Name: NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学ぶ溶解動的核分極（DNP）を用いたNMRによるリアルタイム酵素反応速度測定法。500MHz NMR分光計の感度を飛躍的に向上させ、分子構造を変化させることなく酵素プロセスを秒単位で追跡できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、有益な議論のための機器の選択と組み立てアシストするために博士のJJのファン・デル・クリンク、ならびに博士F.カテブ博士G. Berthoに感謝します。 ACは、スイス国立科学財団（PPOOP2_157547を付与する）によってサポートされていました。私たちは、パリソルボンヌシテ（NMR @コム、DIM解析、ヴィル・ド・パリ、財団デラRECHERCHEMédicale（FRM ING20130526708）、およびParteneriatヒューバートCurienブランクーシ32662QKから融資を認めている。私たちのチームはEquipexプログラムパリ・アン・共振の一部でありますそして、CACSICE。

注：すべてのデータ分析は、市販のソフトウェアを用いて行きました。 1.偏光液を調製<ol><li> 1.12 M 13 C標識ピルビン酸ナトリウム（のNa + [CH 3 -CO- 13 COO] - 、基板）の2ミリリットル準備ラジカルTEMPOLの33 mMの（でドープされた解決策4 -ヒドロキシ- 2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、偏エージェント）4 2：1、D 2 O / D 13 C観測のための6 -エタノール。注意：使用上の注意点によるD 6 -エタノールの引火性の性質のために注意する必要があります。 </li><li>ラジカル濃度が達成分極の面で最適であることを確認します。 <ol><li> （30 mm以上35 mmで、 例えば ）少しポイント1.1での溶液のラジカル濃度を変更します。 </li><li>反復固体増強を決定する（ステップ3を参照）、最大向上につながるラジカル濃度を見つけます。 </li></ol></li></ol> 2. Polarizatイオン<ol><li>クールダウンの手順で、DNPのクライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「クールダウン」ボタンをクリックします。 </li><li>充填手順を通じてDNPのクライオスタット内の液体ヘリウムを収集します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「充填」ボタンをクリックします。 </li><li> DNPの偏光板が設けられた試料容器中のステップ1.1から最適化された偏光の溶液300μLを置きます。穏やかに液体窒素浴中に浸漬することによって内部に試料と試料容器を凍結。 </li><li>液体窒素浴から試料容器を抽出し、逆さまに回転させることによって凍結手順（ステップ2.3）後の試料容器中に存在し得る液体窒素を排除します。 注：この手順は（ステップ5を参照）、サンプルの完全な溶解を得ることが重要です。 </li><li>クライオスタット内に試料を挿入します。 注：このセントEPは、以下のサブステップから成る、（ すなわち 、未満10から20秒で）融解からサ ​​ンプルを防ぐために迅速に実行する必要があります。 <ol><li>サンプルホルダーに試料容器を挿入します。主クライオスタットインサートに試料ホルダーを挿入します。サンプルホルダーにマイクロ波の導波管を挿入します。 </li></ol></li><li> 1 K冷却手順を開始することにより、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「1K冷却」ボタンをクリックします。 </li><li>上のマイクロ波源をオンにして、サンプルを照射します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「MW-ON」ボタンをクリックします。 </li></ol> 3.固体NMR測定<ol><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、分光器コイルからNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。クライオスタットの同軸コネクタに検出チャンネルの同軸ケーブルを差し込みNMRコイル。オリエンテーションピンに着目し、クライオスタットのNMRコイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li><li> T = 5分の間隔で繰り返さ未校正し、低フリップ角パルスでシンプルなパルス取得シーケンスを使用して、クライオスタットサイトで固体状態でNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li> DNP-強化されたNMR信号を測定します。第2節で説明したように、DNPプロセスを開始した後、ステップ3.2の動作を繰り返します。 </li><li> 90°コネクタ反時計方向に回転し、それを引いて、クライオスタットのNMRコイルからのNMRコンソール検出チャンネルの同軸ケーブルを外します。 DETEの同軸ケーブルを差し込み分光器コイルの同軸コネクタにctionチャンネル。オリエンテーションピンに着目し、分光器コイルのメスコネクタにNMRコンソールケーブルのオスコネクタを挿入します。しっかりと押して、90°コネクタを時計回りに回転させます。 </li></ol> 4.メインマグネットフィールド（ &#39;シミング&#39;）の均一性を最適化<ol><li>分析計内で前の実験（ すなわち 、ステップ6.2の後）で製造された混合物の500μLを含むチューブを置きます。 </li><li>最大値を探索するシミング勾配コイルの電流を変化させることにより、NMR分光計のシミングを行う重水素の信号を「ロックします」。 NMRコンソールに対応するボタンを押すことにより、関連するシミングコイルを選択します。 <ol><li>ロック信号を増加させ、回転方向を決定するためにNMRコンソール上のノブを回します。信号が最大に達するまで回転し続けます。別のシミングコイルを選択し、最大化解除を繰り返しますすべてのシムコイル用の極大ゴマ発見されました。詳細については、NMR分光計の取扱説明書を参照してください。最後には、ロックに用いたサンプルを削除します。 </li></ol></li></ol> 5.解散<ol><li>溶解挿入ボイラーでD 2 Oの5ミリリットルを挿入します。加圧するとT≈180〜200゜Cに達するまで抵抗ワイヤによってD 2 Oを加熱します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）に「ヒーターの準備」ボタンをクリックします。 </li><li>サンプル偏光手順の完了後（ 例えば 、3 T DNP後）は、室内圧力よりわずかにクライオスタットを加圧します。クライオスタットのソフトウェアインターフェース（ 図2D）の「SSオペレーション」ボタンをクリックします。溶解インサートからのマイクロ波ガイドを削除します。 </li><li>サンプルホルダーにダウン溶解インサート（ 図3B）をスライドさせ（ 図3A-C）。溶解インサートは、サンプルホルダーの底に達する必要があり、クライオスタットでD 2 O漏れを回避するために、試料容器との漏れ止め接続を行うためにしっかりと押さなければなりません。 </li><li>溶解シーケンス、空気弁の操作の予め定めタイミングシーケンスを開始するために、ハードウェア・トリガ（ 図3C-h）を押してください。 </li></ol> 6.インジェクション<ol><li>解散場所の前に5ミリメートルのNMRチューブ、500μlのサンプルを含む（ 例えば 、D 2 Oのために<img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> 11.74 T NMR分光計のアイソセンタのステップ9での酵素活性の測定のためのステップ8からステップ7またはLDH溶液中で測定）、（ステップ4を参照）。 </li><li>ただ、解散（ステップ5）した後、ステップ6.1にNMR分光器に置かれた試料に過分極溶液500μlを混合します。 <ol><li>マニュアルインジェクション：過分極を収集NMR分光器の磁石の近くに配置されたガラスビーカー中で2.5メートルの長い移送管の終わりにソリューションを提供します。手動でカスタムメイドのキャピラリシステムを介してNMR試料管に過分極溶液500μlを注入。 </li><li>自動注入：溶解工程の前に、転送に使用されるヘリウムガスから過分極ソリューションを分離する自動化されたカスタムメイドの噴射装置へ移送管を接続します。デバイスは自動的にサンプル管に過分極溶液500μlを実現します。 </li></ol></li></ol> 7.液体状態NMR測定<ol><li>溶解後、基板（A）の磁化の進行及び製品（B）に追従するために1.5秒だけ離れた10°のフリップ角パルス取得一連のシーケンスにより分光器のサンプルからのNMR、超偏極信号を測定。測定を設定した後、ソフトウェアのコマンドラインで「ZG」を書いて、キーを押します＆＃39; &#39;キーボードのキーを入力してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li><li>磁化が完全に緩和すると（ すなわち 、T = 10、T 1の後）、90°のフリップ角パルス-取得T = 3 T 1≈3分だけ離れた配列を一連のNMR熱信号を測定します。測定を設定した後、ソフトウェア「ZG」のコマンド行で記述し、Enterキーをキーボードのキーを押してください。分光器の操作と測定セットアップの詳細についてのNMR分光器の取扱説明書を参照してください。 </li></ol> （ピルビン酸から乳酸の変換のための具体的な）酵素含有試料の8準備<ol><li>以下のレシピとの反応緩衝液を調製：50mMの0.1 Mリン酸緩衝液中でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、1mMのエチレン - ジアミン四酢酸（EDTA）、0.1mMのジチオスレイトール（DTT）を低減し、pH値=7.0。 </li><li>ウサギ筋肉LDH溶液を20μg/ mlのウシ血清アルブミン、BSAとの反応緩衝液中で新たに調製した1 U / mlで調製します。 </li><li> 20μlのD 2 Oは、分光器の磁場安定化（ &#39;ロック&#39;）を可能にし、2μlのLDH溶液（ステップ7.2）するために、478μlの反応バッファー（ステップ8.1）を混ぜます。 </li><li> 5ミリメートルのNMRチューブにステップ8.3で調製した500μlの溶液量を置き、500 MHzのNMR分光計にチューブを置きます。 </li></ol> 9.完全な酵素反応速度測定手順<ol><li>偏光の試料（ステップ1）を準備し、（ステップ2）それを偏光。 </li><li>分光計（ステップ4）にシミング実行し、酵素サンプル（ステップ8）を準備します。 </li><li>溶解（ステップ5）、注射（ステップ6）を実行します。 </li><li> 1.5秒（ステップ7）離れた10°のフリップ角パルス買収に過分極サンプルからの一連の信号を測定します。このステップでは、過分極を測定することができます信号減衰および代謝産物の信号の蓄積。 </li></ol> 10.フィッティング<ol><li>ステップ9.4において取得された各スペクトルについて、それぞれ（A）及び生成物（B）が、基板と、それらを統合するために対応するピークを同定する（ピークの面積を決定します）。ピークの積分は、磁化の経時変化を信号（M（A、B）（t）は、式2を参照）を得ました。 </li><li>方程式の解を使用すると、（2）、F =（R A + K EFFの値を決定します ）ステップ10.1に統合された基板の信号の単純な指数関数フィットから。 </li><li>値F =（R の A + K effはを使用して、 ）ステップ10.2において判定式を積分した機能を持つ製品信号Mの B（t）の適合からのk effは及びR Bを決定する（2）。代表的な結果セクション（Enzymatを参照してください。反応モデリング、フィッティングおよびRF補正の詳細については、ICの活動と代謝の測定値）。 </li></ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言

溶解DNP NMR実験の重要なポイントがある：（i）実験のために必要な最低の生成物濃度と同様に行わ及び（ii）可能な信号取得回数を決定した基板、のために達成分極レベル寿命偏光と検出サイト間および基板変換率への転送の持続時間に比べて、磁化。本明細書中に記載の溶解DNPセットアップの噴射システムは、わずか3-4として秒のサンプル転送を可能にします。転送はS.ボーエンとC.ヒルティによって提案された方法におけるほど急速ではなかったが、ピルビン酸のための26の偏光損失が低い分野での適度な縦緩和に制限されていました。 [1- 13 C]ピルビン酸、その長いカルボン核T 1で、10 -3 U / mlという低い濃度でLDHを通してフラックスを測定することができます。 ザ<html>高い信号対雑音比は、溶解DNPつより低い[1- 13 C]ピルビン酸濃度に感受性であり得ることを示唆し、そしてより低い酵素変換率を用いて得られました。達成分極レベルは有意な信号対雑音比の20...

<table><tbody><tr><td>DNP偏光子</td><td>Vanderklink s.a.r.l(スイス)</td><td></td><td>サンプル分極用クライオスタットおよび電子機器</td></tr><tr><td>真空システムコンポーネント</td><td>Edwards真空(フランス)</td><td>さまざまな</td><td>-ターボ分子ポンプセットアップ -メンブレンポンプセットアップ -大容量ルーツポンプシステム -真空継手およびコンポーネント</td></tr><tr><td>DNP 3.35TMagnet</td><td>Bruker (フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker (France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Data analysis software</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D</td><td>シグマ・アルドリッチ(フランス)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;4-ヒドロキシ-TEMPO 97%</td><td>シグマ・アルドリッチ(フランス)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td>シ<td>グマ・アルドリッチ(フランス)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)</td><td>シグマ・アルドリッチ(フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>シグマ・アルドリッチ(フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>シグマ・アルドリッチ(フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液、pH&nbsp;=&nbsp;7.0</td><td>Sigma Aldrich (フランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH酵素</td><td>Sigma Aldrich (フランス)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、BSA</td><td>Sigma Aldrich (フランス)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nmrによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

NMRベースの調査の主な制限は、低感度です。これにより、代謝変換のリアルタイムNMR測定を防止し、長い取得時間を入力するよう求められます。溶解DNPを介した過分極は、電子・ツー・核スピン分極移動に起因する大規模なアウトオブ平衡核磁化のおかげで感度の問題の一部を回避します。得られた高NMR信号は、リアルタイムでの化学反応をモニターするために使用することができます。過分極NMRの欠点は、関連付けられた緩和時間定数のオーダーで、好ましい場合において、核スピン縦緩和時間定数、T 1、または程度で通常の信号取得のための限られた時間ウィンドウ内に常駐結合された核の一重項状態、T LLS。内因性分子および代謝速度の細胞取り込みは、腫瘍の発生と薬剤応答に不可欠な情報を提供することができます。ニューmerous以前の過分極NMR研究は、 インビボでの酵素活性をモニタリングするための代謝基質としてピルビン酸の関連性を実証しました。この作品は、特に、過分極NMRによる乳酸脱水素酵素（LDH）の存在下でピルビン酸対乳酸の変換率を、酵素反応の研究に必要な実験装置と方法の詳細な説明を提供します。

溶解DNPを使用して、NMR信号ゲイン DNPの効果は、サンプルのマイクロ波照射下、NMR活性核に、典型的には安定したラジカル分子から、不対電子スピンの高い偏光の伝達にあります。最も頻繁に使用されるフリーラジカルは、TAM（OXO63）およびTEMPOLある。TEMPOLを用いて4偏光手順は「交差偏光」によって最適化することができる。25 固体状態での最大の核分極を得るために、安定したラジカルの濃度を最適化する技術の成功に重要です。最適TEMPOL濃度は、この研究の実験条件で33ミリモルであることが見出されました。選択されたこの基板の偏光は、リアルタイムでその酵素変換をたどるのに十分です。 polariの磁場ZERパリデカルトに設置されたB 0</...

溶解動的核分極(DNP)による感度向上により、NMRやMRIによる代謝過程をリアルタイムで追跡することができます。研究用酵素反応用に設計された専用の溶解DNPセットアップの特性と性能について説明します。

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

この実験の全般的な目的は、動的核偏極（DNP）による核磁気共鳴の増感を用いて、酵素反応プロセスをリアルタイムで追跡することです。動的核偏極（DNP）によって増感された液状態の磁気共鳴は、重要な問いへの回答に寄与します。例えば、細胞内やin vivoにおいて、一対の分子に一切の手を加えることなく、それらの酵素的変換速度をどのように決定するかといった点です。当研究室への溶解DNP装置の導入、およびローザンヌのArnaud Comment研究室で博士号を取得したRiccardo Balzan博士の着任は、我々の研究にとって大きな前進となります。DNPは、500 MHz NMR分光計を用いて実施可能な実験の感度を大幅に向上させます。このDNP装置はフランスで初めて導入されたものであり、装置を稼働させるにあたって、私たちのNMRチームの全メンバーが関与したことを付け加えたいと思います。特に、リサーチエンジニアのGildas Bertho氏と、准教授（maitre de conferences）のFatiha Kateb氏に感謝いたします。この手法の主な利点は、基質およびその内因性誘導体を、数秒の時間分解能で直接かつリアルタイムに定量できることです。分極溶液として、$^{13}\text{C}$観察用に、重水と重エタノールを2:1の体積比で混合した溶媒を用い、33 mMのTEMPOラジカルを添加した1.12 Mの$^{13}\text{C}$標識ピルビン酸ナトリウム溶液を2 mL調製します。クライオスタットソフトウェアインターフェースの冷却ボタンをクリックし、冷却手順に従って動的核分極（DNP）クライオスタットの温度を下げます。充填手順に従い、DNPクライオスタットに液体ヘリウムを回収します。クライオスタットソフトウェアインターフェースの充填ボタンをクリックします。次に、DNP分極装置に付属のサンプル容器に、最適化した分極溶液を300 microliters分注入します。サンプルが入ったサンプル容器を、液体窒素バスにゆっくりと浸して凍結させます。凍結処理後、サンプル容器内に残っている可能性がある液体窒素を、容器を液体窒素バスから取り出し、逆さまにして回転させることで除去します。次に、まずサンプル容器をサンプルホルダーに挿入し、サンプルをクライオスタットに導入します。その後、マイクロ波の導波管をサンプルホルダーに挿入する前に、サンプルホルダーをクライオスタットのメインインサートに配置します。1ケルビン冷却手順を開始し、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットソフトウェアインターフェース上の1ケルビン冷却ボタンをクリックしてください。マイクロ波光源をオンにし、クライオスタットソフトウェアインターフェース上のマイクロ波オンボタンをクリックしてサンプルに照射します。N

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

このビデオでは、15のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。...

原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

多コンパートメントの動的ファントムは、過分極磁石共鳴剤を使用した代謝研究のためのいくつかの興味深い生物学をシミュレートするために使用されます。...

過分極磁気共鳴剤の研究のための多区画動的単一酵素ファントムの使用

新しい電子常磁性共鳴（EPR）法、高速走査EPR（RS-EPR）は、従来の連続波（CW）技術に優れており、in vivoイメージングのための新しい会場を開き、2Dスペクトル空間イメージングのために実証されています。結果は、250 MHzで実証されていますが、技術は、任意の周波数においても適用可能です。...

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

動的な核分極とその後のサンプル溶解により、生体システムにおける代謝のリアルタイム研究が可能になりました。過分極[1-13C]ピルビン酸は、in...

過分極 13 C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

多次元固体 NMR 分光法と動的核スピン偏極 (DNP) 調査の13C、15N...

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

我々は、高速フィールドサイクル緩和測定を用いて、動的核偏光によって過偏光する13C濃縮化合物のスピン格子緩和時間の磁場依存性を測定するプロトコルを提示する。具体的には[1-13...

過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の測定[1-13C]ピルビン酸

ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを...

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2...

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

このプロトコルは、カスタムメイドのバイオリアクターシステムと過分極¹³C...

過分極 13C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

学ぶ溶解動的核分極（DNP）を用いたNMRによるリアルタイム酵素反応速度測定法。500MHz NMR分光計の感度を飛躍的に向上させ、分子構造を変化させることなく酵素プロセスを秒単位で追跡できます。

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

さらに動画を探す