ヒト腹腔器官培養における卵巣癌普及の初期段階のモデル化

ここでは、卵巣癌細胞の接着、浸潤、増殖を調査するツールとして、初代ヒト中皮細胞と細胞外マトリックスで層状にされた線維芽細胞からなる腹腔の内層の3次元in vitroモデルを構築するためのプロトコルを提示します。

この実験の全体的な目標は、腹膜微小環境を模倣した器官型モデルを作成し、卵巣がんの生物学の理解を深めることです。この方法は、がん細胞と微小環境との間の相互作用が疾患の病因にどのように寄与するか、これらの相互作用の潜在的な阻害剤をどのようにテストできるかなど、卵巣がん領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ペラル腔の中皮線表面を形成する実際の初代ヒト細胞が卵巣癌細胞の共培養に使用されることです。

この方法は卵巣がんについての洞察を提供することができますが、胃がん、膵臓がん、結腸がんなど、腹腔全体に広がる他のがんの研究にも適用できます。外科用ヒト大網標本を取得したら、直ちにサンプルを室温PBSに浸します。浸漬から2時間以内に、オトガイを20ミリリットルの新鮮なPBSが入った50ミリリットルの円錐管に移し、一次ヒト中皮細胞またはHPMCおよび赤血球を含む残りのPBS洗浄液を新しい50ミリリットルの円錐管に移し、細胞をスピンダウンします。

次に、チューブの内容物を10センチメートルの滅菌培養皿に注ぎ、2つのメスを使用して組織を5立方ミリメートルの小片にミンチします。初代ヒト中皮細胞またはHPMCを単離するには、大網片を50ミリリットルの円錐管に移し、1分間待ちます。固体片が上部に浮かぶために、HPMCは赤血球と一緒にチューブの底に沈殿します。

ピペットを使用して、中皮細胞と赤血球を含むPBS洗浄液をペレット化された細胞を含むチューブに移し、細胞をスピンダウンします。次に、20ミリリットルの新鮮なPBSを大網に追加し、HPMCとRB C3を含むPBSをさらに収集します3は、元のペレット化された細胞に実証されます。最終的なスピンプレートの後、細胞を15ミリリットルの全増殖培地中の75平方センチメートルのフラスコに入れます。

大網サンプルから追加のHPMCを単離するには、200 RPMおよび摂氏37度で20ミリリットルのPBSで残りの固体組織を振とうします。10分後、サンプルを1分間休ませて、固体組織がチューブの上部まで上昇するのを待ちます。次に、先ほど示したように、チューブの底からHPMCとRBCを回収します。

次に、この二次洗浄液から細胞をスピンダウンし、15ミリリットルの全増殖培地に入った別の75平方センチメートルのフラスコにプレートします。残りのHPMCを単離するには、PBSと10ミリリットルのトリプシンEDTAの混合物で組織をさらに10分間振とうし、これらのHPMCとRBCを75平方センチメートルのフラスコにプレートし、加湿環境で摂氏37度と二酸化炭素5%で培養物をインキュベートし、プレーティングした細胞に15ミリリットルの新鮮なものを供給します。 3日目と5日目に、使用済みの培地を取り除かずに完全な成長培地。HPMCは、その直方体の形状とサイトケラチン8およびメントンの発現によって識別できます。

正常な大網線維芽細胞を単離するには、残りのミンチ大網組織を、新たに調製した10ミリリットルの10×コラゲナーゼタイプ3溶液で処理し、インキュベーション期間の終わりに振とうとすると、消化された組織は、いくつかの線維性破片を含む溶液で不透明になり、正常な大網線維芽細胞懸濁液を遠心分離します。 そして、文化。13ミリリットルの全増殖培地中の細胞。24時間後、古い培地を15ミリリットルの新鮮なフル成長培地と交換します。

正常な大網線維芽細胞は、平らで細長い形状、ビメンチンの発現、およびサイトケラチンの発現の欠如によって識別できます。正常な大網線維芽細胞を培養液から放出するには、培養フラスコを10ミリリットルのPBSで洗い流し、続いて3ミリリットルのトリプシンを5分以内ですすぎます。細胞が剥離したら、全増殖培地の少なくとも3倍の容量でトリプシンを中和し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。

細胞をスピンダウンし、ペレットを5ミリリットルの全増殖培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、全成長、中濃度の100マイクロリットルあたり10〜3番目の線維芽細胞の2〜4倍に希釈します。次に、ラットテールコラーゲン100マイクロリットルあたり0.5マイクログラムを細胞に1つずつ加え、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を黒く透明な底の96ウェルプレートにプレート化します。

次に、プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも4時間、または正常な運動量線維芽細胞が沈殿している間に細胞がプレート表面に付着するまで移します。HPMCを培養フラスコから取り外し、これらの細胞を全増殖培地50マイクロリットルあたり10〜4番目のHPMCの1〜2倍に希釈します。次に、付着した正常な大網線維芽細胞にウェルあたり50マイクロリットルのHPMCを加え、実験前に少なくとも18時間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。

翌日のシード、3D ORGANOTYPIC共培養物をGFPと発現する卵巣癌細胞を80〜90%のコンフルエント培養物から所望の下流アッセイ、RGDペプチドおよびアルファファイブ、ベータワンおよびアルファファイブに対するブロッキング抗体に使用する。ベータ3。インテグリンは卵巣がん細胞の器官型培養への接着を阻害しますが、RADペプチドおよびコントロールおよびベータ4インテグリン抗体は阻害しません。

RRG Dペプチドおよびα 5およびβ 1インテグリンに対するブロッキング抗体は、器官型培養における卵巣癌細胞の増殖も阻害しますが、RADペプチドおよび対照α 5、β 3およびβ 4インテグリン抗体は阻害しません。さらに、RGDペプチドおよびα 5およびβ oneインテグリンに対するブロッキング抗体は、卵巣癌細胞3D ORGANOTYPIC培養浸潤を阻害する。α 5 β 3インテグリン抗体は、アドヒアランスおよび増殖アッセイデータから予想されるようにこのプロセスを強化しますが、RAD ペプチドおよびコントロール抗体およびβ 4インテグリン抗体もがん細胞の浸潤に効果を示さなかった。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば7時間から12時間で完了できます。この手順を試行する際は、常に生物学的安全キャビネットと、この手順に従って白衣や手袋などの適切な保護具を使用することを覚えておくことが重要です。接着、浸潤、増殖アッセイなどの他の方法を実行して、がん細胞の発生後の微小環境との相互作用に関する追加の質問に答えることができます。

この技術は、卵巣がんの分野の研究者が、微小環境ががん細胞とヒト腹腔細胞との相互作用にどのように影響するかを調査する道を開きました。このビデオを見れば、ヒトの勢いから初代細胞を単離する方法と、ペラルライニングの器官型培養を構築する方法について十分に理解できるはずです。