January 14th, 2016
Lateral Root Inducible System(LRIS)は、側根の同期誘導を可能にし、シロイヌナズナとトウモロコシに提供されます。
側根誘導システムの全体的な目標は、ホルモン処理を使用して植物の側根の開始を同期的に誘導することです。植物の根は隠れており、研究が非常に難しいことが知られています。私たちは、細胞学的、組織学的、および分子レベルで側根開始のプロセスを研究できるin vitroシステムを開発しました。
一般に、この方法に不慣れな科学者は、植物が培地と適切に接触して成長しておらず、側根の均質な誘導が妨げられているため、苦労する可能性があります。この方法を視覚的に示示することで、均質な誘導を確実にするために考慮すべき重要なステップを示します。このシステムはもともと小さな植物であるシロイヌナズナで開発されましたが、トウモロコシ、米、大麦などの他のシステムにも適用できます。
まず、20ミクロンのナイロンメッシュをNPA添加増殖培地に滅菌ピンセットを使用して塗布します。ドリガルスキーを使用してメッシュを成長培地にそっと押し込み、培地としっかりと接触していることを確認します。次に、滅菌爪楊枝を寒天につまんで、爪楊枝に粘着性のある表面を作成します。
つまようじを使用して、ガス滅菌した種子のバッチを準備したプレートに均等に分配します。プレートを通気性のある粘着テープで密封し、暗所で摂氏4度で少なくとも2日間、最大1週間保管します。これは成層化に必要であり、同期した効率的な発芽を保証します。
3日目に、プレートを成長室に移し、2日間の発芽と3日間の成長を80〜90度の角度で行います。8日目に、メッシュと完全に接触して成長した根と、逆にメッシュと接触していない根を特定します。根がメッシュに接触していない苗をすべて取り除きます。
苗を含むメッシュを10マイクロモルNAAを添加したプレートに移します。プレートに載せたら、必要に応じてメッシュを培地表面にすくい取り、成長培地としっかりと接触していることを確認します。すべての苗木で均質な誘導を確保するには、NPA添加培地でメッシュと接触して成長しなかった苗木を廃棄し、必要に応じてNAA添加培地でメッシュを適切にスキミングすることが重要です。
新しいプレートを通気性のあるテープで密封し、導入後、成長室に垂直位置で必要な時間置きます。サンプルを収集する準備ができたら、メスを使用してメッシュ上で直接ルートセグメントを一度にすべてカットし、メッシュの表面をそっとこすり取ってサンプリングします。次に、トウモロコシの側根誘導システムのいくつかのステップを示します。
まず、必要な数の穀粒を滅菌ガラスビーカーに入れて、トウモロコシの穀粒を滅菌します。次に、ビーカーに100ミリリットルの6%次亜塩素酸ナトリウムを水に加え、マグネチックスターバーを追加します。ビーカーをマグネチックスターラーに置き、室温で5分間低速で攪拌します。
漂白剤溶液をそっと取り除きます。それを100ミリリットルの新鮮な滅菌水と交換し、カーネルを5分間すすぎます。この手順を 5 回繰り返します。
手袋をはめ、2枚のハンドペーパータオルをはがし、清潔な面に重ねて置きます。次に、シートを長さにわたって二重に折ります。ピンセットを使用して、各カーネル間の間隔を8センチメートル、両端で8センチメートルの空けを保ちながら、紙の全長にわたって、上部から約2センチメートルのところに10個のカーネルを分散させます。
カーネルのラジカルが下を向いて紙の方を向いていることを確認してください。種子を所定の位置に保持しながら、紙を長さにわたってそっと転がします。紙に滅菌水をスプレーすると、必要に応じてこの手順が容易になります。
ロールを滅菌したガラス管に入れ、追加の管をラックに組み合わせます。チューブ内のロール紙に125ミリリットルの50マイクロモルNPA溶液を注ぎます。ロール紙が溶液を吸収し、完全に浸します。
ロール紙システムをグロースキャビネットに3日間置きます。インキュベーション中にロール紙が浸漬されたままになるように、必要に応じてNPA溶液を追加してください。側根開始の均質な誘導を確実にするためには、ロール紙がNPA溶液中で保湿されたままであること、しかし根が液体自体に沈んでいないことを確認することが重要です。
NPAで3日後、トウモロコシの苗は小さな芽と約2〜3センチメートルの根を持っています。4日目に、ロール紙から残りのNPA溶液の大部分を静かに絞り出し、ロールが飽和するまで滅菌水に入れます。約5分後、ロール紙からほとんどの水をやさしく絞り出します。
洗浄手順を3回繰り返します。最後のすすぎ後、ほとんどの水を絞り出し、チューブに戻します。NAAの50マイクロモル溶液をチューブ内のロール紙に注ぎ、完全に浸
るまで注ぎます。次に、ロール紙システムを誘導後、希望の期間グロースキャビネットに配置します。NAAで生育していない、またはNAAで1時間生育した牛応答マーカー系統pDR5-GUSの苗木と比較して、NAAで2時間生育した苗木は、側根開始を引き起こす最初のイベントの1つである牛応答を示します。これらの分裂は、約 2 時間から先端から上に移動し始め、NAA に長時間さらされると増加します。
細胞周期マーカー株pCYCB1を使用する;1-Gusは、側根形成につながる最初の細胞分裂がNAA治療開始から約6時間後に開始されます。マイクロアレイと定量的rt-PCRは、側根誘導中のシロイヌナズナとトウモロコシの根のさまざまな領域にわたるさまざまな遺伝子の発現を評価するために使用できます。シロイヌナズナとトウモロコシの両方で、植物が長期間成長すると、誘発された分裂により、側根の発達と成長が生じます。
トウモロコシに関するシステムの概念実証として、比較のためにさまざまな条件下で育てられた苗木を以下に示します。水上で10日間育てられた苗木は、側根が同期して開始されず、軸に沿って広く間隔が空いています。NPAで10日間育てた苗木には、側根がまったく含まれていません。
NPAで3日間育てた苗木とNAA処理を行ったところ、側根の大規模で同期した誘導が見られます。このビデオでは、根の分岐のプロセスに関する基本的な新しい洞察の発見に非常に重要であることが判明した側根誘導システムのセットアップ方法を示しました。シロイヌナズナとトウモロコシでどのように機能するかを示しましたが、選択した他の植物種にも簡単に適応できます。
がんばって。
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側根誘導システム(LRIS)は、植物、特にアラブイデプシス・タリアナとトウモロコシにおいて側根の同期誘導を可能にします。この革新的なインビトロシステムは、様々な生物学的レベルでの側根形成の研究を促進します。
The Lateral Root Inducible System (LRIS) enables highly controlled, synchronous induction of lateral root initiation in Arabidopsis and maize, overcoming the unpredictability of natural root development. This system provides a robust platform for dissecting developmental pathways and gene function in plant models, supporting translational research and comparative genomics. Its adaptability across species positions LRIS as a reusable capability for pipeline-wide functional validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology R&D.
LRIS integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing and gene function analysis to preclinical validation of developmental pathways in plant models.