴を空けます。次に、万力を使用して、残りの5つの穴に5つの金メッキピンを挿入します。

プラスチックの狭い穴にピンを押し込みます。次に、サーマルストリッパーを使用して、ポリイミドコーティングの半センチメートルを剥がします。次に、剥がした端をピンの開口部のあるピンの1つにはんだ付けします。

はんだ付けしたワイヤーを6〜7ミリメートルに切断し、ワイヤーの約2ミリメートルを剥がします。次に、このプロセスを繰り返して、合計4本のワイヤを5つのピンに取り付けます。最初の 2 本のワイヤーはまぶたの筋電図反応を記録し、2 本のワイヤーは眼窩周囲領域に電気刺激を送ります。

5 番目のピンには、絶縁されていない 5 センチメートルのステンレス鋼線をはんだ付けして、電気アースとして機能します。すべての接続を行った後、それぞれをマルチメーターでチェックして、電気的導通を確認します。つま先をつまむことで確認された、完全に麻酔をかけられた動物から始めます。

鎮痛剤として塩酸ブプレノルフィンを注射します。.次に、角膜に少量の眼科用軟膏を塗布し、動物の頭のてっぺんを剃ります。次に、動物の頭を定位固定フレームに固定し、ポビドンヨードとアルコールを交互に3回入れて頭皮を消毒します。

10番または15番のメスの刃で、頭皮の正中線に沿って切開を行い、頭蓋骨を目の前から頭頂間骨を過ぎて露出させます。6つのマイクロクリップで皮膚のフラップを引っ込め、側面と背中を含む頭蓋骨のできるだけ多くの露出にします。次に、メスを使って頭蓋骨から腹膜をこすり落とします。

次に、頭蓋骨の上部を3%過酸化水素で3回洗浄します。頭蓋骨が乾いたら、脳を傷つけないように注意しながら、サイズ34の逆円錐形バーで2つの穴を開けます。1つの穴をブレグマの前に配置し、もう1つの穴をラムダの前、右目を調整する場合は正中線の左側に配置し、またはその逆です。

これらの穴は、ネジに合うように慎重にドリルで開け、脳に損傷を与えないように多大な努力を払う必要があります。穴に、電気接続用のネジを取り付けます。全回転するごとにネジが0.28mm下がるので、2回転で十分です。

次に、セメントの表面積を増やすために、頭蓋骨にいくつかの小さなくぼみを作成します。完成したヘッドピースから、アース線を2本のネジの周りに8の字に巻き付けます。ヘッドピースが適切に配置できるように、アース線にたるみを残してください。

次に、コールドルティングセメントを塗布します。頭蓋骨とネジをたっぷりとコーティングし、セメントを乾かします。セメントが乾いたら、ピンを頭蓋骨の上に立てて、ヘッドピースを垂直に置きます。

ヘッドピースをフレームからアームに取り付けられたホルダーで固定します。ホルダーには、ヘッドピースのピンを受け入れるために5つの金メッキソケットが必要です。2本のEMGワイヤーを眼窩の上の眼輪筋に配置します。

次に、2本の刺激的なワイヤーを配置します。剥がした端を皮の下に2〜4ミリメートル直接尾側に置きます。それらの端が互いに接触しないようにしてください。

ワイヤーが長すぎて動物の目を傷つける可能性がある場合は、ワイヤーを切り戻すか、後ろに曲げます。一部の裸線は露出したままにする必要があります。次に、ワイヤーの基部を頭蓋骨にセメントで固定し、もう少し溶融セメントで乾かします。

以前に使用した量の約半分を使用してください。続行するには、マイクロクリップを取り外し、スキンの位置を変更します。まぶたを歪め、まばたきを阻害し、実験を台無しにする皮膚の張力を防ぐために、皮膚が自然に落ち着くのを待ちます。

皮膚が落ち着いたら、ヘッドピースホルダーを取り外し、露出した部分を歯科用セメントで密封します。目やヘッドピースのピンにセメントを滴下しないでください。次に、歯科用セメント溶剤で湿らせた綿棒を使用して、必要に応じて部分的に硬化したセメントを滑らかにして操作します。

セメントが完全に乾いたら、動物を脳定位固定装置フレームから取り外し、暖かい表面で回復させてから、ホームケージに戻します。マウスの慣れは、少なくとも5日間の回復時間が経過した後に開始します。マウスを固定するには、マウスの尻尾を短く拘束して肩の後ろをつまみます。

次に、腹部と胴体の下からマウスを持ち上げます。次にヘッドピースにコネクターを取り付け、固定ネジを回します。次に、マウスをシリンダーにそっと置き、2本のネジを使用してコネクタをシリンダーの上のバーに固定しながら、マウスを静止させます。

次に、マウスを放します。最初の2つのセッションでは、マウスをコンディショニングセッションと同じ時間、シリンダーに慣れさせます。慣れている間、自発的なまばたき速度を記録します。

また、電気刺激を印加せずにマウスをウィスカー振動刺激装置に事前に曝露します。ピエゾシステムをコンディショニング側に近づけた状態で、コームの歯を個々のひげに滑り込ませます。すべてのセッションで同じひげを選択します。

次に、テキストに示されているように、古典的条件付けトレーニングに進みます。8週齢から10週齢の雄C57 Black 6Jマウスを、頭部固定式円筒形トレッドミルでトレースまばたきコンディショニングで訓練しました。各試験のEMG記録が取得されました。

EMGは修正され、10ミリ秒の時定数で統合され、その後、すべての試行で平均化されました。10回のトレーニングセッションで条件付けされた応答の進化は、応答の振幅が徐々に大きくなり、応答の待ち時間が短くなったことを示しています。この進化は、刺激がランダムな順序で提示される疑似条件マウスからの応答には見られません。

タイミングよく、したがってよく学習された条件付けされた応答の進化は、CS発症後の応答のピークまでの時間のヒストグラムにも見ることができます。このビデオを見た後、ヘッドピースの準備方法、マウスにヘッドピースを外科的に埋め込む方法、およびマウスを円筒形のトレッドミルに置いて頭に固定されたまばたきのコンディショニング方法についてよく理解できるはずです。あなたのマウスは、コンディショニングを獲得するにつれて、日をまたいで良好な学習曲線を示す必要があります。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了します。この手順を試みるときは、動物からの苦痛を観察するために警戒を怠らないことを覚えておくことが重要です。動物へのストレスを最小限に抑えるために、適切な措置を講じる必要があります。