FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

この手順の全体的な目標は、FACSを使用して線維芽細胞を単離することであり、それによって、これらの細胞に表現型の変化を引き起こすことが示されているin vitro培養を行いません。この方法は、瘢痕化や線維化に関与する線維芽細胞のサブタイプをどのように特定するかなど、発生生物学や創傷治癒における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitro実験がプラスチックへの付着、線維芽細胞の表現型への男性の付着として回避されることである。

この方法は、真皮線維芽細胞に関する洞察を提供するだけでなく、腹膜線維芽細胞や腹部癒着などの他のシステムにも適用できます。まず、目的のマウスの背側の皮膚を剃り、脱毛します。次に、むき出しにしたマウスを70%エタノールに浸し、動物を清潔で無菌の表面に置いて乾かします。

次に、尾の付け根から始めて、鉗子を使用して皮膚をテント張り、解剖はさみで横方向に切り込みます。次に、上膜面に沿って解剖して背側組織を採取します。60 x 100ミリメートルの皮膚片を取り除いたら、メスの鈍い端を使用して、皮下脂肪を慎重に取り除きます。

次に、採取した皮膚をベタジンですすぎ、続いて氷の上で5回のPBS洗浄を行います。カミソリの刃と解剖ハサミを使用して、サンプルのサイズが均一に約2〜3ミリメートルになるまで、滅菌皿で真皮の部分をミンチにします。次に、最大5匹のマウスの組織断片を、dmem中に20ミリリットルのコラゲナーゼ4を含む適切な数の個々の50ミリリットルの円錐管に移します。

サンプルを摂氏37度で激しく攪拌します。1時間後、チューブを滅菌フードに移し、組織を不必要な10ミリリットルの注射器に3〜5回通過させます。サンプルをさらに30分間シェーカーに戻し、続いて10ミリリットルの注射器でさらに3〜5本のピペットを戻します。

次に、100ミクロンのストレーナーでサンプルをろ過して新しい50ミリリットルのチューブに入れ、メッシュを20ミリリットルのdmemで洗浄し、FBSを添加して総容量を最大40ミリリットルにします。次に、細胞をスピンダウンし、滅菌ガラスピペットを使用して上部脂肪層を吸引します。汚染された脂肪部位が除去されたら、新しいガラスピペットを使用して残りの上清を取り除き、ペレットを20ミリリットルのdmemとFBSに再懸濁します。.

次に、75ミクロンのストレーナーで細胞をろ過し、10ミリリットルのdmemとFBSでメッシュをすすぎます。次に、細胞を再度スピンダウンし、先ほど示したように脂肪と上清を取り除きます。ペレットを20ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁し、未染色のコントロールのために5ミリリットルのアリコートを確保します。

次に、残りのサンプルをスピンダウンし、上清を捨てて、ペレットを氷の上に置きます。FACSによって線維芽細胞を単離するには、ペレットを氷上の500マイクロリットルの系統抗体インキュベーションミックスに再懸濁します。20分後、DNaseを添加した5ミリリットルのFACSバッファーを細胞と穏やかに混合し、スピンダウンします。

ペレットを2番目の5ミリリットルのDNaseで洗浄します。次に、細胞を500マイクロリットルのFACSバッファーおよびDNaseに再懸濁し、生存率色素制御のために50マイクロリットルの細胞アリコートを確保します。最後に、残りのサンプルに生存率色素を添加し、図に従って細胞を選別します。

正の選択アプローチではなく、系統の負の枯渇アプローチを使用すると、特定の亜集団の事前選択を回避できます。プルトランスクリプトームマイクロアレイ解析により、ライブハーベスト法および組織外植片法によって単離された培養線維芽細胞は、トランスクリプトームワイドレベルで高い類似性を持ち、ピアソン積-モーメント相関係数が0.92であることが明らかになりました。比較すると、培養された線維芽細胞は、採取された生きた未培養の線維芽細胞と大きく異なり、培養された線維芽細胞よりも生きた採取された線維芽細胞を分析することの重要性が確立されました。

開発後、この技術は、発生生物学と創傷治癒の分野の研究者が線維芽細胞の不均一性を確認し、瘢痕化やその他の形態の線維症の原因となる亜集団を特定するための道を開きました。