マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

この方法の全体的な目標は、角膜上皮内の幹細胞と前駆細胞の遊走、増殖、生存を特定し、追跡することです。この方法は、ホメオスタシス、組織修復、老化、および病理学に関する角膜上皮細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、確立が容易で、クローン方式で細胞の非侵襲的な系統追跡を可能にすることです。

まず、誘導性組織特異的プロモーターを持つCreeトランスジェニックマウスマウスを選択し、辺縁部および角膜上皮前駆細胞および幹細胞を標識します。タモキシフェン誘導性K 14クリーERTラインが使用されています。次に、研究課題と利用可能なCreeラインに応じて、適切なブレインボーカセットを選択します。

この場合、Brainbow 2.1ラインが使用されます。ホモ接合体R 26 R紙吹雪株とホモ接合体K 14 Cree ERT株を交配して、4色のK 14陽性細胞を有するマウスを生成し、トランスジェニックマウスにおいて組換えを誘導する。まず、80ミリグラムのタモキシフェンを秤量し、ボルテックスにより1ミリリットルのコーン油に溶かします。

溶液を完全に溶解するまで摂氏65度に維持する振とう水浴に入れ、次に麻酔薬を使用するまで浴中に置いておきます。8週齢のBrainbow 2.1 Cree ERTヘテロ接合マウス、およびつま先のピンチで麻酔の深さを確認し、マウスの各眼球表面にタモキシフェン溶液の100マイクロリットルを慎重に適用します。タモキシフェンの直接適用はクリー族の誘導の高性能をもたらします 1週間まで摂氏4度の光から保護された残りのタモキシフェンの解決を貯えなさい。

塗布前に溶液を温め、各マウスに対して3日間連続して繰り返します。まず、1グラムのタモキシフェン粉末を5ミリリットルの滅菌ジメチルスルホキシドに溶解します。ミリリットルあたり200ミリグラムの溶液を製造するには、溶液を振とう水浴にセットし、透明になるまで摂氏65度を維持し、使用するまで浴中に置いておきます。

次に、マウスに麻酔をかけ、つま先つまみを使用して麻酔の深さを確認し、未治療のマウスの目に軟膏を塗布して、処置中の脱水症状からマウスを保護し、適切な鎮痛薬を投与します。次に、200マイクロリットルのタモキシフェン溶液を針を付けずに注射器に引き込み、目の角膜全体に局所的に塗布します。液体は室温で組織上で固化します。

マウスが胸骨の横臥を維持するまでマウスに注意を払い、完全に意識がある場合にのみ他の人の会社に戻します。誘導後の適切な時点でマウスを犠牲にした後、テキストプロトコルに記載されているように眼に傷を負わせる。最初にまぶたを押して眼球を眼窩から飛び出して、目を核にします。

湾曲した鉗子を眼球の後ろにスライドさせて視神経を保持し、眼球を引き上げて取り外します。PBSが入った60mmの皿に各眼球を置きます。アイコンセプティングプレートを手術用実体顕微鏡の下に置きます。

目、角膜、輪部、視神経の基本構造を認識していることを確認してください。目の周りの視神経、筋肉、結合組織を取り除きます。角膜を下に向けて眼球を後部で押さえ、眼球の奥にある強膜をスプリングハサミで切開します。

レンズが飛び出すようにカットを拡大し、鉗子で虹彩を取り除きます。次に、中心から周辺に向かって切り込み、角膜を平らにしてから、細い平らなヘラで虹彩の残りの部分を取り除き、放射状に4〜5回の橈骨切開を行います。最後に、輪部を囲む余分な末梢組織を切断して角膜を固定します。

解剖した組織を12ウェルディッシュに移し、ホルムアルデヒドの4%パラで10分間インキュベートします。次に、PBSで組織を短時間洗浄して細胞核を染色します。角膜をDPI溶液1ミリリットルあたり2マイクログラムで10分間インキュベートし、続いてPBSで短時間洗浄します。

次に、角膜を上皮側を上にして角膜をスライドガラスの上に置きます。次に、封入剤を角膜の上に一滴垂らし、カバースリップで覆います。スライドを室温で一晩乾燥させ、摂氏4度で保管します。

角膜イメージングには、R-F-P-Y-F-P-G-F-PとCFPの発光を分離できるスペクトル共焦点システムを使用します。まず、脳の蛍光タンパク質に応じて蛍光、励起、発光の波長を設定します。Boカセット、交差励起や放射信号のオーバーラップを防ぐように注意してください。

次に、角膜全体を高解像度で視覚化するために、タイル状の画像を取得します。ここでは、4つの蛍光チャンネルすべてで12×12の画像の配列を取得します。最後に、画像をマージして複合系統を作成します。

R 26 R confetti マウスを用いた追跡実験を行い、辺縁系および角膜上皮前駆細胞の運命を追跡しました。定常状態条件下では、誘導後10日で蛍光細胞の小さなクラスターが予想通り観察されました。4か月後、辺縁部から角膜の中心への縞模様が発達し、細胞が角膜損傷後に辺縁部から角膜を再生するために移動したことを示唆しています。

リンバスからの移動は急速に発生し、7日以内に長くて太いリンバルストライプが発達しました。このモデルは、さまざまな状況下で角膜幹細胞と前駆細胞を追跡し、研究するのに有用です。これにより、将来的には、定常状態や、創傷、化学火傷変異などのストレス条件下でのクローン細胞の増殖、生存、遊走の調査が可能になります。

このモデルは、正常および病理学的な角膜再生の根底にある分子メカニズムを解剖するためにも使用できます。この技術は、角膜ジストロフィー、火傷、角膜外傷などのさまざまな病理学的状態の理解に貢献し、さらに、角膜の再生、細胞増殖、および移動に対するさまざまな治療の影響の評価に貢献する可能性があります。