NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

この実験の全般的な目的は、動的核偏極（DNP）による核磁気共鳴の増感を用いて、酵素反応プロセスをリアルタイムで追跡することです。動的核偏極（DNP）によって増感された液状態の磁気共鳴は、重要な問いへの回答に寄与します。例えば、細胞内やin vivoにおいて、一対の分子に一切の手を加えることなく、それらの酵素的変換速度をどのように決定するかといった点です。当研究室への溶解DNP装置の導入、およびローザンヌのArnaud Comment研究室で博士号を取得したRiccardo Balzan博士の着任は、我々の研究にとって大きな前進となります。

DNPは、500 MHz NMR分光計を用いて実施可能な実験の感度を大幅に向上させます。このDNP装置はフランスで初めて導入されたものであり、装置を稼働させるにあたって、私たちのNMRチームの全メンバーが関与したことを付け加えたいと思います。特に、リサーチエンジニアのGildas Bertho氏と、准教授（maitre de conferences）のFatiha Kateb氏に感謝いたします。この手法の主な利点は、基質およびその内因性誘導体を、数秒の時間分解能で直接かつリアルタイムに定量できることです。

分極溶液として、$^{13}\text{C}$観察用に、重水と重エタノールを2:1の体積比で混合した溶媒を用い、33 mMのTEMPOラジカルを添加した1.12 Mの$^{13}\text{C}$標識ピルビン酸ナトリウム溶液を2 mL調製します。クライオスタットソフトウェアインターフェースの冷却ボタンをクリックし、冷却手順に従って動的核分極（DNP）クライオスタットの温度を下げます。充填手順に従い、DNPクライオスタットに液体ヘリウムを回収します。

クライオスタットソフトウェアインターフェースの充填ボタンをクリックします。次に、DNP分極装置に付属のサンプル容器に、最適化した分極溶液を300 microliters分注入します。サンプルが入ったサンプル容器を、液体窒素バスにゆっくりと浸して凍結させます。

凍結処理後、サンプル容器内に残っている可能性がある液体窒素を、容器を液体窒素バスから取り出し、逆さまにして回転させることで除去します。次に、まずサンプル容器をサンプルホルダーに挿入し、サンプルをクライオスタットに導入します。その後、マイクロ波の導波管をサンプルホルダーに挿入する前に、サンプルホルダーをクライオスタットのメインインサートに配置します。

1ケルビン冷却手順を開始し、クライオスタットの温度を下げます。クライオスタットソフトウェアインターフェース上の1ケルビン冷却ボタンをクリックしてください。マイクロ波光源をオンにし、クライオスタットソフトウェアインターフェース上のマイクロ波オンボタンをクリックしてサンプルに照射します。

NMRコンソールの検出チャンネルの同軸ケーブルのコネクタを反時計回りに90度回転させて引き抜き、分光計コイルから取り外します。検出チャンネルの同軸ケーブルをクライオスタットNMRコイルの同軸コネクタに接続します。次に、方向決めピンに注意しながら、NMRコンソールケーブルのオスコネクタをクライオスタットNMRコイルのメスコネクタに挿入します。

コネクタをしっかりと押し込み、時計回りに90度回転させます。クライオスタット部位において、未校正の低フリップ角パルスを5分間隔で繰り返す単純なパルス収集（pulse-acquire）シーケンスを用い、固体状態でのNMR熱信号を測定します。測定設定後、ソフトウェアのコマンドラインにzgと入力し、キーボードのエンターキーを押します。

分極手順を開始した後、熱平衡信号の測定に使用したものと同じ手順および条件下で、固相におけるDNP増強NMR信号を測定します。NMRコンソールの検出チャンネル同軸ケーブルのコネクタを反時計回りに90度回転させて引き抜き、クライオスタットNMRコイルから切り離します。次に、検出チャンネルの同軸ケーブルを分光計コイルの同軸コネクタに接続します。

方向決めピンに注意しながら、NMRコンソールケーブルのオスコネクタを分光計コイルのメスコネクタに挿入します。しっかりと押し込み、コネクタを時計回りに90度回転させます。20 µg/mLのウシ血清アルブミンを含む反応緩衝液を用いて、1 U/mLのウサギ筋肉LDH溶液を調製して直ちに使用します。

次に、分光計の磁場安定化（ロック）を行うため、反応バッファー 478 µL、LDH溶液 2 µL、および重水 20 µLを混合します。続いて、この合計 500 µL の溶液を 5 mm NMRチューブに入れます。この移送チューブを、ハイパーポラライズされた溶液を移送用のヘリウムガスから分離させる自動カスタム注入装置に接続します。

装置により、500 µLの超分極溶液がサンプルチューブに自動的に注入されます。溶解させる前に、500 µLのサンプルが入った5 mm NMRチューブを11.74 T NMR分光計のアイソセンターに配置します。溶解用インサートボイラーに5 mLの重水を入れてください。

クライオスタットソフトウェアインターフェースのprepare heaterボタンをクリックし、抵抗線を用いて重水に加圧および加熱を行い、温度が約180～200 °Cに達するようにします。クライオスタットソフトウェアインターフェースのSS Operationsボタンをクリックします。その後、溶解インサートからマイクロ波ガイドを取り出します。

溶解インサートをサンプルホルダーの中にスライドさせます。溶解インサートがサンプルホルダーの底に到達するようにし、重水がクライオスタット内に漏れ出すのを防ぐため、サンプル容器と気密接続ができるようしっかりと押し込んでください。ハードウェアトリガーを押して、空気圧バルブ操作のあらかじめ設定されたタイミングシーケンスである溶解シーケンスを開始します。

溶解直後に、注入装置を用いて500 µLの高分極溶液をNMR分光計内の試料と混合します。溶解後、基質および生成物の磁化の進行を追跡するため、1.5秒間隔で10度のフリップ角パルス収集シーケンスを連続して行い、分光計で試料の高分極NMR信号を測定します。測定の設定が完了したら、ソフトウェアのコマンドラインにzgと入力し、Enterキーを押します。

磁化が完全に緩和した後、約3分（約3T1に相当）の間隔で90度フリップ角パルス-アクワイアシーケンスを繰り返し、NMR熱信号を測定します。測定の設定が完了したら、ソフトウェアのコマンドラインにzgと入力し、Enterキーを押してください。ここでは、10度フリップ角パルスを繰り返し適用して得られたスペクトルの経時変化により、本手法の感度と時間分解能を示します。

ピルビン酸基質および乳酸生成物のピーク同定の後、代謝物の信号積分によって定量を行います。酵素活性は、生成物の信号タイムコースを線形モデルでフィッティングさせることで決定します。測定を検証するため、生成物と基質の信号比から得られる初期反応速度により、同じ量を評価します。

習熟すれば、適切に実施することで、酵素活性の完全な測定を約2時間で行うことができます。このビデオを視聴することで、NMR用の高分極基質を調製し、それを酵素を含む溶液に注入し、DNP増強NMRを用いて酵素活性を追跡する方法について理解できるはずです。この手順を試みる際は、新鮮な酵素と共基質を用いて酵素溶液を注意深く調製し、サンプルチューブ内に気泡が入らないようにすることが重要です。

液状態におけるDNP増強磁気共鳴の開発により、研究者は生成物の形成速度を測定することで、さまざまな種類の細胞内における基質の取り込みとその酵素的な変換を探索できるようになりました。極低温装置や高磁場を用いた操作は極めて危険を伴う可能性があることに注意してください。これらの測定を行う際は、極低温剤に対する個人用保護具の着用や、磁性体の不在の確認など、常に適切な予防措置を講じてください。

古典的なNMRとは異なり、溶解DNPに基づくNMRは、基質や現在の技術水準に応じて、実験可能な時間窓が最大でも数分間に制限されています。これが、1次元分光法を超えるための障壁となっています。溶解DNP NMRを古典的な多次元NMRと同等の汎用的なレベルに引き上げるには、さらなる開発が必要です。