生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

本手順の全体的な目的は、アレル特異的なCRISPR/Cas9媒介欠損を用いて、マウス胚性幹細胞における遺伝子転写の調節を研究することです。この手法の主な利点は、ハイブリッドゲノムを使用してモノアレル欠損を生成し解析できることです。これにより、生存不能である可能性のあるモノアレル増強欠損を解析する必要がなくなります。

この手法は、機能ゲノミクス分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、特定のエンハンサーがどの遺伝子を制御しているのか、また、その遺伝子の活性が特定のエンハンサーにどの程度依存しているか、といった点です。本手法は幹細胞の多能性に関する洞察を提供できるだけでなく、他の系にも応用可能です。

例えば、幹細胞がどのように運命を変えてニューロン、血液細胞、または筋肉になるかを理解するのに役立ちます。使用するガイドRNA（gRNA）を設計、構築し、その配列を確認した後、エンドトキシンフリーのプラスミドをES細胞にトランスフェクションする準備をします。遠心分離機を用いて、Mus musculus 129とMus castaneusを交配させて作製したF1胚性幹細胞 1×10⁶個を、1.5 mLチューブ内で 300 ×g で5分間遠心し、ペレット化します。

遠心分離後、上清を捨て、キットメーカー提供の再懸濁バッファーを100 µL加えます。標的DNA領域を欠失させるには、P Cas9 GFP 5-primeおよび3-prime gRNAプラスミドをそれぞれ5 µg加えます。ピペットを用いて、静かに混ぜ合わせます。

気泡が入らないように注意してください。次に、マイクロポレーターの電子ピペットチップを使用して、チップ内に空気が入らないように注意しながら、エレクトロポレーションミックスを100 µL吸引します。その後、ピペットをトランスフェクション装置に装着してください。

適切なプロトコルを選択し、スタートボタンを押します。エレクトロポレーションの動作中にチップを観察してください。正しくセットアップされていれば、チューブ電極から小さな気泡が発生します。

スパークが発生した場合は気泡が存在することを示しており、トランスフェクションを妨げます。この場合は、新しい細胞バッチを用いてエレクトロポレーションをやり直す必要があります。エレクトロポレーション後、トランスフェクションした細胞を、10 mLのES細胞培地を含む10 cmのゼラチンコートディッシュに排出します。

トランスフェクションした細胞を37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。48時間後、フローサイトメーターを用いてCas9 GFP陽性ES細胞をソートして単離します。次に、10 mLのES細胞培地を含む10 cmのゼラチンコートディッシュに、1〜1.5 × 10⁴個のGFP陽性細胞を播種します。

この低密度で播種することで、個々のES細胞コロニーのピックアップが容易になります。4〜5日後、顕微鏡を用いて、球状の単一ES細胞コロニーを識別します。ピペットを使用して、各コロニーを、ゼラチンで前処理され30 µLのtrypsomを含む96ウェルプレートの各ウェルに転移します。

すべてのコロニーをピックアップし、培地中で分散させた後、ほとんどのウェルのコンフルエンシーが70%を超えるまで、二酸化炭素インキュベーター内にて37°Cで培養します。通常、これには約2日かかります。細胞を継代する準備が整ったら、培地を除去し、30 µLのtrypsinを添加します。

細胞を5分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するため、各ウェルに180 µLのES細胞培地を加えます。ピペッティングを行い、単一細胞懸濁液にします。

各ウェルから70 µLを、130 µLのES細胞培地を分注したゼラチンコート済み96ウェルプレート3枚のそれぞれに転移します。37 °Cでインキュベートします。プレートが70〜85%のコンフルエンシーに達したら、以降のセクションで説明するように、各クローンのジェノタイピングおよび発現解析に使用します。

付属文書に従って、細胞ストックを凍結します。ここでは、目的の欠失を確認するために、クローンをスクリーニングするための4組のプライマーを設計します。これらには、内部プライマー、外部プライマー、および5'末端と3'末端の両方のgRNA標的部位に対するgRNA隣接プライマーが含まれます。

まず、ここに表示されているウェブサイトにアクセスし、129およびCas遺伝子型に対応する一塩基多型（SNP）トラックを入手します。これにより、Mitchell LabのCRISPRウェブページに誘導されます。そこで、指定されたリンクをクリックしてください。

サイトは、MM-9マウスゲノムアセンブリにおける129系統とCasゲノム間のSNPを表示するトラックを含むUCSCゲノムブラウザにリダイレクトされます。次に、欠損させる領域の座標を入力し、「go」をクリックしてください。目的の欠損部位の中央付近で、3つ以上のSNPを含む約500塩基対の領域をズームアップします。

SNPが少ない場合、アレル特異的プライマーの設計は困難になることがあります。完全なアレル特異的プライマーの設計が不可能な場合は、緩やかなアレル特異的プライマーを使用しても構いません。その際、qPCR結果の解析時に、欠失クローンと非欠失クローンのCT値を比較することを忘れないでください。

次に、上部パネルの「View」をクリックします。ドロップダウンメニューから「DNA」を選択してください。「Get DNA in Window」ページが表示されます。

配列のフォーマットオプションで「すべて大文字（all uppercase）」を選択し、「Get DNA」をクリックして、ターゲット配列をすべて大文字の形式で表示させます。この配列をコピーしてWordドキュメントファイルに貼り付けます。次に、その配列を129 cast snipトラックと比較し、スニップ（snip）の位置をハイライトして、129個のスニップを小文字でマークします。

129の配列が完了したら、それをコピーしてFast Day形式の配列を2種類作成します。1つは129用、もう1つはCas用です。Casの配列では、各スニップ位置に正しい塩基を代入し、そのスニップを小文字で表記してください。

次に、配列に対応するゲノム（129またはCas）をラベル付けします。その後、ブラウザにPrimer3Plusのアドレスを入力します。適切な領域に、スニップ置換後の129配列をペーストします。

デフォルト設定を使用してプライマーを設計します。内部アレル特異的プライマーを設計するには、「Task」の右側にあるドロップダウンメニューをクリックして「Primer List」を選択し、次に「Pick Primers」をクリックします。フォワードプライマーとリバースプライマーのリストが表示される新しいページが開きます。

選択ボックスをチェックして、3'末端または3'末端から4塩基以内に小文字でスニップ（snip）がマークされたフォワードプライマーまたはリバースプライマーを選択します。3'末端にスニップがあるプライマーは、qPCRにおいてアレル特異性が向上することに留意してください。画面下部の「Send to Primer3 Manager」をクリックします。

選択したプライマーを表示する新しいページが開きます。2番目のプライマーを選択するには、プライマーリストのページに戻り、戻るボタンをクリックしてメインページに戻ってください。タスクのドロップダウンメニューから、「Detection」を選択します。

メインページが更新され、下部にフォワードプライマーとリバースプライマーの配列入力ボックスが表示されます。最初のプライマー配列を適切なボックスに貼り付けます。次に、「Main」タブの隣にある「General Settings」タブに移動し、産物サイズの範囲の設定を 80 から 200 base pairs に変更します。

「Pick Primers」をクリックします。最初のプライマー配列に対して、5つの候補プライマーペアが表示されるページが開きます。プライマーの左側にあるチェックボックスを選択して、リストからプライマーセットを選び、画面下の「Send to Primer3 Manager」をクリックします。これらが、129 内部アレル特異的プライマーになります。

これらの手順を繰り返し、castアレル用のプライマーを設計します。次に、この手法を外側のアレル特異的プライマーおよび非アレル特異的プライマーの設計に適用します。最後に、付属の文書に記載されている方法でqPCRを用い、プライマーのアレル特異性を検証します。

先に準備した96ウェルプレートからゲノムDNAを抽出します。プレートを短時間遠心分離し、凝結した液滴をウェルの底に集めます。このDNAは、欠損スクリーニングのテンプレートとして使用します。

次に、384ウェルプレートを用いて、各クローンについてqPCRを重複して行います。2ステップPCRを実施し、続いて検出を伴う融解曲線分析を行います。ラン終了後、まず内部アレル特異的プライマーを用いて、各アレルの増幅を確認します。

一方のアレルが増幅しないか、あるいはアレル間でCT値に5サイクル以上の差がある場合は、これらのクローンがヘテロ接合型欠失を有していることを示唆しています。両アレルとも増幅しない場合は、ホモ接合型欠失を有していることを示唆します。次に、外側のアレル特異的プライマーを用いて、各アレルの増幅を確認します。

標的欠失が1 KBより大きい場合、欠失が存在する場合にのみ、外側プライマーによる増幅が起こります。CT値が22から28であれば、欠失が確認されます。標的欠失が1 KBより小さい場合は、電気泳動によりアンプリコンサイズを確認してください。

欠失クローンの96ウェルプレートを、アレル特異的な内部プライマーを用いたqPCRによりスクリーニングした。グレーのバーはCas特異的プライマーによる増幅を、黒のバーは129特異的プライマーによる増幅を表す。内部プライマーでのCT値が低いか、あるいは増幅が見られない場合は、ターゲットの欠失を示している。

一方または両方の対立遺伝子に欠失を持つクローンを、外側プライマーを用いてスクリーニングします。外側プライマーによる増幅で、欠失の有無を確認します。モノアレル欠失を持つクローンについては、gRNA標的領域に隣接するプライマーを用いてスクリーニングを行い、欠失のない方の対立遺伝子にインデル（挿入または欠失）が生じていないことを確認します。

その後の発現解析には、非欠損アレル上の標的部位に大きなインデル（挿入・欠損）がないモノアレルクローンのみを使用します。ここでは、129またはCas SCR欠損クローンの代表的な結果を示しています。SCRは、ES細胞において最近報告されたSox2特異的なエンハンサーです。

赤色のバーはSox2 Casアレルによる発現を、青色のバーはSox2 129アレルの増幅を示しています。この図からわかるように、129アレルまたはCasアレルのSCRを欠損させると、CISにおけるSox2の発現が減少しました。このビデオを視聴することで、CRISPR技術を用いて大きな欠損を導入する方法と、アレル特異的プライマーを用いて欠損クローンのジェノタイピングを行う方法について、十分に理解できたはずです。