2.11: 運命のマッピング

発生生物学者は、生物が成熟する過程で細胞系譜を追跡するためのツールとして、運命マッピングを使用しています。これは、胚の段階で細胞を標識し、その後、生物の発生を通じて細胞とその子孫を追跡することによって行われます。運命マッピングは、発生中の細胞の移動と分化、および成人期の再生と修復の研究にも使用されます。

このビデオでは、フェイトマッピングの概要、ゼブラフィッシュのフェイトマップの生成に使用されるプロトコルの説明、およびこの手法が現在ラボでどのように適用されているかを示します。

手順の詳細に入る前に、運命マップとは何か、そしてそれがどのように構築されるのかについて説明しましょう。

古典的な運命マッピング実験では、科学者たちは、原腸期などの初期胚の細胞群を、これらの細胞のすべての子孫に受け継がれる色素で染色しました。胚を一定期間発生させた後、彼らはより成熟した生物の染色された細胞を観察しました。次に、成熟した生物の染色された細胞の位置が記録されました。いくつかの同様の実験の結果をプールすることで、運命マップとして知られる図を構築することができました。

したがって、運命マップは、初期胚の各部分の運命を概説する全体的な計画です。これらのマップは、科学者がどの胚細胞がどの機能的な成体細胞に分化するか、それらがどのように移動して成熟した構造に組織化するかなどを決定するのに役立ちます。

科学者たちは、カエル、線虫、魚、ヒヨコ、ネズミなど、多くのモデル生物を使用して運命マップを作成してきました。ゼブラフィッシュのDanio rerioなどの一部のモデル生物は、このタイプの実験で追加の利点があります。それらは小さく、発生過程の大部分で透明なままであるため、科学者は光学顕微鏡で魚を見ることで細胞を簡単に追跡できます。重要なことは、細胞標識技術の進歩により、科学者は単一の細胞を正確にマークし、生物の成長に合わせてそれらを追跡できるようになったため、非常に詳細な運命マップの作成に役立っています。

運命マップとは何かがわかったところで、光活性化を利用したゼブラフィッシュの運命マッピングのプロトコルについて説明しましょう。この比較的新しいアプローチは、光活性化可能なタンパク質に依存しています。これらは特殊な蛍光タンパク質であり、「ケージド」、つまり蛍光を防ぐために特定のコンフォメーションに保持されています。制御されたレーザーパルスを印加すると、「アンケージング」と呼ばれるコンフォメーション変化が起こり、その結果、目に見える蛍光が発せられます。

この実験を行うために、これらの特殊なケージタンパク質を最初に合成し、次に1つまたは2つの細胞段階のゼブラフィッシュ胚に注入します。次に、胚を光活性化に先立って所望の発達段階まで成熟させる。

次に、魚の光活性化を準備するために、胚を解角化して標的組織にアクセスできるようにします。次に、低融点アガロースなどの光学的に透明な媒体に取り付けて、安全に定常位置に保持します。サンプルは、対象領域を露出するように整列させ、レーザー搭載顕微鏡に取り付けます。目的の細胞を含む標的領域にレーザーパルスを印加し、光活性化を誘導します。

レーザー治療後、胚は慎重にアガロースから取り出され、目的の発生段階に達するまで自然環境に戻されます。光活性化細胞を追跡するために、胚を再び低融点アガロースに包埋し、光活性化細胞を直接蛍光または免疫染色を用いて可視化し、追跡することができます。

運命マッピングプロトコルの全体的な理解ができたところで、この手順を利用したいくつかのラボ実験を見てみましょう。

胚発生の研究に加えて、運命マッピングは成熟したシステムの修復を調べるために使用できます。この実験では、トランスジェニックゼブラフィッシュ網膜から特定の細胞サブタイプをアブレーションしました。次に、科学者たちは、遺伝的に標識された常在する成体幹細胞を追跡して、損傷後の運命を決定しました。最後に画像解析を行ったところ、成体幹細胞の活性化とそれに続く組織修復が実証されました。

科学者たちは、移植された幹細胞の運命を理解するためにも同様のプロトコルを使用しています。ここでは、遺伝的にタグ付けされたヒト胚性幹細胞(hESC)を免疫不全マウスモデルに移植しました。移植された細胞を8〜12週間分化させた後、得られた奇形腫(複数の胚葉からの組織を含む腫瘍)を採取し、固定し、免疫染色して、移植された幹細胞の運命を決定しました。このタイプの実験は、科学者が培養幹細胞の生体内分化能力を確認するのに役立ちます。

前述のように、科学者は哺乳類を含むさまざまなモデル生物で運命マッピング手順を実行します。この特定の研究では、科学者たちは誘導遺伝学的アプローチを使用して、初期のマウス胚の特定の領域の細胞をマークしました。これは、遺伝子組み換え子孫を運ぶ妊娠中のマウスに誘導剤を投与することによって行われます。標識された細胞は、その後の発生段階を通じて追跡され、科学者が最終的な運命を決定するのに役立ちました。

JoVEのフェイトマッピングに関するビデオを見ました。このビデオでは、フェイトマップの作成に関する洞察を提供し、特定のフェイトマッピングプロトコルをレビューし、この非常に有用な手法の変更と適用のいくつかについて説明しました。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!