Name: FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学ぶFACSを用いたマウス皮膚線維芽細胞の分離法。in vitro培養を省略し、表現型変化を防ぎながら線維芽細胞を単離できます。創傷治癒や線維症の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は（HPL）は、NIH助成金R01 GM087609、（MTL）は（HPL）にアンソニー・シュウ、NIHのグラントU01のHL099776に敬意を表しイングリッド・ライ、ビルシュウからの贈り物、Hagey研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました小児再生医療とオーク財団（MTLに、GCGおよびHPL）。 GGWは医学のスタンフォードスクール、スタンフォード医学者研修プログラム、およびNIGMS訓練助成金GM07365によってサポートされていました。 ZNMは整形外科財団研究員助成とHageyファミリー基金によってサポートされていました。 MSHは再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）臨床フェロー研修助成金TG2-01159、顎顔面外科学会（ASMS）/顎顔面外科財団（MSF）研究助成賞、および移植とティッシュ・エンジニアリングフェローシップ賞によってサポートされていました。

このプロトコルは、実験動物管理のスタンフォード大学紛争処理パネルにより承認された方法に従います。 マウス真皮の1消化<ol><li>ケタミンを100mg / kgのキシラジン+ 20ミリグラム/ kgのアセプロマジン+ 3 10mg / kgの腹腔内注射による麻酔後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 注意：様々な年齢や背景を使用することができます。 </li><li>背部皮膚を剃ると毛を抜きます。約100,000個の細胞は、背側の皮膚の一片×100mmの60ミリメートルから単離することができます。 </li><li> 70％エタノールでマウスを水没し、乾燥さ清潔、無菌面に置きます。 </li><li>すぐに無菌解剖ハサミを使用して、背側マウスの皮膚を収穫。雌マウスでは、乳房組織を含めないようにしてください。 </li><li>尾の付け根から開始して、10トンまでの皮膚のに鉗子を使用し、超筋膜面に沿って切開する前に、横方向のカットを行います。 </li><li>収穫しながら、任意の皮下脂肪を含め慎重に避けます肌。任意の皮下脂肪のために採取した皮膚を調べ、慎重にメスの鈍いエッジを使用してそれを削り取ります。 </li><li>氷上でPBS洗浄を5倍に続いてベタジンで収穫皮膚を洗い流します。 注：これは、汚染を回避することができる無菌の近くの皮膚を維持することが重要です。 </li><li>かみそりの刃を使用して、サンプル2-3ミリの作品との均一な一貫性になるまで滅菌皿にはさみを解剖皮膚をみじん切り。 </li><li> DMEM中1mg / mlの濃度で50ミリリットルを20ミリリットルのコラゲナーゼIVを含むコニカルチューブを準備します。チューブあたり5匹のマウスに基づいてチューブに真皮を分割します。 </li><li>水浴またはオーブンのいずれかで37℃で1時間インキュベートしながら、積極的にサンプルを攪拌。 </li><li>インキュベーターからサンプルを取り出して、無菌フード内で針3-5xずに10ミリリットルの注射器を通過します。 </li><li> 37℃でバックインキュベーターにサンプルを配置し、さらに30分間激しく振ります。 </li><li>無菌フードに10mlのピペットを用いてピペット上下3-5xサンプル。新しい50mlコニカルチューブに100μmのフィルターを通して試料をピペット。 </li><li>細胞収率を最大化し、40ミリリットルの全量を同じフィルターを通して、10％FBSを含むDMEMの20ミリリットルを渡します。 4℃で8分間300gで遠心分離します。 </li><li>最初前残りの上清に、上部の脂肪層を除去するために細心の注意を取って、滅菌ガラスピペットを用いて上清を除去します。 注：このステップは、脂肪細胞の汚染を低減することが重要です。 </li><li> 20ミリリットルの10％FBS DMEM中でペレットを再懸濁します。 </li><li> 70μmのフィルターを通して細胞/ DMEM懸濁液を渡します。 </li><li> 10ミリリットル、10％FBS DMEMでフィルターを洗浄し、4℃で8分間300グラムで濾過サスペンションを遠心します。 </li><li>再び第1残りの脂肪層を除去するために世話をして、滅菌ガラスピペットを用いて上清を除去します。 </li><li>重要なRBC汚染がある場合（ペレットが目に見えて赤である）、ペレットを再懸濁20 mlのACK溶解緩衝液中で室温で5分間インキュベートします。それ以外の場合は24に進みます。 </li><li> FACS緩衝液（PBS、10％FBS、0.1％アジ化ナトリウム）の等量（20 ml）を追加し、その後混合し、非染色コントロールとして確保5mLのアリコートを維持します。 4℃で8分間300gで、残りのサンプルを遠心します。 </li><li>上清を除去し、氷の上にペレットを入れました。 FACS時間が利用できない場合、細胞は、この時点で凍結してもよいです。 </li></ol> FACSによる線維芽細胞の単離2。 <ol><li>各ペレットの系統抗体インキュベーションミックスの500μLを加えます。第1のチューブにDNアーゼ（10μg/ ml）を含むFACS緩衝液475μLを加え、その後、（1：100）、フルオロフォアコンジュゲートCD31を追加することでこれを行い、CD45（1：200）、Tie2の（1：50）、テル-119（1：200）、およびEpCAMの（1：100）抗体は、各抗体に対するそれぞれの希釈を達成します。 </li><li>系統抗体インキュベーションミックス500μlの各ペレットを再懸濁し、20分間氷上でこの懸濁液をインキュベートします。 </li><li> 5を追加サンプルにDNアーゼ（10μg/ ml）を含む、穏やかに混合mlのFACSバッファー。 4℃で8分間300gで遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、ステップ26と同様の条件を用いて、DNアーゼ（10μg/ ml）および遠心分離を含む5ミリリットルFACS緩衝液で細胞ペレットを洗浄します。 </li><li> DNアーゼ（10μg/ ml）を含む500μlのFACS緩衝液中にペレットを再懸濁し、生存率染料コントロールとして確保50μlのアリコートを入れました。 </li><li>選択された染料のために示されている濃度の残りのサンプルに選択の生存率染料を追加します。 </li><li> FACS分析31を行い、生存率染料/ CD31- / CD45 - / Tie2- /テル-119- / EpCAM-細胞（ 図2A参照 ）のソート。ソート直接FACS緩衝液に。 </li></ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts.+I.+Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease.</a> The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Wilson, M. S., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrosis%3A+pathogenesis%2C+etiology+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation.</a> Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).</li>
<li>Hinz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast%3A+one+function%2C+multiple+origins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast: one function, multiple origins.</a> The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).</li>
<li>Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%3A+force+generation+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement.</a> J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).</li>
<li>Wong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+oral+mucosa+results+in+reduced+scar+formation+as+compared+with+skin%3A+evidence+from+the+red+Duroc+pig+model+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration+%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).</li>
<li>Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+fetal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Adult and fetal wound healing.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).</li>
<li>Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+skin+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fetal skin wound healing.</a> Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors%3A+wounds+that+do+not+heal.+Similarities+between+tumor+stroma+generation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing.</a> The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).</li>
<li>Dumont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+early+dissemination%2C+tumorigenesis%2C+and+metastasis+through+alteration+of+extracellular+matrix+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics.</a> Neoplasia. 15, 249-262 (2013).</li>
<li>Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sentinel+cells+to+inflammatory+culprits%3A+cancer-associated+fibroblasts+in+tumour-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation.</a> The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cancer-stroma+interaction%3A+a+potential+approach+for+pancreatic+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment.</a> Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).</li>
<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity%3A+more+than+skin+deep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).</li>
<li>Cormack, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCormack%2C+DH+%22Ham%27s+Histology%22">Ham's Histology</a>. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+interactions.+Adult+follicle-derived+cell+populations+and+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+clinics%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth.</a> Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).</li>
<li>Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+sheath+cells%3A+unsung+participants+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing.</a> Lancet. 358, 1445-1448 (2001).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bilayered+dermal+equivalent+containing+human+papillary+and+reticular+dermal+fibroblasts%3A+use+of+fluorescent+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes.</a> Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).</li>
<li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis%3A+differences+in+growth+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204, 526-527 (1979).</li>
<li>Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+fibroblasts+derived+from+the+papillary+and+reticular+dermis+of+infants+and+adults%3A+growth+kinetics%2C+packing+density+at+confluence+and+surface+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology.</a> Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).</li>
<li>Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-matched+papillary+and+reticular+human+dermal+fibroblasts+differ+in+their+release+of+specific+growth+factors%2Fcytokines+and+in+their+interaction+with+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes.</a> Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425(2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
<li>Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+a+Dermal+Lineage+with+Intrinsic+Fibrogenic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature protocols. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Klein, M., Fitzgerald, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+separation+of+intact+epidermal+sheets+from+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin.</a> The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).</li>
<li>Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yThree+blocks+are+not+enough+-+Blocking+of+the+murine+IgG+receptor+FcgammaRIV+is+crucial+for+proper+characterization+of+cells+by+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis.</a> European journal of immunology. , (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この原稿に記載されているプロトコルは、亜集団のために選択するか、その後の分析の前に、細胞培養時間を必要とするいずれかの既存の方法に比較して、FACSベースの選別により、線維芽細胞を単離するための手段を提供しています。線維芽細胞のソートに皮膚の収穫からの所要時間は約6時間です。しかし、収穫に使用したマウスの数は、この推定値に影響を与えます。 プロトコルのいくつかの点は特に注意が必要です。最初は、分離プロセス中に消化し、遠心分離後に消化し、上清の上部の脂質層の除去の前に皮膚から脂肪を除去することによって脂肪細胞の汚染を制限しています。また、いくつかの脂質成分は、チューブのプラスチック壁に付着し、その後のペレット洗浄液を汚染する可能性があるように、細胞をペレット化した後、新鮮なチューブに変更することが有用であろう。第二の点は、表皮から真皮別々に細心の注意を必要とします表皮真皮境界部に沿って。表皮細胞を夾雑FACS枯渇戦略によって除去されるが、ここでは汚染を制限するための努力がまだなされるべきです。 このアプローチの限界は、現在の系統...

線維芽細胞は、しばしば、プラスチック基板に接着する紡錘状細胞と形態学的に定義されています。線維芽細胞は、胚および成体の臓器1における細胞外マトリックスの合成と改造を担当する原則細胞型です。線維芽細胞は、哺乳類の発生することが重要であり、各組織や臓器に存在する隣接セルの種類の動作に影響を与える細胞外環境に大きく貢献しています。 線維芽細胞はまた、膨大な臨床負担を引き起こす医学的条件の多様なセットの背後の主要な細胞型です。病理学的線維芽細胞の活性は、正常組織の機能を損ない、皮膚の創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、および血管損傷2-5後のアテローム斑の形成後の組織及び（例えば肺や肝臓など）臓器線維症、瘢痕化が含まれます。特に、創傷治癒は、両方のは、急性および慢性的に、Dを含み、そのことを周囲の正常組織のようなどちらも似ているにも機能し、多様な病理学的状態全体でかなりの罹患率につながる瘢痕組織のeposition。損傷後、次に、構造ECM成分を分泌する細胞型に隣接パラクリン効果を発揮し、瘢痕組織6を堆積させることによって機械的安定性を復元する筋線維芽細胞への線維芽細胞の移行があります。 皮膚組織の発達時間全体の傷の修復の質と解剖学的部位との間に有意な変動が存在します。人生の最初の2つの学期では胎児が瘢痕化せずに治癒します。しかし、上と成人期を通じて第三期から、傷を癒す人間。部位特異的な、年齢別に加えて、創傷治癒の違いが存在します。皮膚創傷内の瘢痕組織沈着が9重要である一方で、口腔内の傷は、最小限の瘢痕形成7,8を改造します。論争は、cを持続します年齢や場所10,11の両方に関しては、創傷治癒の結果に地元の線維芽細胞の固有の特性に対する環境の相対的な影響をoncerning。皮膚の真皮およびそれ以前の胚（E15）対以降の胚（E18）真皮対経口マウスの治癒に大きな違いを考えると、それは特定の発達年齢で、様々な解剖学的部位の中の線維芽細胞の集団における本質的な違いが存在している可能性があります。 1986年、ハロルドF.ドヴォルザークは、腫瘍が12を治癒しない傷ある仮定しました。ドヴォルザークは、腫瘍が体に傷のように動作し、ホストの創傷治癒応答を活性化することにより、それらの間質を誘導することを結論付けました。多くの研究があるため、癌腫13-15の進行への線維芽細胞の寄与を調べたが、創傷治癒、アイデンティティと皮膚のCAの間質コンパートメントに貢献する線維芽細胞の胚起源の場合のようにしていますrcinomasは十分に定義されていません。この質問への答えは、抗癌治療のための潜在的に16有効な標的として腫瘍関連線維芽細胞を曝露する最近の研究で与えられた医学的関連を負いません。 特定と将来を見越して、生体内で線維形成の可能性に恵まれ、線維芽細胞系統の単離を効果的に急性および慢性疾患状態の広い範囲にわたって損傷に対するそれらの応答を操作に向けて不可欠なステップです。 1987年には、コーマックは乳頭と真皮網状層17,18内の1内に存在する線維芽細胞の2亜集団、1つを示しました。三亜集団は、卵胞19,20の乳頭地域の毛包に関連する発見されました。培養した場合、これらの線維芽細胞サブタイプの展示成長性の違い、形態、および成長因子/サイトカインは21-24プロファイル 。 現在までに、研究では、線維芽細胞、彼を調べますterogeneityは、主に適切に生体内での線維芽細胞間の発達と機能的多様性を特徴づけるために失敗しています。これは、部分的には、培養線維芽細胞集団への依存ではなく、すべての線維芽細胞25で表される自己表面レセプターに基づいて、細胞培養または正の選択の均一化効果の結果です。私たちの研究室からの最近の研究では、深遠な表面マーカーと、この原稿26で提示FACSに基づく分離方法によって単離された未培養線維芽細胞対培養において転写シフトを示しました。 その後、我々は、マウスの背側真皮内の特定の線維芽細胞系統を同定し、 エングレイルド-1の胚式で定義されたこの系統は、背部皮膚における結合組織沈着の主な原因であることを決定しました。創傷治癒、癌間質形成を含む線維症の急性および慢性型の両方の間の系統機能、放射線は、線維症27を誘導しました。明確な線維芽細胞系統の特徴付けは、線維形成の動作を調節することを目的と治療のための重要な意味を持っています。 むしろ細胞単離28,29を達成するために、in vitroでの操作に依存している既存のプロトコルを使用するよりも、ここでは詳述収穫プロトコル（ 図1）は、より正確に生体内での表現型と行動を捕獲線維芽細胞の収量有益な分析をするのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>外科用鉗子、</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ、</td><td>ケントサイエンティフィ</td><td>ックINS600127</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン、ヨウ素調製液</td><td>、ダイナレックス</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>ナイール(脱毛クリーム)</td><td>チャーチアンドドワイト社</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム - 塩化カリウム (ACK) 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m フィルター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m フィルター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム(PI生存率染色剤)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

facsによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

線維芽細胞は、細胞外マトリックスを分泌する責任原則細胞型であり、多くの臓器や組織の重要なコンポーネントです。線維芽細胞の生理学および病理学は、複数の器官における線維症、肥厚性瘢痕以下の火傷、虚血後の心機能の喪失、および癌間質の形成を含む臨床実体、のスペクトルを基礎となっています。しかし、線維芽細胞は、主として、その固有の不均一性、細胞の特徴付けが乏しいタイプ残ります。線維芽細胞の単離のための既存の方法は、深く細胞表現型と動作に影響を与える細胞培養の時間を要します。その結果、線維芽細胞の生物学を研究する多くの研究は 、in vitroでの操作に依存していると正確に生体内で線維芽細胞の挙動を捕捉しません。この問題を克服するために、我々はpreserviそれによって、細胞培養を必要とせず、成体マウスの背部皮膚からの線維芽細胞を単離するためのFACSベースのプロトコルを開発しました生理的な転写および各セルのプロテオミクスプロファイルをngの。特定の表面マーカーを発現する線維芽細胞の亜集団の事前選択または濃縮を回避し、この異機種全体で可能な限り包括的であることをむしろポジティブ選択戦略よりも-私たちの戦略は、系統陰性ゲート（林）を介して非間葉系統の排除を可能にしますセルタイプ。

このアプローチ（ 図1）の有効性は、我々の最近の刊行物27に詳細に検討することができる多くの方法で確認されました。これらは、ソートされた細胞と細胞塊の免疫細胞化学と新鮮にソートされた細胞の単一細胞の転写の分析が含まれます。線維芽細胞のソートではなく、直接、より正確文化に頼ることは、それらのインビボ表現型をキャプチャします。系統陰性枯渇のアプローチ（ 図2A）よりもむしろポジティブ選択法を使用すると、特定の部分母集団の事前選択を避けることができます。このアプローチの価値は、最近Rinkevich らによって実証された。27、以前に記載されていない真皮のレベルでCD26陽性の線維芽細胞の存在を同定します。 培養線維芽細胞の処理は、遺伝子発現の有意な変化をもたらすことを確認するために、我々は、未培養線維芽細胞を培養した線維芽細胞を比較するためにマイクロアレイを使用します。我々は培養線維芽細胞それは、二つの技術、本稿でよく知られた組織外植片のプロトコル28で詳述ライブ収穫プロトコルにより...

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin vitro操作に依存しています。ここでは、細胞培養を必要としないマウス皮膚線維芽細胞の単離のためのFACSベースのプロトコルについて説明します。

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

この手順の全般的な目的は、FACSを用いて線維芽細胞を単離することであり、それによって、これらの細胞に表現型の変化を引き起こすことが示されているin vitro培養を回避することにあります。この手法は、瘢痕形成や線維化に関与する線維芽細胞のサブタイプをどのように特定するかなど、発生生物学や創傷治癒における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、線維芽細胞の表現型に影響を与えるプラスチックへの接着を伴うin vitro実験を回避できる点にあります。この手法は、真皮線維芽細胞に関する知見を得るだけでなく、腹膜線維芽細胞や腹腔内癒着などの他の系にも適用可能です。まず、対象となるマウスの背部皮膚を剃毛し、除毛します。次に、除毛したマウスを70% ethanolに浸し、清潔で滅菌された表面に置いて乾燥させます。次に、尾の付け根から開始し、ピンセットで皮膚を tents（持ち上げ）して、解剖用はさみで横方向に切開します。その後、筋膜上の平面に沿って剥離し、背側組織を採取します。60 by 100 mm の皮膚を採取した後、メスの鈍い方の縁を使用して、皮下脂肪を慎重に取り除きます。次に、採取した皮膚をベタジンで洗浄し、続いて氷上でPBSによる洗浄を5回行います。カミソリの刃と解剖用ハサミを用いて、滅菌ディッシュ内で真皮の断片を、サンプルが均一に約2〜3 mmの大きさになるまで細かく刻みます。その後、最大5匹のマウスから得られた組織断片を、DMEMで希釈したcollagenase 4を20 mL含む適切な数の個別の50 mLコニカルチューブに移します。サンプルを37°Cで激しく攪拌します。1時間後、チューブを滅菌フードに移し、組織片を針のない10 mLシリンジで3〜5回吸い上げ、吐き出し（ピペッティング）を行います。その後、サンプルをシェーカーに戻してさらに30分間攪拌し、再び10 mLシリンジを用いて3〜5回ピペッティングを行います。次に、サンプルを100 micronのストレイナーでろ過して新しい50 milliliterチューブに移し、FBSを添加したdmem 20 millilitersを用いて、全量が40 millilitersになるまでメッシュを洗浄します。続いて、細胞を遠心分離し、滅菌済みガラスピペットを用いて上層の脂肪層を吸引除去します。混入した脂肪組織が除去されたら、新しいガラスピペットを用いて残りの上清を取り除き、ペレットを20 millilitersのdmemおよびFBSに再懸濁します。次に、細胞を75 µmのストレイナーでろ過し、メッシュを10 mLのDMEM plus FBSで洗浄します。その後、先ほど示した通りに細胞を再び遠心分離し、脂肪分と上清を除去します。ペレットを20 mLのFACSバッファーで再懸濁し、未染色のコントロール用に5 mL分を分注して取り分けておきます。次に、残りのサンプルを遠心分離し、上清を除去してペレットを氷上に置きます。FACSで線維芽細胞を単離するために、ペレットを500 µLのリネージ抗体インキュベーションミックスに懸濁し、氷上で保持します。20分後、DNaseを添加した5 mLのFACSバッファーを細胞に緩やかに混ぜ合わせ、遠心分離します。ペレットをさらに5 mLのDNaseで洗浄します。次に、細胞を500 µLのFACSバッファーおよびDNaseに再懸濁し、生存率染料のコントロール用に50 µLのアリコートを分取しておきます。最後に、残りのサンプルに生存率染料を加え、ダイアグラムに従って細胞を分取します。ポジティブセレクション（陽性選択）法ではなくリネージネガティブデプレッション（系統陰性除去）法を用いることで、特定のサブポピュレーションを事前に選択することを回避できます。トランスクリプトームマイクロアレイ解析の結果、ライブハーベスト法および組織外植片法により単離された培養線維芽細胞は、ピアソン積率相関係数が0.92であり、トランスクリプトーム全体で高い類似性を示すことが明らかになりました。対照的に、培養線維芽細胞はライブハーベストされた非培養線維芽細胞とは有意に異なっており、培養線維芽細胞よりもライブハーベストされた線維芽細胞を解析することの重要性が示されました。この手法の開発後、発生生物学および創傷治癒の分野の研究者が、線維芽細胞の不均一性を確認し、瘢痕形成やその他の形態の線維症に関与するサブポピュレーションを特定することが可能となりました。

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

癌関連線維芽細胞（CAFS）は増殖、血管新生、炎症を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を容易にします。ここでは、表面マーカーとしてPDGFRαを使用して、細胞選別により新鮮なマウスおよびヒト組織由来正常線維芽細胞とCAFSの純粋な集団を単離するための方法を説明します。...

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

このビデオでは、出生後のマウスの子犬の皮膚からメラノサイトと線維芽細胞を同時に分離して培養する迅速な方法を説明しています。これらの細胞は、in...

初代マウスメラノサイトおよび線維芽細胞の迅速培養:マウス皮膚サンプル全体からのメラノサイトおよび線維芽細胞の単離

成体幹細胞の生物学を研究するための理想的なモデルは、マウスの毛包です。ここでは、マウスの背側皮膚の酵素消化とそれに続くFACS分析を使用して、毛包幹細胞と表皮ケラチノサイトの異なる集団を分離するためのプロトコルを紹介します。...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

この原稿は、ヒトの皮膚から乳頭線維芽細胞および網状繊維を単離するための FACS ベースのプロトコルを記載している。それは、explant...

蛍光活性化細胞選別によるヒトの皮膚からの乳頭状および網状線維芽細胞の単離

このプロトコルは、0〜4日前マウスの皮膚からメラノサイトおよび線維芽細胞培養物を同時に生成する迅速な方法を概説する。これらの一次培養は、皮膚細胞生物学、色素沈着、創傷治癒および黒色腫を含む様々な生理学的に関連するプロセスを研究するために、インビトロで維持および操作することができる。...

原発性マウスメラノサイトと線維芽細胞培養の急速な生成

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。...

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。...

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。...

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

このプロトコルは、老化マウスの涙腺を解離し、単一細胞RNAシーケンスのための生存可能な単一細胞を得る最適化方法を説明しています。逐次酵素的消化と穏やかな取り扱いにより細胞の完全性が保たれ、細胞型特異的分離や加成に伴う涙腺集団の変化のトランスクリプトミック解析に適した高品質な懸濁液が得られます。...

高齢の乳腺および唾液腺からの単細胞解離、RNA配列決定、および線維芽細胞の単離プロトコル

学ぶFACSを用いたマウス皮膚線維芽細胞の分離法。in vitro培養を省略し、表現型変化を防ぎながら線維芽細胞を単離できます。創傷治癒や線維症の研究に応用可能です。

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

さらに動画を探す