使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイシロイヌナズナシュードモナスシリン Pathosystem

この手順の全体的な目標は、最適化されたシリンジ浸潤アッセイを通じてシロイヌナズナの免疫応答を定量的に特徴付けることです。これは、最初に注射器の浸透を使用して、サダと呼ばれる自然の開口部から葉に細菌を手動で送達することによって達成されます。2番目のステップは、病気の症状が現れた後に感染した葉組織の椎間板を取得することです。

次に、バクテリアをハイスループットの均質化によって葉板から抽出します。最後のステップは、コロニーを列挙するための細菌計数プレートへの段階希釈とスポッティングです。最終的に、各葉のディス内の細菌の増殖は、植物の免疫応答の相対的な強さと相関させることができます。

この方法は、生物的ストレスに対する防御応答に寄与する遺伝子の特定など、植物免疫の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、感染した植物組織における病原体の成長を正確に定量化でき、さまざまな発生状態の葉のサンプリングによる実験エラーを回避できることです。この方法は、毒性のある細菌性病原体の感染に対する植物の免疫応答に関する洞察を得ることができ、また、サリチル酸や微生物が引き起こす分子パターンが引き起こす免疫応答などの他のシステムにも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、組織に損傷を与えることなく細菌を葉に送達するのに苦労します。次の手順を示すのは、ポスドク研究員のヒンドゥー教と大学院生のシャルとヤリです。私の研究室からすぐに、このビデオで病気の感受性を高めるためのアッセイがデモンストレーションされます。

実験に先立って、King's BまたはKB培地プレートを調製し、プロトコルテキストに記載されているように1リットルのKB固体培地を作り、磁気攪拌板で冷まします。メディアが80%グリセロールで触れるように冷却されると、1モルの硫酸マグネシウムとストレプトマイシンをメディアに注ぎ、2つの異なるサイズのKBメディアプレートを注ぎます。小さい方のペトリ皿は一次細菌培養プレートとして機能し、大きい方のペットシャーレは細菌計数プレートとして機能します。

プレートは、アッセイストリークの2日前に摂氏4度で保管してください。PSM ES 43 26.KB連鎖球菌培養プレート上のマイナス80°Cグリセロールストックからの細菌を、翌日28°Cで24〜48時間インキュベー

ストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む4ミリリットルの液体kb培地を含む滅菌試験管で液体培養を開始する。摂氏28度で250RPMを一晩振ってください。実験用のシロイヌナズナ植物は、液体細菌培養が開始されたのと同じ日に、プロトコルテキストに詳述されている条件下で栽培されます。

5番と6番の葉の花びらに鈍い防水マーカーで印を付けて、サンプリング時に感染組織を簡単に識別できるようにします。STAの開封を促進し、病原体溶液の葉水への侵入を容易にする。フラットを底から20分間浸すことで植物をよく

20分後、余分な水を排出します。シロイヌナズナ植物の感染が行われます。液体培養開始の翌日。

細菌培養物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、9, 600Gで2分間回転させます。室温で、上清を廃棄し、細菌ペレットを1ミリリットルの滅菌10ミリモル塩化マグネシウムで再懸濁し、50ミリリットルの遠心分離チューブで9ミリリットルの10ミリモル塩化マグネシウムで細菌懸濁液を希釈します。.バクテリアの光学密度を測定した後、バクテリアを10ミリモルの塩化マグネシウムで希釈し、最終的なOD600を0.0002にします。

EDS感染アッセイ用。一般にインスリン注射器として知られている1ミリリットルの鈍い端の針のない注射器は、浸潤に使用されます。浸透プロセス中のはるかに良い制御のために希釈された細菌の解決の0.5から0.6ミリリットルをシリンジに満たしなさい、シリンジを全容量に満たしないで下さい。

人差し指の上部にある葉の下面を露出させ、次に親指の助けを借りて、葉の位置をゆっくりと調整します。シリンジを葉の表面に対して垂直に配置して、圧力が均一に分散されるようにし、葉の損傷を減らします。浸潤中は中肋骨領域を避けるようにしてください。

プランジャーをゆっくりと押して、細菌溶液に浸透させます。葉肉への液体の侵入は、暗い葉の色で示されるように視覚化され、複数回の試行が必要な場合でも葉の表面全体に浸透します。浸潤が完了したら、吸収性組織で葉をやさしく拭き取り、余分な病原体溶液を取り除きます。

感染した葉の組織に損傷がないか目視検査します。浸潤した植物を1〜2時間乾燥させ、植物を元の成長状態に戻します。透明なドームに水をスプレーし、感染した植物を2時間覆います。

次に、ドームを割って2〜3インチの開口部を生成し、感染実験の残りの部分(通常は3日間)の間、それをオンのままにします。病原体の成長を定量化する1日前。150 mm x 15 mm KB のメディアプレートを乾燥させます。

プレートを室温で約24時間保持して乾燥させます。感受性遺伝子型の感染組織の黄変によって示される硬化症の出現後、壊死性病変の発症前に感染組織を処理します。遺伝子型ごとに、6本の粉砕チューブを準備します。

ステンレス製の研削ボールを1つ置き、500マイクロリットルの滅菌済み10ミリモル塩化マグネシウムを各チューブに加えます。次に、感染した葉を植物から取り除き、鉗子を使用して1穴のペーパーパンチで葉の円盤をランダムに打ち抜き、2つの異なる植物からの2つの葉の円盤を各粉砕チューブに入れます。チューブを密封し、ハイスループットホモジナイザーで組織を最大速度で10分間均質化します。

待機中に組織が十分に均質化され、感染した葉からのクロロフィルの放出により溶液が緑色に変わるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。均質化のために、96ウェル培養プレートの最初の6列の各ウェルに、10ミリモルの塩化マグネシウム180マイクロリットルを充填します。20マイクロリットルの粉砕組織懸濁液を96ウェルプレートの1列目の各ウェルに移し、液体を上下に繰り返しピペッティングして混合します。

組織の小さな破片が先端を詰まらせた場合は、2〜3ミリメートルクリップして溶液の正しい量を取得し、プレート上部の液滴が代替列に異なる遺伝子型の組織をスペースするのに十分なスペースを確保します。10倍の段階希釈液を調製するには、20マイクロリットルの組織懸濁液を2列目に移し、この手順を6回目の希釈まで繰り返します。分割されたピペットチップを使用して、96ウォールプレートから20マイクロリットルの溶液を150ミリメートル×15ミリメートルのKBプレートに移します。

最も希釈された懸濁液から最も濃縮された懸濁液まで作業するため、希釈間でピペットチップを交換する必要はありません。蓋にひびが入った状態でプレートを室温で乾かします。プレート表面に液体が観察されなくなったら、蓋を閉じて反転させ、プレートを室温でインキュベートします。

コロニーが見えるまでプレートを40〜60時間インキュベートします。プレート上のバクテリアが予測可能な10倍を反映していることを確認します。コロニー形成ユニットのドロップ。

バクテリアが増殖してコロニーが融合する前に、バクテリアを数えます。最も希釈度の低い細菌のうち、コロニーが重なっていない細菌の数を決定します。通常、カウントされる好ましい希釈は10〜50コロニーを含み、技術的な反復間で異なる場合があります。

細菌の増殖レベルを計算するには、この式を使用して、葉板あたりのコロニー形成単位の数を決定します(Rは行の数、Tは各テクニカルレプリケート内の細菌の数です)。その後、データを使用してグラフを作成します。各データポイントは、対数スケールで 6 回のテクニカルレプリケートの平均として表されます。

エアロバーは、平均増進疾患の95%信頼区間を表します。P-S-M-E-S 43 26 に対する感受性は、OD 600 が 0.0002 の接種物による感染によって評価されました。その結果、感受性の高いNPRのOne dash One変異体は、野生型のコロンビアゼロ植物と比較して、約2.5 logまたは300倍の病原体増殖を示すことが示されています。

シリンジ浸潤アッセイは、免疫応答のさまざまな層を評価するように変更することができます。サリチル酸誘発免疫を評価するために、サリチル酸ナトリウムの外部適用を使用して免疫応答を誘発し、病原体の増殖によって定量化されます。サリチル酸受容体として機能し、サリチル酸依存性標的遺伝子の主要な転写共制御として機能するNPR R oneの喪失は、サリチル酸誘導体の外因性適用に対する鈍感性につながります。

微生物に関連する分子パターントリガー免疫を特徴付けるために、植物は2つの既知のトリガーで前処理されました。FLAG 22およびL 18、FLAG 22で処理された野生型コロンビアゼロ植物は、細菌集団の1ログまたは10倍の削減をサポートしましたが、FLSの2つの突然変異植物は細菌増殖制限効果をトリガーできませんでした。同様に、EFR変異体植物はL18前処理に鈍感でした。

このビデオを見れば、シリンジ浸潤アッセイを通じてアラビア語のopsys免疫応答を定量化する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みるときは、病気の進行を監視し、コルシスの出現後に組織をサンプリングすることを覚えておくことが重要です。シュードモナ・パター・カル・コーラ S phos 3, 2 6は、半萎縮性病原体である。

したがって、サンプリングは神経栄養段階に移行する前に実施する必要があります。この手順に続いて、定量的リアルタイムPCRや西洋血液分析などの他の方法を実行して、どの特定の免疫シグナル伝達経路が乱されているかなどの追加の質問に答えることができます。生きたバクテリアを扱っていることを忘れないでください。

シュードモナセンゲはヒトに病原性はありませんが、この手順を実行する際には、汚染された消耗品や感染した植物を適切に廃棄することを忘れないでください。