使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ

本手順の目的は、最適化されたシリンジ浸潤アッセイを通じて、Arabidopsis dilianaの免疫応答を定量的に特性評価することです。まず、シリンジ浸潤を用いて、気孔と呼ばれる自然開口部から葉に細菌を手動で導入します。次に、病徴が現れた後、感染した葉組織のディスクを採取します。

次に、ハイスループット均質化によってリーフディスクから細菌を抽出します。最終ステップとして、連続希釈を行い、細菌計数プレートにスポットしてコロニー数を算出します。最終的に、各リーフディスク内での細菌の増殖を、植物免疫応答の相対的な強度と相関させることができます。

この手法は、生物的ストレスに対する防御応答に寄与する遺伝子の同定など、植物免疫分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。既存の手法に対する本技術の主な利点は、感染した植物組織内における病原菌の増殖を正確に定量できることであり、葉の発達段階のばらつきに起因する実験誤差を回避できる点にあります。本手法は、強毒性細菌病原菌の感染に対する植物の免疫応答に関する知見を提供できるほか、サリチル酸や微生物関連分子パターン（MAMP）によって誘発される免疫応答などの他の系にも適用可能です。

一般的に、この手法に慣れていない人は、組織を損傷させることなく葉に細菌を導入することに苦労します。以下の手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の博士研究員であるHindu、および大学院生のshaluとyaliです。このビデオでは、疾患感受性亢進アッセイについて実演します。

実験に先立ち、King's B（KB）培地プレートを準備します。プロトコルの本文に従って1LのKB固体培地を作成し、マグネチックスターラー上で冷却させます。培地が触れても問題ない温度まで冷却されたら、80% glycerol、1 M magnesium sulfate、およびstreptomycinを培地に加えます。その後、2種類のサイズのKB培地プレートに分注します。小さい方のペトリ皿は一次細菌培養プレートとして使用し、大きい方のペトリ皿は細菌計数プレートとして使用します。

アッセイのストリークを行う2日前までに、プレートを4 °Cで保存します。PSM ES 43 26を用います。-80 °CのグリセロールストックからKBストリーク細菌培養プレートに細菌を接種し、翌日に28 °Cで24〜48時間インキュベートします。

ストレプトマイシンを50 µg/mL含む液体kb培地4 mLを用いて、滅菌試験管内で液体培養を開始します。28 °Cで250 RPMにて一晩振とうします。実験に用いるArabidopsisの個体は、液体細菌培養を開始したと同日に、プロトコル本文に記載された条件で栽培します。

サンプリング時に感染組織を容易に特定できるよう、5番目と6番目の葉の花弁に、水に強い太字のマーカーで印を付けます。STAの開口を促進し、病原体溶液が葉の水管に入りやすくするため、プランターの底から20分間浸水させて植物を十分に吸水させます。

20分後、余分な水を排出します。これにより、シロイヌナズナの感染処理が完了します。これは液体培養を開始した翌日に行います。

細菌培養液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、9,600 Gで2分間遠心分離します。室温で上清を捨て、1 mLの滅菌済み10 mM塩化マグネシウムで細菌ペレットを再懸濁します。50 mL遠心チューブ内で、細菌懸濁液を9 mLの10 mM塩化マグネシウムで希釈します。細菌の光学密度を測定した後、10 mM塩化マグネシウムを用いて、最終的なOD 600が0.0002になるように細菌を希釈します。

EDS感染アッセイについて。浸潤には、一般にインスリン注射器として知られている1 mLの鈍端針なしシリンジを使用します。浸潤プロセス中の制御を向上させるため、シリンジには希釈した細菌液を0.5〜0.6 mL充填してください。シリンジを容量いっぱいまで満たさないようにしてください。

人差し指の先に葉の裏面をのせ、親指を使って葉の位置を軽く調整します。葉へのダメージを軽減し圧力を均等に分散させるため、シリンジを葉の表面に対して垂直に当てます。浸潤させる際は、中肋（主脈）付近を避けるようにしてください。

プランジャーをゆっくりと押し込み、細菌溶液を浸潤させます。葉の葉肉に液体が入ると、葉の色が濃くなることで確認できます。複数回の手順が必要な場合でも、葉の全表面に浸潤させてください。浸潤が完了したら、吸水性の組織（ティッシュなど）で葉を軽く押さえ、余分な病原菌溶液を取り除きます。

感染した葉の組織に損傷がないか目視で確認します。浸潤させた植物を1〜2時間乾燥させた後、元の育成条件に戻します。透明なドームの内側に水をスプレーし、感染させた植物を2時間覆っておきます。

次に、ドームにひびを入れて2〜3インチの開口部を作り、通常3日間行われる感染実験の残りの期間中、そのままにしておきます。病原体の増殖量を定量化する1日前に、150 mm × 15 mmのKB培地プレートを前もって乾燥させておきます。

プレートを室温で約24時間放置して乾燥させます。感受性遺伝子型において、感染組織の黄変によって示される硬化症（sclerosis）が出現した後、かつ壊死病変が形成される前に、感染組織を処理します。各遺伝子型につき、6本の研磨管を準備します。

各チューブにステンレス製研磨ボールを1個入れ、滅菌済みの10 millimolar 塩化マグネシウムを500 microliters加えます。次に、感染した葉を植物から切り離し、ピンセットを用いて1穴のパンチで葉ディスクをランダムに打ち抜きます。2本の異なる植物から採取した2枚の葉ディスクを各研磨チューブに入れます。チューブを密閉し、ハイスループットホモジナイザーを使用して最大速度で10分間組織を均質化します。

組織が十分に均質化され、待機中に感染した葉からクロロフィルが放出されて溶液が緑色に変わるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。均質化のために、96ウェル培養プレートの最初の6行の各ウェルに、10 millimolar 塩化マグネシウムを 180 microliters ずつ満たします。すり潰した組織懸濁液 20 microliters を96ウェルプレートの最初の行の各ウェルに移し、液体を繰り返しピペッティングして混合します。

組織の小さな断片でチップが詰まった場合は、先端を2〜3 mmカットして、溶液の正確な量を採取できるようにしてください。プレート上部の液滴に十分なスペースを確保するため、異なる遺伝子型の組織を互い違いの行に配置します。10倍段階希釈を調製するには、組織懸濁液 20 µL を2行目に移し、この操作を6回目の希釈まで繰り返します。分注用ピペットチップを使用して、96ウェルプレートから 20 µL の溶液を 150 mm × 15 mm の KB プレートに移します。

希釈液の交換時にピペットチップを替える必要がないよう、最も低濃度の懸濁液から最も高濃度の懸濁液の順に作業してください。プレートの蓋を少し開けた状態で、室温で乾燥させます。プレート表面に液体が見られなくなったら、蓋を閉じてプレートを倒置し、室温でインキュベートしてください。

コロニーが目視で確認できるまで、プレートを40～60時間インキュベートします。プレート上の細菌が、予測通り10倍ずつ減少していることを確認してください。

細菌が過剰に増殖してコロニーが融合する前にカウントします。コロニーが重なり合っていない最も低い希釈倍率における細菌数を決定してください。通常、カウントに最適な希釈倍率は10から50個のコロニーを含むものであり、テクニカルレプリケート間で異なる場合があります。

細菌の増殖レベルを算出するために、以下の式を用いてリーフディスクあたりのコロニー形成単位数を決定します。ここで、Rは行数、Tは各テクニカルレプリケート内の細菌数です。その後、このデータを用いてグラフを作成します。各データポイントは、6つのテクニカルレプリケートの平均値を対数スケールで表示したものとして表されます。

エラーバーは、病害進展の平均値における95%信頼区間を示しています。P-S-M-E-S 43 26に対する感受性は、OD 600が0.0002の接種源を用いて接種し評価しました。その結果、高感受性のNPR 1-1変異体では、野生型Columbia 0植物と比較して、病原菌の増殖量が約2.5 log（300倍）高いことが示されました。

シリンジ浸潤アッセイは、免疫応答の異なる層を評価するために修正することが可能です。サリチル酸誘発免疫を評価するには、サリシン酸ナトリウムを外部から投与して免疫応答を誘発し、病原体の増殖量によってそれを定量化します。サリチル酸受容体およびサリチル酸依存的標的遺伝子の主要な転写共調節因子として機能するNPR1の欠損は、外来的に投与されたサリチル酸誘導体に対する不感症を引き起こします。

微生物関連分子パターン（MAMP）誘発免疫を特性解析するため、植物を2種類の既知のトリガーで前処理した。FLAG 22およびL 18を用いたところ、FLAG 22で前処理した野生型Columbia 0植物では細菌数が1 log（10倍）減少したが、FLS2変異体植物では細菌増殖抑制効果が誘発されなかった。同様に、EFR変異体植物はL 18前処理に対して不感受性であった。

このビデオを視聴することで、シリンジ浸潤アッセイを用いてアラビックopsysの免疫応答を定量化する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、病気の進行をモニタリングし、corsisが出現した後に組織をサンプリングすることが重要です。pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6は半栄養的病原体です。

したがって、サンプリングは神経栄養段階に移行する前に行う必要があります。この手順の後、定量リアルタイムPCRやウェスタンブロット解析などの他の手法を実施することで、具体的にどの免疫シグナル伝達経路が乱れているかといった追加の疑問に答えることができます。生きた細菌を扱っていることに留意してください。

Pseudomona Sengeはヒトに対する病原性はありませんが、本手順を実施する際は、汚染された消耗品および感染した植物を適切に廃棄してください。