液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

この手順の全体的な目標は、メスカルチャネルを液滴界面、二重層システムに機能的に再構成し、これらのメカノ感受性チャネルの調和的な機械的刺激に対する応答を調べることです。この方法により、V 23 T mescal変異体の高調波機械的励起に対する応答における、層系による液滴界面への再構成後のメカノ電気的活動の研究が可能になります。この技術の主な利点は、パッチクランプ技術と液滴界面層法の両方の技術的利点を利用し、小型化する能力と膜の各側面の化学組成を制御する能力を利用することです。

リポソームを製剤化するには、凍結乾燥粉末として購入した20ミリグラムのD-P-H-P-C合成脂質に10ミリリットルの塩化カリウム緩衝液を添加することにより、1ミリリットルあたり2ミリグラムの脂質溶液を調製します。脂質ビヒクルと緩衝液の両方が十分に混合されていることを確認してください。混合物は、すべてが溶解すると均質でかすんで見えるはずです。

マイナス20°Cで凍結すると、新しい脂質混合物が完全に解凍され、加熱された環境ではなく室温で混合物が解凍されます。合計6回の凍結融解サイクルの後、市販の押出機を使用して、最初に0.4ミクロンのポリカーボネートメンブレンフィルターに全体の脂質懸濁液を強制し、次に0.1ミクロンのメンブレンフィルターに6回押し込みます。このプロセスにより、直径が100ナノメートル近くの粒子が得られます。

オイルリザーバーを製造するには、直径2インチ、長さ1.5センチメートルのアクリルシリンダーの壁に2つの対向する穴を開けます。穴は直径1ミリメートル、底から1センチメートルである必要があります。次に、前にドリルで開けた1ミリメートルの穴と同心円状の4ミリメートルの穴を2つ開けます。

穴の深さはそれぞれ1ミリメートルである必要があります。それらを完全にドリルで穴を開けないように注意してください。これらの穴は、ゴム製ガスケットに合うように作られています。

オイルが漏れないように、内径が1ミリメートルのゴム製ガスケットを2つ大きい穴に置き、接着します。次に、実験当日に多目的エポキシを使用して、10センチ×10センチの薄いアクリルシートに機械をシリンダーに接着し、直径2,250ミクロンの銀線を7センチメートルの長さに切断し、その先端を漂白剤に2時間浸します。塩化銀コーティングを形成するには、灰色は塩化銀コーティングが形成されたことを示します。

ガラスカッターを使用して、外径1ミリメートルと先端内径58ミリメートルの長さ10センチメートルのケイ酸塩ガラスキャピラリーを2つの5センチメートルのキャピラリーに分割します。18ゲージの鈍い先端針を備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、毛細血管にP-E-G-D-M-Aハイドロゲルを充填し、水和したヒドロゲルが毛細血管から膨潤するのを防ぎます。先端に3mmのクリアランスを保ち、キャピラリーに気泡がないことを確認してください。

銀、塩化銀電極をヒドロゲル充填キャピラリーに挿入します。P-E-G-D-M-Aハイドロゲルをフリーラジカル光重合により硬化させる 紫外線スポットを使用して1ワットで2分間紫外線にさらされると、実験はパッチアンプ上のグランド接続に接地されたファラデーケージの下に設定されます。マイクロピペットの1つを、オスコネクタ付きのストレートマイクロ電極ホルダーに取り付けます。

次に、マイクロ電極ホルダーをパッチアンプのヘッドステージに接続します。ヘッドステージをグランドにはんだに接続するには、18ゲージの絶縁銅線をヘッドステージ用の適切なコネクタに取り付け、最初にヘッドステージの取り付けプレートをマイクロマニピュレータに取り付けてから、ヘッドステージを取り付けプレートに接続することにより、ヘッドステージを3軸手動マイクロマニピュレータに取り付けます。適切なネジを使用して、2番目のマイクロピペットを実験室製のコネクタを介してリニアアクチュエータに取り付け、両方を2番目のマイクロマニピュレータに取り付けます。

マイクロピペットは、互いに対向し、整列し、水平に水平になっている必要があります。次に、ガラスバイアルに0.1ミリリットルのD-P-H-P-Cリポソームと0.01ミリリットルのV 23 Tメスカルプロテアリポソーム溶液を混合します。34ゲージのマイクロフィルニードルを使用して、両方のマイクロピペットの先端にプロテオソーム溶液を充填します。

リザーバーを正立顕微鏡の上に置き、反対側の1ミリメートルの穴にマイクロピペットを送ります。次に、リザーバーをヘキサデカンで表面まで満たし、マイクロピペットの先端に球状の液滴を形成します。直径10ミクロンのケイ酸ガラスマイクロピペットを3本目のマイクロマニピュレーターに取り付けて、マイクロピペットの先端に希釈したV 23 T メスカルプロテアリポソーム溶液を分注し、液滴を形成します。

必要に応じて体積を増減して液滴のサイズを制御し、単分子膜が完全に形成されるまで液滴を10分間休ませます。次に、液滴を層ごとに接触させます。形成は1〜2分以内に行われます。

テキストプロトコルで説明されているようにソフトウェアと機器を設定した後、BNCケーブルを使用して、波形発生器の出力を外部コマンド入力フロントスイッチに接続します。10ヘルツ、500ミリボルトのピークトペ三角形の波形をヘッドステージに送ります。マイクロメートルマニピュレーターを使用。

ガラスマイクロピペットを水平に動かして液滴を接触させ、液滴がわずかに接触するまで接触させ、二重層が薄くなるのを待ちます。二重層形成プロセスの進行は、顕微鏡を通して視覚的に確認でき、電流測定によって監視できます。アクチュエータに搭載された液滴の位置をマニピュレータで制御することで、二重膜サイズを直径約250ミクロンに調整し、顕微鏡で視覚的に二重膜サイズを推定することができます。

二重層が形成されて安定したら、関数発生器を使用して正弦波信号を送り、二重層に組み込まれたメスカルタンパク質を刺激して液滴を刺激します。175ミクロンのピークtoピーク振幅、0.2ヘルツの周波数、50%のデューティサイクルを持つ正弦波波形をPieto電気サーバーコントローラーに送信します。ここでは、非定型のリアルタイム電流記録を示します。

測定された二重膜の静電容量は突然増加し、定常状態に達する前に二重層が薄くなり、形成されることを示しています。二重膜は、DIBが機械的に刺激されたときに液滴の位置を変更することにより、膜を横切る一定のDC電位を維持しながら制御できます。メスカルのV 23 T変異体は、主に亜伝導状態や時折完全なオープニングイベントを含む信頼性の高い活動を生成します。

ゲーティングは主にピーク圧縮で発生し、極プロットに示されているように、二重層張力の増加に関連していることを示しています。ここでは、この手法を他の種類の生体分子の試験に使用できることを強調しています。電位依存性イオンチャネルであるEthinは、DC膜貫通電位Oneマスターの印加により膜透過性を向上させます。

この手法は、適切に実行すれば2時間で実行できます。この手順を試みるときは、誤ってガラスの毛細血管を壊さないように注意することが重要です。セットアップを最初からやり直し、開発後にすべてのワイヤーが接続されていることを確認する必要があります。

この技術は、伸張活性化チャネルの分野の研究者が、DIBに埋め込まれたメカニズムに敏感なチャネルのゲートに外力を伝達できる新しい方法を探求する道を開きました。このビデオを見れば、液滴界面を層ごとに形成する方法、人工膜に機械感受性チャネルを組み込む方法、そしてこれらのチャネルを機械的に刺激する方法を十分に理解できるはずです。