Name: マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶ角膜上皮幹細胞の系譜トレース法。R26R-Confettiマウスとマルチカラー蛍光レポーターを用いて、角膜細胞の移動・拡張・生存を追跡し、組織修復と再生医療のメカニズム解明に貢献します。

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RSFは、欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）の助成金契約n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem、およびイスラエル科学財団（218/14）から資金提供を受けています。

倫理声明は、本研究の動物のケアと使用時には眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しました。全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されました。 1.適したCreリコンビナーゼを発現するマウス系統を選択してください<ol><li>購入26、調査対象の標的組織に依存ために利用可能なのCreトランスジェニック株の多種多様のうち、Creリコンビナーゼ遺伝子が目的の組織に特異的なプロモーターによって制御されるのCreトランスジェニックマウス系統を選択します。ケースでは時間的な制御が必要とされ、誘導性のCreラインを選択します。 注意：我々は、具体的には24角膜縁と角膜上皮幹/前駆細胞を標識するタモキシフェン誘導K14-CreをERT導入遺伝子を選択しました。ディジローラモと同僚が自分のK1のためのない角膜輪部式で特異性を報告したように、菌株間の違いがあるかもしれないことに注意してください4-CreをERT 22。誘導可能なトランスジェニックCreマウスを使用する利点は、多用途の時間枠でのトレース系統の誘導を可能にすることです。 </li></ol> 2.適当なBrのマウス系統を選択してください<ol><li>研究課題と利用できるのCreライン16,18,20に応じて適切なBrのカセットを選択してください。 <ol><li>非誘導のCreマウス系統を使用する場合は、連続したDNA反転/切除を可能にするため、16（例えばBr1.0またはBr1.1用）デッドエンド製品を生じないBrのカセットを選択します。 </li></ol></li></ol> 3.金利のクロストランスジェニック系統<ol><li>ここに示されているプロトコルでは、ヘミ接合子孫を得るために、ホモ接合性のCre ERT株 （CRE ERT / CreをERT）とホモ接合R26R-紙吹雪株（Br2.1 / Br2.1）を横切る（Br2.1 / +;のCre / +）モノ対立遺伝子、それらすべてが単一のBr2.1対立遺伝子を含むので、トレース系統との準備ができていること単一のCre対立。 注：1は、2つのCre対立遺伝子（Br2.1 / +;のCre / Creを）が含まれているマウスを作製することができ、標識の効率を向上させるために、しばらく2 Br2.1対立遺伝子（Br2.1 / Br2.1;のCre / +）だろう（22で詳述）色の組み合わせを増やします。 </li></ol> 4.のCreリコンビナーゼ誘導注：これらの実験におけるタモキシフェンの投与は角膜縁と角膜の基礎のK14陽性幹細胞/前駆細胞の核内にCreをERTリコンビナーゼの転位を誘導するために、3〜4日の期間、毎日腹腔内注射することにより行いました上皮細胞。以下のプロトコルは、4匹のマウスの注射のために使用することができます。また、眼表面へのタモキシフェンの局所適用は、より高い効率が得られます。タモキシフェン溶液は、1週間まで4℃で暗所に保管することができます。使用前の溶液を温め。 <ol><li>タモキシフェン100mgを秤量し、コーン油を5mlにそれを溶解します20 mg / mlのタモキシフェン溶液を形成します。 </li><li> 3-4日間連続して8週齢のマウスの腹腔内にタモキシフェン（4 mg）を溶液200μlを注入します。 注：タモキシフェン溶液を1週間まで4℃で暗所に保管することができます。使用前の溶液を温め。 </li><li>局所適用のためにタモキシフェンの60ミリグラムを秤量し、60 mg / mlのタモキシフェン溶液を形成するコーン油1ml中に溶解します。 65に維持振盪水浴中の溶液をボルテックスし、設定 それは使用するまで浴にそれを残す透明になるまでC°。 <ol><li>マウスの各眼表面にタモキシフェン溶液100μlを慎重に適用されます。 </li></ol></li></ol>イメージング5.組織調製<ol><li>タモキシフェン注射とCOL後の適切な時点でのCO 2吸入が続くイソフルラン（酸素中で気化2％）麻酔を（反射の欠如によって適切な麻酔を確認する）を使用して、犠牲の動物関連する組織をLECT。 <ol><li>これらの実験のために、次の時点で目を摘出：1、4、8、12、及び16週間後のタモキシフェン注射。曲がったピンセットを使用して摘出を実現。眼球が眼窩から飛び出すせるまぶたを押します。視神経を保持している眼球の後ろに鉗子を置きます。静かに眼球を引き、それを取り外します。 注：以下に述べるように、この段階では、組織は、標識された細胞のホールマウント分析のために調製することができます。正規の凍結組織切片は、（セクション6および22を参照）、調製PFAで固定し、下記のように画像化することができます。 </li></ol></li><li> PBSで満たされた60ミリメートル皿にそれぞれの目を配置します。 </li><li>ステレオ顕微鏡下で使用して鉗子は、角膜を下に向けて視神経の近くに目を保持し、視神経、筋肉や結合組織を除去し、眼の後方部分に小さな切開を作るためにメスを使用しています。 </li><li>春のはさみを使用して、慎重に拡大しますレンズが飛び出すとピンセットを用いて、虹彩を削除させるカット。 </li><li>メスを用いて周辺に向かって中心から始まる4-5放射状の切開を行うことで、角膜を平らに。 </li><li>角膜輪部を超えて過剰周辺組織を切断するためにメスを使用してください。 </li><li>その後、簡単にPBSでそれらを洗浄し、10分間、4％PFAで角膜を修正。 </li><li> 10分間DAPIでサンプルをインキュベートし、簡単に、PBSで洗浄します。 </li><li>上皮側を上に向けてスライドガラス上にマウント角膜。角膜の上に取り付けメディアのドロップを置き、カバーガラスでカバーしています。スライドは、RT中のO / Nを乾燥させます。 4℃でスライドしてください。 </li></ol> 6.共焦点顕微鏡およびイメージング解析<ol><li> YFP / GFP / CFPの排出量の分離を可能にするスペクトル共焦点システムを使用してください。 Brのカセットの蛍光タンパク質に応じて蛍光励起および発光波長を設定します。交差を最小化を目指して、各タンパク質に最も適した励起波長を選択します励起。異なるタンパク質からの信号の漏れを最小限に抑えるために、狭い発光範囲を選択します。 <ol><li> Br2.1カセットの場合は、出発点として、蛍光励起（EX）と発光（EM）の設定次のコマンドを使用します。DAPI - EXの405nm /全角420から480 nmで、CFP - EX 458ナノメートル/全角470から500 NM、GFP - 元の488nm /全角497から508 nmのYFP - EX 514ナノメートル/全角529から540 nmであり、RFP - EX 561ナノメートル/全角575から615 nmの。 </li></ol></li><li>高解像度で大きな組織領域を可視化するために、タイル画像を取得します。 図2A-Bに示す結果、12×12画像の配列を取得することにより、画像全体の角膜の場合、 すなわち、各分野の4蛍光チャネルを使用して144フィールド（512×512）を取得します。全部で576の画像を収集して、マージします。 </li><li>組織の異なる深さや構造でタグ付けされた細胞の局在を調べるために、関心の異なる領域のZスタック画像を取得します。オーダーTにO画像角膜の完全な深さは、3μmの間隔で8光学切片を取得。最大強度に基づいて画像投影並びに収集部の直交するビューは、従来の撮像ソフトウェア24を用いて構成することができます 。 </li></ol>タモキシフェン誘導7.角膜損傷コンバインド<ol><li>イソフルランでマウスを麻酔（酸素で気化2％）および鎮痛薬投与（10mg / kgのCarpofenを、皮下注射）。つま先ピンチに無反応によって適切な麻酔を確認してください。 </li><li>タモキシフェン粉末1gを秤量し、200 mg / mlの濃度の溶液を生成するために、滅菌DMSO 5ml中に溶解します。 </li><li>溶液が透明になるまで水浴中で65℃にタモキシフェン溶液を温めます。使用するまで浴に解決してください。 </li><li>麻酔中の脱水を防ぐために、未処理の反対側の眼に眼軟膏を適用します。それは十分な詐欺を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨の横臥位を維持するためにsciousness。完全に回復するまで、他のマウスの会社に負傷目を受けたマウスを返さないでください。マウスは密接に損傷後の監視する必要があります。彼らの体重の10％以上を失った場合に、角膜びらん、または不快に苦しんで、実験を停止しなければなりません。繰り返し鎮痛薬投与実験全体を通して24時間ごと。 </li><li>それに取り付けられた針なし、無菌注射器を使用しました。各マウスの一方の眼の全角膜表面上で局所的に200μlのタモキシフェンソリューションを適用します。 注：溶液を室温で眼の表面に速やかに固化します。角膜損傷の効果は、創傷の重症度に依存します。タモキシフェン/ DMSO溶液の1つの適用に続いて何の悪影響はマウスで観察されていません。反復適用角膜混濁の場合に観察することができます。 </li><li>組織調製およびイメージングを続行（宗派を見ます該当する時点でイオン5及び6）。 1週間後の創傷（ 図2および24）（ステージ5.1で説明するように）ここに示す結果は、マウスを犠牲にするために。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

リネージュトレース実験は、長年にわたって行われてきました。最近の技術の向上と紙吹雪のマウス株の出現は、研究のための新たな道を開きました。現在、研究者らは、市販の組織特異的Creをライン、ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスの多くの恩恵を受けることができます。これは、堅牢で信頼性の高いデータを提供しながら、骨の折れる練習を回避し、基本的な専門知識を持つ科学的問題に対処するための多彩な実験系を設計するための機会を提供します。 R26R-紙吹雪マウスは、効率的な追跡および生体内の細胞の性質や挙動を研究するためのエレガントなツールです。システムが確立するのは簡単であり、それは、胚発生の間に単一細胞の非侵襲的系譜トレースを可能にする幹細胞の再生を恒常性の下で、またはそのような損傷、炎症および癌などの異なる状況下で。入手データは、堅牢なDESCRIPTを提供定量化の方法で標的細胞、クローン細胞増殖および細胞遊走の生存のイオン。重要なステップは、確実に正確な発達段階で効率的な組織特異的標識を可能にすることができる適切な遺伝的マウス系統を選択することであろう。このシステムの1つの制限は、生体を監視するために、組織がアクセス可能で、透明でなければならないということです。同様に、生きている動物内の厚い組織を追跡するのみ二光子または多光子顕微鏡法によって容易にすることができます。しかし、細胞の追跡は、死後の組織切片上で可能であり、それはCLARITY方法32,33により透明になるように変換された後、おそらく無傷組織を研究することができます。考慮すべきもう一つの制限は、同じフルオロフォアを発現する隣接セルは、おそらく同じクローン系統に属しているが、それは彼らがランダムに同じ蛍光遺伝子を発現した独立した細胞起源に由来してもよいこともまた可能であることです。このpossibili多数の色の組み合わせを可能にするために、複数のBr対立遺伝子を使用した場合tyが非常ににくくなります。 将来的には、利用可能な遺伝子ツール（ すなわち、ノックアウト、ノックイントランスジェニックマウスモデル）と紙吹雪システムを組み合わせることにより、遺伝子と健康と病理学におけるその変異の研究を可能にします。同様に、異なるシステム摂動の下でトレース系統（すなわち、細胞ニッチの破壊、レーザー媒介細胞除去、薬物治療を幹）細胞の運命決定にシグナル伝達経路の関与に新たな洞察をもたらすでしょう。最終的には、蛍光および生物発光標識の組合せ使用は、シグナル伝達経路およびエッジ顕微鏡を切断する遺伝記者は、研究者が自分の母国の環境で周囲にどのように対応するか、単一の細胞を学習するための堅牢なシステムを提供します。

胚発生の間に、組織および器官の形態形成は、細胞増殖、細胞遊走および系統仕様1-4に関して説明することができる正確なプログラムを介して行われます。これらの生物学的プロセスは、細胞の再生幹必要成体組織の恒常性の維持に関与しています。リネージュトレース、細胞集団の特定のタイプの子孫の識別と追跡は、胚を研究し、細胞の恒常性幹ための重要なツールを提供します。実際、それは、ますます研究の多くの分野で使用されています。特に、系統のトレースは、恒常性と癌発生における幹細胞の起源と運命を特定するのに不可欠なツールとなりました。それは、細胞が細胞単離とは対照的に、かつインビトロ培養またはtransplantati に 、最小限の実験的介入で、無傷の組織または生物との関連でどのように動作するかについての基本的な情報を提供することができるためですその上で、不要なバイアスをもたらす可能性があります。 伝統的に、細胞の原形質膜に組み込むような脂溶性カルボシアニン染料としては、系統追跡のために使用しました。実験のこれらの種類が正常に発生生物学5,6に主要な発見や形状の精液概念につながっているが、それらは、標的細胞の特異性を制御する難しさ、細胞の挙動の色素の不要な影響や希釈などのいくつかの制限を持っていますラベルの時間。ヌクレオチドアナログラベリングアプローチは、おそらく幹細胞7,8を静止状態に対応する「ラベル保持細胞「スローサイクリングの存在を文書有効にしています。この技術は、限られた時間の期間にわたって増殖動態に基づいてスローサイクリング細胞の存在を実証することができながら、しかし、それは幹細胞の機能性に関する実質的な洞察を提供することができませんでした。最適な系譜トレースメタodologyはマークされた細胞、その子孫、またはその隣の性質上の標識の影響を最小限に抑える必要があります。加えて、ステージと、時間依存的な様式で、ならびに、単一の細胞（クローン）の方法で目的の細胞集団をタグ付けする能力を有すること、すなわち、標識誘導の制御を有することが有益であろう。ラベルは時間をかけて保持され、隣接セルに転送されないことになるように創始細胞のすべての子孫に渡され、安定かつ不可逆的な標識方法は重要です。 より最近では、細胞標識の遺伝的アプローチが開発されました。これらのシステムでは、細胞特異的プロモーターは、loxP隣接障害を除去し、例えば、緑色蛍光タンパク質またはΒガラクトシダーゼレポーター遺伝子9-13などのレポーター遺伝子の発現を可能にするために、Creリコンビナーゼの発現を誘発するために使用することができます。このアプローチだけでなく、細胞やその子孫の追跡を可能にするだけでなく、細胞であることが可能オレーションや分子特性。単一細胞レベルでの細胞の追跡は、単一の蛍光レポーター遺伝子の発現を誘導することにより可能となりました。このシステムの一つの重要な制約は、細胞の非常に低い割合が標識されている場合にのみ、個々のクローンを分離し、追跡することが可能であるという事実です。レポーターを使用することができ、この限界を克服するために、多色。多色標識を使用する場合は、同じニッチにおける隣接セルの差動運命の追跡を効率的に14-17を達成することができます。最近、Brainbow（BR）の対立遺伝子の多様性は、Cre / lox系を利用して、複数の蛍光レポーター遺伝子の確率的な発現を可能にする、系統トレーシング実験のために開発されました。 Cre / lox系が認識し、そのようなloxP部位として特定のDNA配列に結合するCreリコンビナーゼ酵素、から構成されています。以下のCreリコンビナーゼの結合は、部位特異的組換えが発生し、loxP配列の除去挟まれたシーケンスがresultin引き起こします種々の蛍光タンパク質の発現のランダムグラム（メカニズムを以下に説明します）。 Brのラインの様々な（レビュー16,18,19を参照してください ）使用できます。 Brの株の主な違いは、2（BR 2.0）、3（Br1.0）から4（Br1.1、Br2.1）蛍光遺伝子に至るまで、カセットに含まれる蛍光遺伝子の数（I）の違いを含めますこと、（ii）相互に向いlox部位の存在が使用lox部位の（iii）のタイプ、および（iv）式または蛍光遺伝子発現の沈黙の前のCre活性化に、遺伝子反転（Br2.0-2.1）を可能にします。最近設立されたB​​R3は、ニューロンの多色イメージングのための改良された方法を提供しています。この転写産物の主な特徴の一つは、最高級の神経細胞20を処理するのであっても染色を可能にする光安定ファルネシル化蛍光タンパク質の新しいセットが含まれていることです。 重要なことは、Brのカセットの異なるバージョンは、ニューロンの特定はThy1 PRを含んでいてもよいですomoterまたは偏在的CAG（CMV）プロモーターを表明しました。 Brのトランスジェニックマウスのいくつかは、単一のBr導入遺伝子を含有することができる一方で、最終的に、他の人がそれによって各細胞内で発現される色の組み合わせの可能性の膨大な数の生産を可能にする、複数の導入遺伝子のコピーからなってもよい（例えば、16を参照のこと）。 私たちの研究では、Brの2.1 カセット 21 を含んで R26R-紙吹雪のマウスを使用していました。 Br2.1は、一意のCre媒介DNA逆位と理由loxP部位（ 図1）の逆数の向きだけでなく切除を可能にするように設計されています。このように、色の変化につながるこれらの反転/切除イベントは限りのCreが16存在するとして継続することができます。そのため、一時的な誘導性Cre発現系はBr2.1を用いた信頼性の細胞追跡のために必須です。 図に示すように。 1、Br2.1はloxP隣接ネオR -casse続いユビキタスCAGプロモーターが含まれています転写の障害として作用するTTEは、それは、二つのタンデムに配置さ黄緑4蛍光レポーター遺伝子をコードする（GFP）、（YFP）、赤色（RFP）、シアン（CFP）蛍光タンパク質、が続きます。いいえ蛍光は、Creの活性化に先立って表現されていません。 Creリコンビナーゼの誘導は、所定の細胞に4蛍光タンパク質の一つのランダムな発現を可能にする新Rカセットの除去を引き起こします。第二のセグメントは、loxP隣接RFPと逆CFPが含まれていながら、最初のセグメントは、loxP隣接GFPと逆YFPが含まれています。これらのDNAセグメントは、連続している限り、Creリコンビナーゼが存在するように、（逆向きであるのloxPを使用して）、反転、または切除されてもよいです。したがって、一過性と制御のCre導入遺伝子を使用する必要があります。 Br2.1カセットは、信号位置に基づく重複の排出量とを区別するための優れたシステムを提供します：YFPおよびRFPの発現は、細胞質である、GFPが核であり、CFPは、細胞膜に結合されます。 GFPおよびRFPの排出が容易に従来の蛍光顕微鏡で分離されています。 YFP / GFP / CFPの排出を分離するために、スペクトル共焦点イメージングシステムが必要とされます。要するに、Br2.1カセットは、各標的細胞における4つの異なる蛍光遺伝子のうち1つ、ランダム誘導性、および組織特異的発現を可能にします。色の組み合わせの多数が必要とされるときに、実際には、一つは、このように各セルの2色タグの発現および10に可能な色の組み合わせの数を上げ、その結果、Br2.1の2対立遺伝子を含むホモ接合性のマウスを生成することができカセットの複数のコピーがそのゲノム16に統合されたので、22。Brのマウス系統の一部は、可能な色の組み合わせのはるかに多数の発現を可能にします。しかし、ほとんどの場合、単一Br2.1対立遺伝子によって設けられた4つの色の組み合わせで十分です。ここで提供されたプロトコルに続いて、一つはSPECTRの比較的簡単なセットアップを使用してこの方法を確立することができますキャリブレーションのための任意の必要がある場合はほとんどないとアル顕微鏡。 ここでは、角膜上皮の系譜トレース実験のために、単一Br2.1対立遺伝子を含んでR26R-紙吹雪マウスの使用に適合プロトコルを提供します。このトランスジェニックマウス株は、腸ガン25における幹細胞活性の存在を結腸21,23および角膜上皮幹細胞22,24の起源と運命を研究するため、ならびに巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）で腎臓足細胞を特徴付けるために使用されています17。

<table><tbody><tr><td>Brainbow 2.1 カセット</td><td>ジャクソン</td><td>株 #013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT マウス</td><td>ジャクソン</td><td>株 #005107</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン USP テレル</td><td>ピラマル クリティカル ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カープリーブ 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>は 4&#160 の濃度で使用されます。&マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 電動ステージZeissを装備した倒立型電動顕微鏡(Axiovert 200M)に接続されたMetaレーザー走査型共焦点システム</td><td>GFP</td>、YFP、CFGのスペクトルオーバーラップには、蛍光タンパク質の発光スペクトルを分離するためのスペクトルイメージングが必要です。<td></td><td>ここでは、Zeiss LSM 510 Metaスペクトル共焦点顕微鏡を使用しています。このシステムに含まれるメタ検出器には、32個の検出器要素があり、それぞれが10ナノメートルの波長帯から発光を収集します。「スペクトルフィンガープリント」と呼ばれるこの手法により、ユーザーは波長帯フィルタリングに最も適切な制限を設定できます。Leica SP5(ref #21)、SP8、Zeiss LSM 780(ref #22)など、さまざまなスペクトル共焦点システムを使用できます。</td></tr><tr><td>Zen 2009 イメージングソフト</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-eye 軟膏</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

系統追跡実験は、特定の組織や生物における細胞の起源、運命、挙動を定義します。この技術は何十年にもわたって成功裏に適用され、発生生物学における独創的な発見を明らかにしてきました。最近では、幹細胞生物学者によって採用され、最小限の実験的介入でさまざまな幹細胞集団を特定および追跡しました。近年のマウス遺伝学の発展、多数のマウス系統の利用可能性、蛍光顕微鏡の進歩により、市販のツールを使用して、基本的な専門知識を持つさまざまな組織に対する強力な系統追跡システムを簡単に設計できるようになりました。私たちは最近、この強力な方法論を利用して、R26R-Confettiマウスを使用して眼表面の幹細胞の起源と運命を探っています。このモデルは、4つの蛍光遺伝子をランダムに発現するためのマルチカラー遺伝システムを提供します。ここでは、この方法論の原理を説明し、系統追跡実験を設計するための適応可能なプロトコルを提供します。特に角膜上皮や他の組織に特化しています。

最近、我々は、幹細胞および角膜上皮24の前駆細胞の起源、生存および遊走を特定することを目的と。証拠を蓄積すると、角膜上皮が角膜縁ニッチ、角膜周辺部にリング状のゾーンに排他的に位置する幹細胞によって再生される教義をサポートしています。この理論は、 インビトロ およびインビボのデータであり、成功した先駆的な輪部幹細胞療法27-29の基礎を提供した臨床上の証拠によって支持されています。しかし、この話題は非常にマウスの角膜縁が角膜リニューアル30に参加していないことを示唆した輪部移植実験に基づく研究と近年の議論のままでした。この興味深い仮説を試験するために、R26R、紙ふぶきマウスを用いた系統トレース実験は、最大120日24定常状態下縁と角膜上皮幹/前駆細胞の運命を追跡するために、実施しました。眼を摘出し、フラットマウント角膜タモキシフェン噴射ポスト10および120日スペクトル共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡によって分析しました。予想されるようにしながら1-4ヶ月後（ 図2Bおよび24）、蛍光細胞の小さな散発的クラスターは、10日間の注射後に眼表面全体にゆっくりと開発した角膜中心に向かって輪部から延びる細長い筋が観察されました。この結果は、角膜は、角膜の中心に向かって縁から移動する細胞によって再生されることを示唆しています。次に、負傷の条件下で角膜再生を検討しました。効率的な細胞追跡を誘導しながら創傷条件下K14陽性輪部/角膜の細胞の運命を調べるために、我々は、局所適用の際に角膜損傷を引き起こすジメチルスルホキシド（DMSO）にタモキシフェンを溶解しました。単一の局所適用が適用された場合、我々は（ 図2C）、軽度の創傷を誘導するために管理このように、MO<html>追加のDMSO単独の治療はタモキシフェン誘導またはDMSO単独では局所的にタモキシフェン誘導する前に、2日間連続で適用した深刻な傷前日に適用された場合は負傷ディレーティング。 ゆっくりと開発され、定常状態の条件の下で4カ月以内に、角膜中央に達し薄い輪部のストライプとは対照的に、損傷後の細胞の移動は急速でした。注目すべきは、長くて太い輪部のストライプは、すでに7日以内に、これらの条件の下で開発されました。 興味深いことに、色の多様性は、（ 図2D）時には最小でした。我々の手では、時々、主に赤血球を、特定のフルオロフォアに向かって付勢することができる色の多様性を示し、全体の角膜で同定されました。 Br1.0L 31およびBr2.1 21において以前に報告されているように、この不要なバイアスは、用量応答試験によって較正することができます。 レ/ ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; 図1. R26R-紙吹雪 の模式図を 構築する。（A） R26R-紙吹雪構築物は高い発現レベルのためのCAGプロモーターを含む、loxP配列（黒三角）は、ネオのR -roadblockとRosa26遺伝子座16,21でBrainbow2.1カセットを-flanked。 Brainbow2.1カセットは2頭 - 尾loxP隣接二量体が含まれています。一つの二量体は、核局在緑色蛍光タンパク質（GFP）と逆向きの細胞質黄色蛍光タンパク質（ - PFY YFP、逆方向が指定されている）で構成されています。 16 - 2番目の二量体は、細胞質RFPと逆向きの膜係留シアン蛍光タンパク質（PFC逆向きが指定されたCFPを、）が含まれています。 （B - E）のCreリコンビナーゼの活性化の際に、異なる切除および反転イベントが発生する可能性があります。可能な結果がexemplifiですE - Bに編。 Cre活性は遺伝子の削除および/ ​​または逆位と4蛍光タンパク質の一つのランダムな表現でこのような結果につながるカセットの確率的な再配置を誘導する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> 図2。 恒常性と傷害の下でトレース角膜系統。R26R-紙吹雪/ K14-Creマウスは、プロトコルで説明するように4 mgのタモキシフェンを注射しました。 （ - B A）点が投稿示された時間では誘導が角膜を画像化した平坦化。 Cre誘導に結合角膜創傷は（ - D C）DMSOに溶解したタモキシフェンの局所適用によって達成されました。モザイク画像を得ますスペクトル共焦点顕微鏡をタイルのマルチチャネルで示されている（A - D）。恒常性では、ゆっくりと移動する細胞の半径輪部のストライプは、角膜輪部と角膜中心部の間に延長しました。これらのストライプは、4-5ヶ月（B）内の角膜の中心に到達し、徐々に開発します。角膜細胞のクラスターは、ウェル（白矢印A、B）のように明らかでした。これとは対照的に、大きな輪部筋が負傷条件（C）の下で1週間以内に現れました。赤血球（D）に向けて、色の多様性のバイアスのための一例。輪部角膜の境界を破線で注釈されています。スケールバーは500μmです。略語：CFP、シアン蛍光タンパク質。 GFP、緑色蛍光タンパク質。 RFP、赤色蛍光タンパク質。 YFP、黄色蛍光タンパク質。この図は、24から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>この図。

この記事では、R26R-Confettiマウスを使用した多色系統追跡実験を設計し実行するための原理について説明します。私たちは、他の関心のある組織に修飾できる角膜上皮細胞を追跡するための特定のプロトコルを提供します。

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

本手法の全体的な目的は、角膜上皮における幹細胞および前駆細胞の移動、拡大、および生存を特定し、追跡することです。この手法は、恒常性、組織修復、老化、および病理に関する角膜上皮細胞生物学分野の重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、構築が容易であり、クローン単位での非侵襲的な細胞系譜追跡が可能であることです。まず、輪部および角膜上皮の前駆細胞と幹細胞を標識するために、誘導性組織特異的プロモーターを持つCre・トランスジェニックマウス系統を選択します。ここでは、タモキシフェン誘導性K14-CreERT系統を使用します。次に、研究課題および利用可能なCre系統に応じて、適切なBrainbowカセットを選択します。本ケースでは、Brainbow 2.1ラインを使用します。ホモ接合体のR 26 R confetti系統とホモ接合体のK 14 Cree ERT系統を交配させ、4色で標識されるK 14陽性細胞を持つマウスを作成します。トランスジェニックマウスにおいて組換えを誘導するため、まず80 mgのTamoxifenを量り取り、1 mLのコーンオイルに加えてボルテックスミキサーで溶解させます。溶液を65 °Cに維持した振盪水槽に入れ、完全に溶解するまで加熱し、次回の麻酔に使用するまで水槽内に保持します。8週齢のBrainbow 2.1 CreERTヘテロ接合体マウスを用い、つま先へのピンチテストで麻酔深度を慎重に確認した後、マウスの各眼球表面にタモキシフェン溶液を100 µLずつ適用します。タモキシフェンを直接適用することで、高い効率でCre誘導が得られます。残ったタモキシフェン溶液は、遮光して4 °Cで最大1週間保存してください。投与前に溶液を温めます。この処置をマウス1匹につき3日連続で行います。まず、1 gのタモキシフェン粉末を5 mLの滅菌ジメチルスルホキシドに溶解させます。200 mg/mLの溶液を作成するため、溶液を振盪恒温水槽に入れ、透明になるまで65 °Cに保持し、使用時まで水槽内に保管します。次にマウスを麻酔し、足指をつまんで麻酔深度を確認します。処置中の脱水を防ぐため、処置を行わない側の眼に眼軟膏を塗布し、適切な鎮痛剤を投与します。続いて、針を取り外したシリンジにTamoxifen溶液を200 µL吸引し、眼の角膜全体に局所的に塗布します。この液体は室温で組織上で凝固します。マウスが腹臥位を維持するまで観察し、完全に意識が回復してからのみ、他の個体と同じケージに戻します。誘発後、適切な時点でマウスを犠牲にし、テキストプロトコルに記載されているように眼球に創傷を作ります。まず眼瞼を押し、眼球を眼窩から押し出して摘出します。湾曲鑷子を眼球の背後に滑り込ませて視神経を固定し、眼球を上に引き上げて分離します。各眼球をPBSを入れた60 mmディッシュに入れます。眼球が入ったプレートを外科用実体顕微鏡の下に置きます。眼の基本構造、角膜、角膜輪、および視神経を確認してください。視神経、筋肉、および眼周囲の結合組織を除去します。角膜を下に向けた状態で眼の後端を保持し、スプリングシザーを用いて眼球後方の強膜を切開します。切開口を広げてレンズを脱落させ、ピンセットで虹彩を除去します。次に、中心から周辺に向かって4〜5本の放射状の切開を加え、角膜を平坦にした後、薄い平型スパチュラを用いて虹彩の残りの部分を除去します。最後に、角膜を固定するため、角膜輪部周囲の過剰な周辺組織を切り取ります。摘出した組織を12ウェルプレートに移し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。次に、細胞核を染色するため、組織をPBSで短時間洗浄します。角膜を2 µg/mLのDPI溶液中で10分間インキュベートし、その後、PBSで短時間洗浄します。次に、角膜の上皮側を上に向けた状態でガラススライド上に置きます。その後、角膜の上に封入剤を1滴滴下し、カバーガラスで覆います。スライドを室温で一晩乾燥させ、4 °Cで保存します。角膜イメージングには、R-F-P-Y-F-P-G-F-PおよびCFPの放出光を分離できるスペクトラル共焦点システムを使用します。まず、脳の蛍光タンパク質に応じて、励起および放出波長を設定します。この際、相互励起や放出信号の重複が起こらないように注意してください。次に、角膜全体を高解像度で可視化するために、タイル画像を撮影します。ここでは、4つの蛍光チャネルすべてにおいて12×12の画像アレイを取得します。最後に、これらの画像を統合して、複合的なリネージを作成します。輪部および角膜上皮前駆細胞の運命を追跡するため、R 26 R confetti マウスを用いた追跡実験を行った。定常状態で、誘導から10日後には予想通り、蛍光細胞の小さなクラスターが観察された。4ヶ月後には、輪部から角膜中心に向かう筋状の細胞集団が形成されており、角膜損傷後、細胞が輪部から移動して角膜を再生させることが示唆された。輪部からの細胞移動は急速に起こり、7日以内に長く太い輪部ストライプが形成されました。このモデルは、さまざまな条件下で角膜幹細胞および前駆細胞を追跡し、研究する上で有用です。これにより、定常状態および、将来的に創傷、化学熱傷、変異などのストレス条件下におけるクローン細胞の拡大、生存、および移動の調査が可能になります。このモデルは、正常および病的な角膜再生の根底にある分子メカニズムを解析するためにも利用可能です。本手法は、角膜ジストロフィー、火傷、角膜外傷などのさまざまな病理学的条件の理解に寄与し、さらに、さまざまな治療法が角膜再生、細胞増殖、および遊走に与える影響の評価にも役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、のために必要なツールを開発...

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere,  et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで  イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。...

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

ここでは、異なるマウス組織内のIL-22産生細胞を可視化するためのトランスジェニックレポーターマウスモデルについて説明します。この方法は、マウス内の他のサイトカインまたは分泌タンパク質の位置を追跡するために使用できます。...

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

ここで、我々は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来の神経細胞の可視化を可能にモザイク標識技術のためのプロトコルを提示します。これは、出生付き合っ個々のニューロンを、異なる個体の同じ神経細胞に遺伝子機能を研究する能力を持つ神経系統解析を容易にします。...

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

この方法は、R26R-Confetti(Confetti)マウスモデルを使用してミネラル化された組織を研究し、繁殖戦略から画像取得に至るすべてのステップをカバーすることを説明します。含まれているすべての軟部組織に適用することができる一般的なプロトコルおよびミネラル化されたティッシュに適用することができる改変されたプロトコル。...

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。...

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析を用いて、単一細胞レベルで候補遺伝子の系統トレースと機能遺伝子解析を行うプロトコルを紹介する。MADMクローン解析は、個々の前駆細胞とその娘細胞の増殖行動、細胞出力、および系統関係を測定するための定量的枠組みを提供します。...

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。...

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

学ぶ角膜上皮幹細胞の系譜トレース法。R26R-Confettiマウスとマルチカラー蛍光レポーターを用いて、角膜細胞の移動・拡張・生存を追跡し、組織修復と再生医療のメカニズム解明に貢献します。

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

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