Name: C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶC57BL/6マウスにおけるBM12誘導SLEモデルの構築と解析方法。T濾胞性ヘルパー細胞、胚中心B細胞、形質細胞をフローサイトメトリーで解析し、自己免疫疾患の病態解明と新規治療標的の探索に役立つ。

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この作業は、Lupus Research Institute、NCI助成金CA138617、NIDDK助成金DK090978、Charlotte Schmidlapp Award(E.M.J.へ)、およびAlbert J. Ryan Fellowship(J.K.へ)によって部分的に支援されました。シンシナティ小児病院医療センターのリウマチ科のResearch Flow Cytometry Coreが提供し、NIH AR-47363、NIH DK78392、NIH DK90971が一部支援してくれたことに感謝しています。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

BM12誘導モデルは、SLEの細胞および分子プロセスを研究するための比較的容易かつ効率的な方法です。自己抗原に対する養子移入CD4 T細胞の慢性的活性化は、ここで説明したように、フローサイトメトリーによって測定することができるTFH、GC B細胞および形質細胞の蓄積につながります。このモデルを使用して、将来の研究は、迅速かつ容易にSLEを有する患者において生じるものに似ていると、最終的に自己抗体の病理学的蓄積を支配する自己免疫胚中心プロセスにおける候補遺伝子および新規治療薬の役割を調べることができます。さらに、ここで説明したフローサイトメトリー分析は、以下を含む免疫グロブリンの開発を必要とする追加のマウスモデルを研究するために使用されるが、自己免疫、感染症、およびアレルギーに限定されないことができます。 ヒトの疾患のすべての動物モデルと同様に、このモデルは、その制限を有します。疾患develのスピードを考えますOPSとその大きさは、SLEの発症に関与する全ての遺伝子は、このモデルにおける病原性のために必要である可能性が高いではありません。データは遺伝的に改変されたレシピエントにお...

全身性エリテマトーデス（SLE）は、抗核抗体（ANA）の生産及び糸球体腎炎によって原型特徴複雑な自己免疫疾患です。多数の他の皮膚などの後遺症、心肺、および肝病変はいくつかの個体における疾患と関連しています。米国での有病率の推定値は、女性やマイノリティ3で特に高頻度で、150,000-1,500,000 1,2から、大きく異なります。 SLEの病因を識別することは困難であったが、それは全身性自己免疫で終わる様々な遺伝的及び環境的要因の相互作用から生じると考えられています。 多数の動物モデルは、疾患の発症と進行をもたらす因子を研究するために使用されてきました。 SLEのクラシックマウスモデルは、PなどNZWのF1モデルとそのNZM誘導体、MLR / LPR株、およびBXSB /のYaa株、および誘導系NZB Xを含む遺伝的素因のマウス系統を含み、ristaneおよび慢性移植片対宿主病（cGVHDの）モデル4。 GVHDモデルにおける自己抗体の産生の初期の報告では、F1の転送5に親のための様々なマウス系統またはハムスター株を使用- 8。ループス様疾患を研究するために使用されるより一般的な方法は、現在、DBA / 2親→（C57BL / 6×DBA / 2）F1を含み、BM12伝達モデルは、ここで説明します。各モデルは、独自の警告を持っていますが、それらは一般にヒトの疾患の臨床的特徴と相関機能の共通セットを共有しています。マウスモデルの中で最も頻繁に報告されたパラメータは、脾腫、リンパ節症、腎炎、ANAの生産、および細胞レベルで、T濾胞ヘルパー細胞（TFH）、胚中心（GC）B細胞および形質細胞の増殖が含まれます。 H2 - - Ab1のBM12 / KhEgJ（BM12）マウス、系統iは、誘導性BM12モデルは、IA BM12 B6（C）からのリンパ球の養子移入することによって達成されますIA bはC57BL / 6（B6）マウスに、MHCクラスII上の3個のアミノ酸置換を除いて、C57BL / 6にdentical。受信者APCによるドナーCD4 T細胞のAlloactivati​​onは密接にSLEに似た症状をcGVHDのにつながります。具体的には、これらはドナー由来TFH、レシピエント由来のGCのB細胞および形質細胞の増殖、及び抗dsDNA、抗ssDNAを、抗クロマチン、及び抗RBC抗体9を含むアナスの生産の拡大を含みます。時間が経つにつれて、レシピエントマウスは、糸球体、間質中のIgG沈着、腎臓10の血管領域に関連する糸球体腎炎を発症します。我々は最近、ヒト疾患と同様に、私はこのモデル11で型IFNの重要な役割もある、ということを示しています。注目すべきは、人間SLEの定義基準は、このマウスモデルの顕著な特徴であり、どちらも抗dsDNA抗体12の存在下で、SLEと互換性腎炎の開発が含まれています。 SEがあります自発的なモデルの上にBM12モデルのveral利点。 SLEのような兆候を開発するクラシックモデルは、自然にノックアウトするために交差またはその他の遺伝的に改変されたマウスは難しく、時間がかかる行うハイブリッドマウス系統、近交系マウス系統ではないB6の背景に、またはB6の背景に大きな遺伝子座のいずれかに依存しています。 BM12誘導モデルでは、遺伝的に改変されたマウスは、特定の遺伝子が疾患のために重要であり得る、細胞コンパートメントのより迅速な同定を可能にする、ドナーまたはレシピエントのいずれかとして機能することができます。また、BM12モデルにおける疾患の発生は、ほとんどの自発的なモデルのために数ヶ月に比べ、アナスの出現まで、わずか2週間を必要とする、はるかに高速です。また、異なる時点で疾患を発症する自発的なモデルとは対照的に、BM12ー→B6モデルにおける疾患の発症および進行は非常に同期化されます。これは、bのできる適切なサイズのコホートの生成を可能にしますeは、疾患の発生の任意の段階で介入または治療戦略のために使用されます。 以下は、B6の背景に、C57BL / 6マウスにBM12リンパ球の養子移入、または遺伝的変異によって、SLEのような自己免疫を開始するための詳細なプロトコルです。さらに、我々はTFH、GC B細胞、およびヒト疾患に関連する形質細胞 - 細胞タイプを列挙するためのフローサイトメトリー染色プロトコルを記述する。重要なことは、これらのプロトコルはまた、SLEのほとんどのマウスモデルにおける疾患を特徴付ける、および他の疾患モデルでTFH、GC B細胞および形質細胞を同定するために使用され得ます。

<table><tbody><tr><td>B6です。SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ</td><td>ジャクソン研究所</td><td>001162</td><td>CD45.1+ BoyJ マウス B6</td></tr><tr><td>(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ</td><td>ジャクソン研究所</td><td>001162</td><td>Bm12 マウス</td></tr><tr><td>FastDigest PsuI</td><td>Life Technologies</td><td>FD1554</td><td>ジェノタイピング用制限消化酵素</td></tr><tr><td>1X RBC Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>血漿分離チューブ (PST)</td><td>BD</td><td>365974</td><td>採血チューブ EDTAジカリウム</td></tr><tr><td>血清分離チューブ (SST)</td><td>BD</td><td>365967</td><td>血栓活性化剤付き採血チューブ / SST ゲル</td></tr><tr><td>フィコール</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td>高密度細胞分離ソリューション</td></tr><tr><td>Lympholyte-M</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td>高密度<td>細胞分離溶液</td></tr><tr><td>GL-7-ビオチン</td>eBioscience13-5902-82<td></td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-BUV395</td><td>BD</td><td>564176</td><td></td></tr><tr><td>CD138-BV421</td><td>BioLegend</td><td>142508</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV510</td><td>BioLegend</td><td>100559</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta;-BV605</td><td>BD</td><td>562840</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-BV711</td><td>BioLegend</td><td>110739</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-FITC</td><td>BioLegend</td><td>109806</td><td></td></tr><tr><td>PD-1-PE</td><td>BioLegend</td><td>135206</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>115532</td><td></td></tr><tr><td>Fas-PE-Cy7</td><td>BD</td><td>557653</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-APC</td><td>BioLegend</td><td>145506</td><td></td></tr><tr><td>固定可能な生存率色素 ef780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>CD4-BV421</td><td>BioLegend</td><td>100443</td><td></td></tr><tr><td>1.2 ml FACS チューブインサート、ラックされた</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1412-1400</td><td></td></tr><tr><td>BDファルコン&トレード;丸底チューブ</td><td>BD</td><td>352017</td><td></td></tr></tbody></table>

c57bl / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（sle）のbm12誘導モデル

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

全身性エリテマトーデス(SLE)は、多様な臨床的および免疫学的症状を伴う自己免疫疾患です。いくつかの自発的で誘導可能な動物モデルは、bm12トランスファーモデルを含む、ヒト疾患の一般的な要素を反映しています。bm12脾細胞または精製CD4 T細胞を移植すると、C57BL/6マウスは、T濾胞性ヘルパー細胞(Tfh)、胚中心(GC)B細胞、および形質細胞を高頻度で急速に発達させ、続いて高レベルの循環抗核抗体を産生します。このモデルは純粋なC57BL/6バックグラウンドのマウスを使用しているため、研究者は比較的短期間でトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウス系統の疾患進行を迅速かつ容易に研究できます。ここでは、モデルの誘導と、マルチカラーフローサイトメトリーによるTfh、GC B細胞、および形質細胞の定量のためのプロトコルについて説明します。重要なことに、これらのプロトコルは、SLEのほとんどのマウスモデルで疾患を特徴付け、他の疾患モデルでTfh、GC B細胞、および形質細胞を同定するためにも使用できます。

罹患マウスは、質量および細胞性（ 図2）の面で健康なマウスの脾臓2-3倍のサイズを示す、わずか14日間で脾腫を開発しています。 脾細胞を順次光散乱（SSC-AによるFSC-A）にゲートされ、ダブレット（FSC-AによるFSC-Wまたは-H）、生細胞（生存性染料の低い染色）、 および CD4 +TCRβ+（ 図の排除図3（a））。ドナー細胞は、CD45.1およびCD45.2（ 図3B、左下）に基づいて、レシピエント細胞から区別されます。 PD-1、CXCR5、のBcl-6、およびICOS（ 図3B、C）のアップレギュレーションにより特徴付けられるドナー細胞は、主に、T濾胞ヘルパー（TFH）細胞表現型を採用します。レシピエントCD4 T細胞集団の一部はまた、TFH（ 図3B、右下）に分化します。導入細胞の初期ダイ・オフおよび/または移行後に、...

bm12リンパ球のC57BL/6レシピエントへの移植は、全身性エリテマトーデスの確立されたモデルです。ここでは、このモデルを使用して疾患を開始する方法と、フローサイトメトリーによってT濾胞ヘルパー細胞、胚中心B細胞、および形質細胞を特徴付ける方法について説明します。

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

本プロトコルの全体的な目的は、全身性エリテマトーデス（SLE）のBM 12モデルにおいて、フローサイトメトリーを用いてT follicular helper細胞、胚中心B細胞、および形質細胞の増殖を特性解析することです。この手法は、特定の分子経路を治療薬で標的にすることが疾患の進行を停止または遅延させ得るかなど、ループス研究における重要な疑問への回答に寄与します。このSLEモデルの主な利点は、純粋なC57BL/6背景のマウスを利用していることであり、これにより研究者は、トランスジェニックまたはノックアウトマウス系統における疾患進行を、比較的短期間で迅速かつ容易に研究することが可能です。BM 12ドナー細胞を単離してマウスに注入し、プロトコルに従って生着効率を決定してマウスを安楽死させた後、手術用ハサミを用いてマウスの腹部に70% ethanolを軽くスプレーして湿らせます。生殖器から約1 cm上の位置に小さく浅い切開を入れ、腹膜筋膜を保持したまま、腹部の皮膚を胸骨方向へ引き寄せます。18ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用い、針を動物の頭部方向へ向け、筋膜の平面に対して15度の角度を付けて挿入します。腹部の右下腹腔に針を挿入します。腹水を吸引する際に、腸管によって針が詰まるのを防ぐため、盲腸の先端付近に針を配置してください。次に、マウスを注意深く横向きに回転させます。その後、ゆっくりと腹水をシリンジに吸引します。腹水を回収したら、シリンジを移動させ、側面の目盛りから吸引量を記録します。腹水を5 mLの丸底チューブに排出し、後の血液採取処理のために氷上で保存します。既報の手法に従い、大静脈または下大静脈（IVC）から採血します。ピンセットを用いて、マウスの腸をゆっくりと左側に寄せ、IVCを露出させます。1 mLシリンジに取り付けた27.5ゲージの針をIVCに刺入し、溶血を最小限に抑えるため、400〜500 µLの血液をゆっくりと採取します。追加の関連組織を採取するため、0.5 mLマイクロ遠心チューブ、血清または血漿採取チューブに血液をゆっくりと注入します。腸を動物の右側へ静かに戻し、膵臓を牽引して脾臓を取り出します。膵臓組織や脾リンパ節が残っている場合は、それらを除去します。その後、解剖直後に高精度天秤を用いて脾臓の重量を測定します。脾腫は一般的に報告されるパラメータであるためです。SLEのマウスモデルでは、リンパ組織を1 mLの完全培地を満たし氷上に置いた個別の1.5 mLチューブに入れます。採取後2時間以内に、血液を10,000 ×g、4 °Cで3分間遠心分離します。血清を除去し、凍結融解サイクルを最小限にするため、1本あたり10〜20 µLずつ分注します。後でELISAを用いてNAを解析するため、-80 °Cで保存します。次に、腹水を400 ×gで

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このビデオでは、SJLマウスとどのように病理組織学的にその重症度を評価するために自己免​​疫性下垂体炎を誘導する方法を示しています。...

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が免疫細胞の浸潤を抑制した結果として中枢神経系の防御を示すか、または免疫細胞の浸潤の猛攻撃中に神経保護的であるかを決定する方法を説明しています。...

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN...

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

ここでは、C57BLにおけるブレオマイシンの気管内注射による肺損傷の誘導後に臍帯全体から得られた静脈内注入ヒト間葉間質間質細胞の抗線維活性を調べるための有効な方法を提示する。/6マウス。このプロトコルは、他の治療薬の前臨床試験に容易に拡張することができる。...

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

本プロトコールは、マウスにおけるループス進行を追跡する方法を記載する。腎臓における細胞浸潤およびタンパク質沈着に基づいて狼瘡腎炎を特徴付けるために、2つの追加の手順が提示される。...

狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

ここでは、SKGマウスからのCD4+...

マウスにおける関節リウマチの養子移植モデル

学ぶC57BL/6マウスにおけるBM12誘導SLEモデルの構築と解析方法。T濾胞性ヘルパー細胞、胚中心B細胞、形質細胞をフローサイトメトリーで解析し、自己免疫疾患の病態解明と新規治療標的の探索に役立つ。

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

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