Name: 側根誘導系でシロイヌナズナとトウモロコシ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ側根誘導系を用いた植物根の発生機構の研究法。シロイヌナズナとトウモロコシで同期誘導を実現し、細胞・組織レベルで側根形成を解析する革新的なin vitroシステムを解説します。

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著者は、技術支援と写真撮影のためにDavy Opdenackerに感謝します。原稿を改善するための有益な提案をくださったAnnick Bleys博士に大いに感謝します。この研究は、ベルギー連邦科学政策局のInteruniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS'、FWO助成金G027313N、およびIWT(IR)によるイノベーション庁から資金提供を受けました。

1. シロイヌナズナ LRISプロトコル注：テキストは、「小」または「大」規模の実験を指します。そのようなマーカーのライン分析および組織学的染色6、14のような小さな規模の実験では、わずか数のサンプルを必要とします。そのような定量的リアルタイム定量RT-PCR、マイクロアレイ9-11またはRNA配列決定のような大規模な実験は、サンプルのより大きな量を必要とします。このように、サンプル当たり〜1000年苗の量は、ルートセグメントの解剖後にマイクロアレイ実験を行うためにVanneste ら 11で使用されていました。 1日目 <ol><li> シロイヌナズナの種子の殺菌 注：種子消毒のための次の手順のいずれかを選択します。それらのいずれかのプロトコルの次のステップのために適しています。ガス滅菌（1.1.2）は、液体殺菌（1.1.1）上の2つの主な利点を提供する：大規模な麻痺を取り扱う際にはあまり時間がかかります種子のER、何のピペット操作は、個々のサンプルのために発生することがないので、滅菌種子は、より長い期間保存することができます。しかし、デシケーターと慎重な取り扱いが必要です。 <ol><li> 液体滅菌 <ol><li>マイクロ遠心管における種子の所望の数を注ぎます。 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1.5mlチューブ中の20mg（〜800種子）または40mgの（〜1600種子）まで使用します。 </li><li> 70％エタノール1 mlを加え。反転または軽く2分間振ります。 </li><li> 15分間1mLの滅菌溶液で70％エタノールを交換してください。 （新鮮な滅菌溶液を調製する：3.85ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム（NaOC​​lを）株式（12％）（注意：使用ヒュームフード）、5μlのトゥイーン20を、水で10mlまでのすべての種子が来ることを確認するために、チューブを数回反転します。溶液と接触しました。 </li><li>層流キャビネット中で、1 mlの滅菌蒸留水を消毒液を交換し、繰り返しによって5分間の種を5回すすぎLY新鮮な滅菌蒸留水1mlで置き換えます。 </li></ol></li><li> ガス殺菌 <ol><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブにシードの所望の数を注ぎます。いくつかの独立したラインで作業する場合、個々のチューブを使用し、それらをプラスチック微量遠心管ボックスまたはホルダーにオープンしたアレンジ。一本のチューブ内のシードの数は、500（12.5 mg）を超えた場合、成功した滅菌を確実にするために、チューブの適切な数の種を細分化。近隣のチューブのキャップがお互いをカバーしていないことを確認してください。それは殺菌のためだけでなく、デシケーター中であることが必要であるとして、底の箱の蓋を一緒にフィット。 </li><li>ガラスビーカー（：使用ドラフトチャンバー注意）とともに、デシケーターのボウルに箱を置きます。 </li><li> 12％のNaOCl（：使用ドラフトチャンバー注意）100mlの入ったビーカーを埋めます。デシケーターに蓋を置くが、ビーカーが置かれている小さな開口部を残します。 </li><li> 37％塩酸3mlの（発煙）（CAUを追加TION：小さな開口を通してビーカーにヒュームフード）を使用し、迅速にデシケーターを閉じます。 Cl 2ガスの形成に起因するいくつかの時間のためのソリューション意志バブル。 O / Nを閉じた（または少なくとも8時間）システムのままにしておきます。 </li><li>デシケーターの蓋を外します。箱を取り出し、輸送中の汚染を避けるために蓋でそれをカバーしています。 </li><li>層流キャビネットのボックスを入れ、ふたを取り外し、ガス放出を可能にするために、室温で約1時間の種を残します。 注：種子を安全に4℃で最大2週間、閉鎖ミクロ遠心管中の乾燥を格納することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> シロイヌナズナの側根の誘導 <ol><li> 側根の阻害（NPA処理） <ol><li> in vitroでの成長のための成長培地を準備します。培地の半分強ムラシゲ・スクーグ塩混合物15、0.1グラム/ Lのミオイノシトール、10グラム/ Lのスクロースを含み、0.5で緩衝されていますG / L 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）。 </li><li> 1 M KOHで5.7にpHを調整します。植物組織寒天を8g / Lを加え、121℃で20分間、培地をオートクレーブ。 </li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）（：使用手袋注意）NPAの25 mMストック溶液を調製します。層流キャビネット中で、（ボトルを手で保持することができる温度である）が約65°Cまでオートクレーブ培地を冷却し、10μMNPAの最終濃度を得るために、25 mMのNPAストック溶液を加えます。 </li><li>静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ（12センチメートル×12センチ）あたりの培地50mlを注ぎます。 注：大規模な実験の場合には、容易な移動を確保するためにナイロンメッシュ（20ミクロン）を適用します。オートクレーブ処理（ 図1A）のためのメッシュ（9センチメートル×9センチ）を準備。オートクレーブ処理した場合には、無菌のピンセット（ 図1B）を使用して、増殖培地にメッシュを適用します。静かにSTEを使用して増殖培地にメッシュをプッシュそれは成長培地（ 図1B）（：無菌状態での作業注意）との良好な接触にあることを確認するrilized drigalsky。 </li><li> NPA-プレート上の種をまきます。 注：場合は、大規模な実験が予定されている、（1.2.2.3を参照）2緻密でサンプリングを容易にするための50個の種子のよく整列行まきます。 <ol><li>液体の滅菌の場合は、200μlのピペットを用いて、NPA-プレート上に種をまきます。種子をピペットすることができるようにするために無菌状態でのピペット先端の終わり（または先端の滅菌前）の4ミリメートル - 3をカット。ピペットアップや種子を再懸濁するために数回ダウンは、その後10で約150μlの滅菌水をピペット - 20種子や先端の下部にある種子の堆積物まで待ちます。 （注意：無菌状態での作業） 注意：先端で軽く寒天またはメッシュをタッチすると、シードと水の低下はそれから解放されます（ 図1C）。 </li> &lt;ガス滅菌の場合、Liが&gt;、粘着性表面を確保するために種子を取る前にオートクレーブしtoothpicks.Pinchに寒天につまようじを使用して種をまきます。種子に爪楊枝を使用して1つずつピックアップし、プレート上の種子を配布する（ 図1D）。また、種子に滅菌水を追加し、1.2.1.5.1（注意：無菌状態での作業）に記載されているように種をまきます。 </li></ol></li><li>通気性粘着テープでプレートを密封し、それらに少なくとも2日、最大1週間暗所で4℃でプレートを保存します。これは、層別化し、同期を保証し、より効率的な発芽のために必要とされます。 注：また、種子がより少ない冷蔵庫のスペースを必要とする、播種前成層マイクロ遠心管中で蒸留水に浸漬することができます。この場合には、4℃で少なくとも1週間のチューブを格納し、直ちに（1.2.1.7参照）を播種した後、成長キャビネットにプレートを移動させます。 3日目 </LI&gt; <li>ほぼ垂直の位置（80〜90°）で5日（発芽と成長の3日の2日間）成長キャビネット（連続光（110μEmを-2秒-1）、21°C）にプレートを移動のではなく、培地中の根の成長を確保します。 8日目 </li></ol></li><li> 側根誘導（NAA処理） <ol><li> 1.2.1.1と1.2.1.2で説明したのと同じ成長培地を準備します。 （：使用手袋注意）DMSO中のNAAの50 mMストック溶液を調製します。 65℃までのオートクレーブ処理中に冷却し、10μMNAA（注意：無菌状態での作業）の最終濃度を得るために、培地にNAAのソリューションを追加します。 <ol><li>静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ（12センチメートル×12センチ）あたりの培地50mlを注ぎます。 </li></ol></li><li>これらのSUPに10μMのNPAを補足した成長培地を含むプレートから苗を転送10μMNAAとplemented。 <ol><li>苗の子葉の下に曲がったピンセットの腕を引っ掛け、ゆっくりプレートから取り外します。唯一の根が完全に好ましくは下向きNPA-増殖培地とに接触して成長しているの苗を移します。 </li><li>小さな距離にわたってNAAを含む成長培地の表面上にルートをすくい取ります。植物の根は成長培地との良好な接触状態にあることを確認します。必要に応じて、ピンセットで穏やかに成長培地表面へのルートを押してください。 注：大規模な実験の場合には、ピンセットを持つ2つの上部の角にメッシュを持ち上げてメッシュと転送と接触していないすべての苗を削除します。メッシュが小さな距離（ 図1E）の上に寒天表面上にメッシュをスキミングすることにより、NAAを含む培地との良好な接触状態にあることを確認します。 </li></ol></li><li>通気性のテープで新しいプレートを密封し、成長キャビネットに配置します（コンサンプリングまでの誘導後の所望の時間のための垂直位置にあるtinuous光（110μEmを-2秒-1）、21℃）。 注：大規模な実験の場合には、メッシュ上のすべてを一度に直接ルート・セグメントをカットし、軽くメッシュの表面をこすることによって、それらをサンプリングするためにメスを使用しています。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRISトウモロコシプロトコル<ol><li> トウモロコシカーネルの階層化 <ol><li>少なくとも1週間、暗所で4℃でトウモロコシ穀粒をインキュベートします。 注：このプロトコルは、B73トウモロコシ近交系を使用して開発されてきました。 </li></ol></li><li> トウモロコシカーネルの滅菌 1日目 注意：トウモロコシの苗は、無菌状態で増殖させることはありませんが、それはロール紙での真菌の増殖を防止するために、トウモロコシ穀粒を殺菌し、滅菌材料で作業することをお勧めしますシステム。 <ol><li>滅菌ガラスビーカーにトウモロコシカーネルの必要な数を入れてください。 </li><li>滅菌溶液100ml（6％水中の次亜塩素酸ナトリウム）（：使用ドラフトチャンバー注意）を追加します。 </li><li>磁気攪拌棒を加え、室温で5分間低攪拌速度（約250 rpm）で磁気撹拌機にビーカーを置きます。 </li><li>新鮮な滅菌水100mlでソリューションを置き換えることにより、5分間、5回洗浄します。 </li></ol></li><li> トウモロコシカーネルを蒔きます <ol><li>汚染のリスクを軽減し、ペーパータオルのロールを取るために手袋を着用してください。 </li><li> 2枚（約92センチメートル×24センチ）の長さの合計とハンドタオル紙の2ストレッチを切り取り、きれいな表面（ 図2A）に互いの上にそれらを配置します。 </li><li>シートは、長さ（約92センチメートル×12センチ）（ 図2A）の上に二つ折り。 </li><li>トン以上の上部から約2cmで10のカーネルを配布するためにピンセットを使用して、彼の紙の全体の長さ、両端（ 図2B）で無料各カーネルと8センチメートル間に8cmの隙間を維持しながら。カーネルの幼根がダウンと紙（ 図2B）を向いていることを確認します。 </li><li> （ 図2B）の場所に種を維持しながらゆっくりと、長さにわたって紙をロールバックします。ローリングを促進するために、それは最初に滅菌水で紙をスプレーするオプションです。 </li><li>約6センチ、直径14センチ、高さ（例えば、250ミリリットル遠心管）の滅菌ガラス管にロール紙を入れて、ラック（ 図2C）に配置します。 </li></ol></li><li> トウモロコシにおける側根の誘導 <ol><li> （DMSOに溶解）の50mM NPA原液（：使用手袋注意）を準備。 </li><li>各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNPAストック溶液から125μLを添加することにより、50μMのNPAソリューションを作ります。 </li><li>よく混ぜ、チューブ内のロール紙の上に、50μMNPA液の125ミリリットルを注ぎます。ロール紙は、ソリューションを吸収し、完全に浸しになります。 注意：他の寸法のロール紙とチューブを使用する場合は、それに応じて音量を調整します。液体は、十分な取り込みを確保するために途中でチューブに到達する必要があります。 </li><li> 3日（27℃、連続光、相対湿度70％）の成長キャビネットにロール紙システムを配置します。ロール紙は、ソリューションが（ 図2D）時間をかけて蒸発するので、余分な50μMのNPA溶液を添加することにより浸したままであることを確認してください。 4日目 </li><li> （DMSOに溶解）、50mMのNAA原液（：使用手袋注意）を準備。 </li><li>各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNAAストックから125μlのを追加することで、50μMのNAA液を調製。 </li><li>ゆっくりと紙ロールから残りNPAソリューションのほとんどを絞り出すと場所（：使用手袋注意）それを洗い流すために5分間滅菌水中メートル。ゆっくりと紙ロールからほとんどの水を絞り出します。この洗浄工程を3回繰り返します。 </li><li>十分に混合し、チューブ内の用紙ロールオーバー、50μMのNAA液を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。 </li><li>誘導後の所望の期間の成長キャビネット（27℃、連続光、相対湿度70％）にロール紙システムを配置します。 </li></ol></li><li> トウモロコシの不定冠根における側根の誘導 注：上記のLRISとしては、プライマリルートに側根を誘導します。しかし、トウモロコシおよび他の単子葉植物、プライマリルートおよび胚種子根に、一緒に彼らの側根で、開発苗の間に主に重要です。植物の成長の後の段階では、後胚不定根が茎に発生し、また、新しい根系16を形成するために、側根を開発しています。 LRISも使用することができますdは、胚主要ルートにLRISにいくつかのマイナーな調整に従うことによって、これらの後胚不定冠根の側根を誘導しました。 <ol><li>ロール紙を作るために、それぞれ外側にハンドタオル紙の二つの層、および内で発芽紙の2層を有する紙のサンドイッチを作成します。発芽紙の2枚の間に（ステップ2.1〜2.2を参照）滅菌カーネルを配置します。ハンドタオル紙に比べて発芽紙は、紙の開口部は、後に容易に転がるようになりますこれは、根毛と側根が貫通しにくいでしょう。一方、ハンドタオル紙の2つの外部層は、液体の吸収を促進します。 </li><li> 700ミリリットルのガラス管にロールを挿入し、それらの上NPAずに滅菌水を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。 </li><li>成長キャビネットに滅菌カーネルを発芽（ステップ2.4​​.9を参照）。 </li><li>不定冠根まで苗を育てます（B73のために6日）出現し始めます。ロール紙が必要なときに滅菌水を添加することにより、常に湿った保たれていることを確認します。 </li><li> 4日間、25μMNPA溶液に移す（ステップは2.4.4に2.4.1を参照）、洗浄工程の後、50μMのNAA液でNPAソリューションを置き換えることにより、側根開始の同様の誘導に続いて（ステップ2.4​​を参照してください2.4.9に0.5）。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

シロイヌナズナ LRISプロトコルでは、それが唯一の完全NPAを含む成長培地と接触して成長した実生を転送することが重要です。これは、側根の開始は全体の根の長さの上にブロックされることを保証します。転送中の小植物を傷つけないようにするために、湾曲した鉗子のアームは、苗の子葉の下に引っ掛けることができます。転送時には、苗の根はNAAを含む寒天培地と十分に接触していることを確認してください。これは、小さな距離で寒天表面上でルートをスキミングすることにより達成することができます。これは、総根長にわたって側根開始の効率的な同期誘導を保証します。根は、負にその成長と側根の誘導に影響を与えることなく、光に曝露成長させることができます。 トウモロコシLRISプロトコルでは、カーネルの幼根は、Dが成長するルートを確保するためにダウンして、紙に向いていることが重要ですownwards、正しい側16に紙に付着します。 NPA処理の3日後、苗は小さなシュート、プライマリルートおよび種子根16をカーネルから浮上している必要があります。プライマリ...

それが土壌から、足場と水と栄養素の摂取を保証するため、根系は、植物の成長のために重要です。根系の拡大は主に側根の生産に依存しているため、その開始及び形成が広く研究されています。側根は、創業者セル 1と呼ばれる、鞘細胞の特定のサブセットに開始されます。トウモロコシなどの単子葉植物に、それらは師部の極3に見られるのに対し、このようなシロイヌナズナなどのほとんどの双子葉植物では、これらの細胞は、原生木部の極2に配置されています。創始細胞は、特定の細胞周期遺伝子の発現に続いて増加オーキシン応答4、でマークされている（例えば、 サイクリンB1; 1 / CYCB1; 1）、その後、彼らは非対称背斜部門5の第1ラウンドを受けます。協調背斜と周縁部門の一連の後、側根の原基は、最終的にAと出てくるように形成されていますutonomous側根。これらのイベントが豊富でも同期でもないので、側根開始の位置とタイミングは、しかし、予測可能ではありません。これは、このプロセスを研究するためのトランスクリプトミクス、分子的アプローチの使用を妨げます。 これに対処するには、側根誘導系（LRISは）7,6を開発してきた。このシステムでは、苗を最初に結果的に側根の開始を阻止する、オーキシン輸送と蓄積を阻害するN -1-ナフチルフタラミン酸（NPA）で処理されています8。その後、合成オーキシン1-ナフタレン酢酸（NAA）を含む培地に苗を転送することによって、全体の鞘層が、それによって大量の細胞分裂6を開始する側根を誘導上昇オーキシンレベルに応答します。このように、このシステムは、後半の特定の段階について濃縮根サンプルの容易な収集を可能にする、高速同期と豊富側根のイニシエーションにつながりますRALルート開発。その後、これらのサンプルは、側根形成の間のゲノムワイドな発現プロファイルを決定するために用いることができます。 LRISは、側根のシロイヌナズナの開始とトウモロコシ9-13について、すでにかなりの知識が得られましたが、より多くのゲノムが配列決定されており、経済的な重要に知識を伝達する関心の高まりがあるとして、他の植物種にこのシステムを適用する必要性がより明らかになり、種。 ここでは、 シロイヌナズナやトウモロコシLRISsの詳細なプロトコルが与えられています。次に、システムの使用例は、トウモロコシLRISから得られたトランスクリプトミクスデータが異なる植物種間側根開始時に保存された機能を持つ機能的ホモログを同定するために使用することができる方法を示すことによって、提供されます。最後に、他の植物種のためLRISを最適化するためのガイドラインが提案されています。

<table><tbody><tr><td><強い>シロイヌナズナの LRIS</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強い>種子</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シロイヌナズナの種子</td><td></td><td></td><td>Col-0 エコタイプ</td></tr><tr><td><強い>ガス滅菌 種子の</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離管 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>エッペンドルフマイクロチューブ 3810X, PCR クリーン</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>エッペンドルフ セーフロック マイクロ遠心チューブ</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルク KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (発煙) 分析用 EMSURE ACS,ISO,Reag.Ph Eu</td></tr><tr><td>ガラスデシケーター</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>パイレックス</td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックマイクロ遠心チューブ ボックスまたはホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach Sterilization of seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>エタノール、abs. 100% a.r. 70%</td></tr><tr><td>に希釈次亜塩素酸ナトリウム (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成長培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>ミオイノシトール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>VWR、国際LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-スクロースPh。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td>分析用1050211000ペレット(最大 0.002% Na) EMSURE ACS、ISO、Reag.Ph Eur</td></tr><tr><td>植物組織培養 寒天</td>培地 <td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>側根誘導薬品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-ナフチルフタラム酸 (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>番号 N0926.0250</td><td>10 &M (シロイヌナズナ</td></tr>)<tr><td>1-ナフタレン酢酸 (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>番号 N0903.0050</td><td>10 &micro;M (シロイヌナズナ)</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>転写用メッシュの作成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>合成ナイロンメッシュ 20 &micro;m</td></tr><tr><td>播種および苗の取り扱い</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正方形のペトリ皿プレート</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml デュランチューブ</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp;50 mlの遠心分離管</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カット ピペットのヒント</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>ユニバーサル 200、オートクレーブ前に5 mmの先端をカット</td></tr><tr><td>通気性テープ&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>カタログ番号 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1;K344.1</td><td>デュモンピンセットタイプanr5;デュモンピンセットタイプenr7</td></tr><tr><td>growth条件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growthルーム</td><td></td><td></td><td>21&deg;C、連続光</td></tr><tr><td><強い>材料</強い></td><td><強い>会社</強い></td><td><強い>カタログ</強い></td><td><強い>コメント</強い></td></tr><tr><td><強い>トウモロコシLRIS</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強い>種子</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トウモロコシカーネル</td><td>B-73</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>クラックの漂白滅菌</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強力>側根誘導化学薬品</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-ナフチルフタラム酸 (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>番号 N0926.0250</td><td>50 & マイクロ;M(トウモロコシ一次根)、25&micro;M(トウモロコシ不定根)</td></tr><tr><td>1-ナフタレン酢酸(NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>番号 N0903.0050</td><td>50 &micro;M (トウモロコシ)</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sowing and Seedling Handling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペーパーハンドタオル</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fiers NV / SA</td><td>K342.1;K344.1</td><td>デュモンピンセットタイプanr5;デュモンピンセット タイプe nr 7</td></tr><tr><td>250 ml(遠心分離機)チューブ</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>直径約5.6 cm、高さ14.7 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>700 mlチューブ</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>シリンダー、丸足チューブ、D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>ラック</td><td></td><td></td><td>、トウモロコシチューブ用、自家製</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成長条件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growthキャビネット</td><td></td><td></td><td>27&°;C、連続光、相対湿度70%</td></tr></tbody></table>

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

側根の発達は根系に大きく寄与するため、植物の成長にとって非常に重要です。しかし、側根の開始の研究は、根内の数個の細胞でのみ予測不可能な方法で発生するため、退屈です。この問題を回避するために、側根誘導システム(LRIS)が開発されました。オーキシン輸送阻害剤と合成オーキシンで苗木を連続的に処理することにより、高度に制御された側根の開始が一次根で同期して起こり、目的の発育段階の豊富なサンプリングが可能になります。LRISは最初にシロイヌナズナ用に開発されましたが、他の植物にも適用できます。したがって、トウモロコシ(Zea mays)での使用に適応されています。両プラントのLRISのさまざまなステップの詳細な概要が示されています。このシステムと比較トランスクリプトミクスとの組み合わせにより、CYCLIN B1に示されているように、他の種におけるシロイヌナズナ側根開始遺伝子の機能的相同体を同定することが可能になりました。1 (CYCB1;1)トウモロコシの細胞周期遺伝子。最後に、LRISを他の植物種用に開発する際に考慮する必要がある原則について説明します。

LRISの適用は、側根開始プロセスの比較トランスクリプトを実行します LRISの1つの用途は、異なる種における側根形成の間の比較遺伝子発現プロファイルの相関関係です。比較トランスクリプトミクスは、異なる種における側根の開発プロセスに関与オルソロガス遺伝子を特定する可能性を作成して近づきます。既に形成されているルートの軸に含まれる細胞のサブセットから新しい器官の形成で構成されて側根の開始は、その根本アーキテクチャを制御するために、被子植物で共有される主要なメカニズムです。したがって、それは共通の祖先に存在する既存経路から進化し、進化を通して保存されていた可能性が非常に高いです。実際、側根開始の共通電位レギュレータは異なる種で発見されています&lt;SUP&gt; 17、18。 <stro...

Lateral Root Inducible System(LRIS)は、側根の同期誘導を可能にし、シロイヌナズナとトウモロコシに提供されます。

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

側根誘導システムの全体的な目的は、ホルモン処理を用いて植物の側根の開始を同期的に誘導することです。植物の根は土壌に隠れているため、研究が非常に困難であることで知られています。私たちは、側根開始のプロセスを細胞学的、組織学的、および分子レベルで研究することを可能にするin vitroシステムを開発しました。一般的に、この手法に慣れていない研究者は、植物が培地に適切に接触して成長せず、側根の均一な誘導が妨げられるという問題に直面することがあります。本手法を視覚的に実演することで、均一な誘導を確実にするために留意すべき重要なステップを示すことができます。このシステムは元々小さな植物である Arabidopsis で開発されましたが、トウモロコシ、イネ、ムギなどの他の系にも適用可能です。まず、滅菌ピンセットを用いて、NPAを添加した増殖培地に20µmのナイロンメッシュを適用します。ドリガルスキー平板用 spreader（ spreader）を使用してメッシュを培地上に軽く押し込み、培地と十分に接触していることを確認します。次に、滅菌した爪楊枝をアガーに押し付け、爪楊枝の先端に粘着面を作ります。爪楊枝を使用して、ガス滅菌した種子の一群を準備したプレート上に均等に分散させます。プレートを透湿性粘着テープで密封し、4 °Cの暗所に最低2日間、最大1週間保存します。これは層化に必要であり、同期した効率的な発芽を確実にするためのものです。3日目にプレートを育成室に移動させ、2日間の発芽させた後、80～90度の角度で3日間育成させます。8日目に、完全にメッシュに接触して伸びた根と、逆にメッシュに接触していない根を識別します。根がメッシュに接触していない苗はすべて取り除いてください。苗を含むメッシュを、10 µMのNAAを添加したプレートに移植します。プレートに置いた後、必要に応じてメッシュを培地表面に軽く滑らせ、成長培地と十分に接触していることを確認してください。すべての苗で均一に誘導を行うためには、NPA添加培地においてメッシュに接触して成長しなかった苗を除去し、NAA添加培地において必要に応じて適切にメッシュを滑らせることが重要です。新しいプレートを breathable tape で密封し、誘導後、所定の時間まで成長室に垂直に置いてください。サンプルを回収する準備ができたら、メッシュ上で直接メスを用いて根のセグメントを一斉に切断し、メッシュ表面を軽く掻き取ってサンプリングします。次に、トウモロコシにおける側根誘導システムのいくつかの手順について説明します。まず、必要な数のトウモロコシ種子を滅菌済みのガラスビーカーに入れ、種子の滅菌から開始します。次に、6%次亜塩素酸ナトリウム水溶液100 millilitersをビーカーに加え、マグネチックスターラーバーを投入します。ビーカーをマグネチックスターラーに載せ、室温で5分間、低速で撹拌します。漂白液を静かに取り除きます。100 millilitersの新鮮な滅菌水に交換し、種子を5分間すすぎます。この工程を5回繰り返します。手袋を着用し、ハンドペーパータオルを2枚切り離して、清潔な表面に重ねて置きます。次に、シートを長辺方向に二つ折りにします。ピンセットを使用して、上端から約2cmの位置に10粒の種子を、種子間に8cmの間隔を空け、かつ両端に8cmの余白を設けて、ペーパーの全長にわたって配置します。種子の胚根が下向きかつ紙側に面していることを確認します。種子がずれないように注意しながら、紙を長さ方向に沿ってゆっくりと丸めます。必要に応じて、紙に滅菌水をスプレーすると、この操作がスムーズになります。ロールを滅菌済みのガラスチューブに入れ、さらにチューブをラックにセットします。チューブ内のペーパーロールに50 µMのNPA溶液を125 mL注ぎます。ペーパーロールが溶液を吸収し、完全に浸されます。ペーパーロールシステムを育成キャビネットに3日間置きます。必要に応じてNPA溶液を追加し、インキュベーション中もペーパーロールが浸った状態を維持するようにしてください。側根開始を均一に誘導するためには、ペーパーロールがNPA溶液で湿った状態に保たれていることを確認しつつ、根自体が液体に浸からないようにすることが重要です。NPAで3日間処理した後、トウモロコシの苗には小さなシュートと、約2〜3 cmの根が形成されます。4日目に、ペーパーロールから残っているNPA溶液の大部分を軽く絞り出し、ロールが十分に浸るまで滅菌水に浸します。約5分後、ペーパーロールから水の大部分を軽く絞り出します。洗浄ステップを3回繰り返します。最後のすすぎの後、水気をほとんど絞り出し、チューブに戻します。チューブ内のペーパーロールが完全に浸るまで、50 micromolarのNAA溶液を注ぎます。次に、誘導後、希望の期間、ペーパーロールシステムを育成キャビネットに入れます。NAAで育成していない、あるいはNAAで1時間育成したオーキシン応答マーカー系統pDR5-GUSの苗と比較して、NAAで2時間育成した苗では、側根分化を誘発する初期イベントの一つであるオーキシン応答が認められます。これらの分裂は、およそ2時間後から先端から上方向へ移動し始め、NAAへの曝露時間が長くなるにつれて増加します。細胞周期マーカーライン pCYCB1;1-Gus を用いると、側根形成に至る最初の細胞分裂が、NAA処理開始から約6時間後から観察できます。マイクロアレイおよび定量rt-PCRを用いることで、側根誘導中のシロイヌナズナおよびトウモロコシの根のさまざまな領域における、さまざまな遺伝子の発現を評価することが可能です。シロイヌナズナとトウモロコシのいずれにおいても、植物をより長時間成長させると、誘導された分裂によって側根の発達と伸長が起こります。トウモロコシにおける本システムの概念実証として、比較のために異なる条件下で栽培した苗を示します。水で10日間栽培した苗は、側根が非同期に分化しており、軸に沿って広く間隔が開いています。NPAで10日間栽培した苗には、側根が全く認められません。NPAで3日間育成した後、NAA処理を施した苗では、側根の大量かつ同期的な誘導が見られます。このビデオでは、根の分枝プロセスに関する根本的に新しい知見の発見に不可欠であることが証明された、側根誘導システムの構築方法について解説しました。ここではシロイヌナズナとトウモロコシでの適用例を示しましたが、他の任意の植物種にも容易に適応させることが可能です。ご健闘をお祈りします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。...

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

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側根誘導系で

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