Name: 生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いた1アレル欠失法でマウス胚性幹細胞におけるエンハンサー機能と遺伝子発現制御を研究する方法。ハイブリッドゲノムを活用した機能ゲノミクス解析に役立ちます。

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私たちは、有益な議論をしてくれたミッチェル研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。この研究は、Canadian Institutes of Health Research、Canada Foundation for Innovation、Ontario Ministry of Research and Innovation(JAMが保有する運営およびインフラ助成金)の支援を受けました。

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
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<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

著者らは、利害の衝突にJoveのの方針を読み、開示する競合を持っていませんでした。

CRISPR / Cas9媒介ゲノム編集技術は、ゲノム改変のための、簡単で迅速かつ安価な方法を提供します。機能的エンハンサー特徴付けのために1アレルエンハンサーの削除を生成し、分析するために、ここで具体的な方法は、F1マウス細胞におけるSNPを利用しています。このタイプのアプローチの利点は次のとおりです。1）1アレルエンハンサー欠失は重要なエンハンサーは、 すなわち 、両方の対立遺伝子から致死性を細胞につながる調節遺伝子のタンパク質レベルの大幅な削減を削除または変更されたときに発生する交絡効果を生成しません表現型; 2）1アレル欠失の頻度が低いホモ接合性欠失を取得している場合には可能性が低いです。しかし、遺伝子発現解析における対立遺伝子特異的プライマーを用いて、一方が1アレル欠失を有するクローンを分析することができます。 3）1アレルの欠失をスクリーニングするためのプライマーの4セットを使用すると、混乱の一部または大きな欠失を含むクローンの排除を可能にします下流分析。 対立遺伝子特異的なプライマーの設計は、ジェノタイピングモノ/二対立遺伝子CRISPR欠失および...

転写調節エレメントは、異常な遺伝子発現2に起因する疾患をもたらし得る発展1およびこれらの要素の変更時の遺伝子発現の時空間微調整のために重要です。ゲノムワイド関連解析により同定された多くの疾患関連領域は非コード領域にあり、転写エンハンサー3-4の機能を備えています。エンハンサーを特定し、彼らはしばしば、数キロベース離れて、彼らが調節する遺伝子から位置しており、組織特異的様式5-6で活性化することができるように複雑である調節する遺伝子とそれらをマッチング。エンハンサー予測は一般にヒストン修飾マーク、メディエーターコヒーシン複合体に基づいており、細胞型特異的転写因子7-10の結合されています。予測エンハンサーの検証は、ほとんどの場合、エンハンサーは、レポーター遺伝子11-12の発現を活性化するベクトルベースのアッセイを介して行われます。これらのデータは、Vを提供します推定されるエンハンサー配列の規制の可能性についてaluable情報が、それらの内因性のゲノムのコンテキストでそれらの機能を明らかにするまたはそれらが調節する遺伝子を特定するものではありません。ゲノム編集が機能喪失分析によってそれらの内因性コンテキスト内の転写調節エレメントの機能を研究するための強力なツールとして機能します。 ゲノム編集、すなわち、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムにおける最近の進歩は、ゲノム機能の研究を促進します。 CRISPR / Cas9システムは使いやすく、多くの生物学的システムに適応可能です。 Cas9タンパク質は、ガイドRNA（gRNA）13によるゲノムの特定部位に標的化されます。 SpCas9 / gRNA複合体はprotospacer隣接モチーフ（PAM）シーケンス、NGG 14-15に5 &#39;である必要があり、その標的ゲノム配列のためのゲノムをスキャンします。そのターゲットにgRNA、gRNAに相補的な20ヌクレオチド（nt）の配列の塩基対形成は、doublその結果SpCas9ヌクレアーゼ活性を活性化します電子鎖切断（DSB）PAM配列の上流の3bp。特異性はgRNAシード領域における完全な塩基対形成を介して達成され、6月12日は、PAMに隣接NT;逆に、シードのミスマッチが5 &#39;は通常16-17を許容しています。導入されたDSBは、いずれかの修理非相同末端結合（NHEJ）DNA修復または相同性によって中断されることが標的部位で数塩基対の修復を（HDR）mechanisms.NHEJのDNA修復がしばしば挿入/削除を作成します（インデル）向けることができます遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）。関心領域に隣接するゲノム2 gRNAs、より大きな欠失を生成するために、18〜19を使用することができます。このアプローチは、従来のエンハンサー9,18,20-22よりも大きい遺伝子座制御領域または超エンハンサーにクラスタ化転写エンハンサーの研究のために特に有用です。 1アレルの欠失は、転写のシス -regulationを研究するための貴重なモデルです。観察チャンエンハンサーの1アレル削除後の転写レベルでの電子は、両方の対立遺伝子の転写は、細胞の適応に影響を与える潜在的影響を受けているときに発生する可能性の交絡効果のない遺伝子調節におけるそのエンハンサーの役割と相関します。発現低下を評価する野生型対立遺伝子から削除を区別する能力なしには困難です。さらに、2つの対立遺伝子を識別する能力なしに各対立遺伝子に欠失を遺伝子型決定することは、特にPCRにより全体の野生型領域を増幅することは困難である1メガビット23&gt; 10キロバイトの大きな欠失のために、困難です。 ハツカネズミのcastaneusと交差ハツカネズミ 129によって生成されたF1 ES細胞の使用は、二つの対立遺伝子は、対立遺伝子特異的PCR 18,24によって区別されることを可能にします。これらの細胞におけるハイブリッドゲノムは、対立遺伝子特異的欠失スクリーニングおよび発現分析を容易にします。平均的にSNPは、これら2つのゲノムの間のすべての125bpがあります発現および遺伝子型決定のためのプライマーの設計に柔軟性を提供する分析します。 1つのSNPの存在は、プライマーの融解温度（T m）に影響し、二つの対立遺伝子25の識別を可能にするリアルタイム定量PCR（定量PCR）増幅に特異性を標的とすることができます。さらに、プライマーの3 &#39;末端内のミスマッチが大きく、望ましくない対立遺伝子ターゲット26の増幅を防止するプライマーから伸長するDNAポリメラーゼの能力に影響を与えます。 CRISPR / Cas9ゲノム編集システム（ 図1）を使用して、1より大きいκBの対立遺伝子特異的エンハンサーの欠失、およびその後の発現解析のためにF1 ES細胞の使用は、以下の手順で説明します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> シス -regを 研究するためにCRISPR / Cas9を使用して、図1エンハンサーの削除遺伝子発現のピュレーション。 ハツカネズミ 129とハツカネズミのcastaneus間の交差によって生成された（A）F1 ES細胞は、対立遺伝子特異的欠失を可能にするために使用されます。 （B）2ガイドRNA（gRNA）は、エンハンサー領域の大Cas9媒介性欠失を誘導するために使用されます。 （C）プライマーセットは、大モノおよび二対立遺伝子の欠失を同定するために使用されます。オレンジ色のプライマーは内側プライマーである、紫色のプライマーは、外部プライマーであり、緑のプライマーはgRNAフランキングプライマーです。遺伝子発現の（D）の変更は、対立遺伝子特異的定量PCRを使用して監視しています。 RFUは相対蛍光単位を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>gRNAアセンブリに使用されるハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning</td><td>Vector Addgene</td><td>41824</td><td>このベクターに標的配列をクローニングしてgRNAプラスミドを作成します</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>Codon-optimized SpCas9 and EGFP共発現プラスミド</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 100 &micro;L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator トランスフェクション技術</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>ゲノムDNA抽出試薬</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel &PCRクリーンアップ</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>高速プラスミドミニキット</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Plasmid Kit エンドトキシンフリー&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR selected mix for CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>qPCR reagent</td></tr><tr><td>iScript cDNA synthesis kit</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>逆転写試薬</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン with EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 MEDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA フラクション V (7.5%)</td> <td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>最大効率 DH5&alpha; コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES セル</td><td></td><td>FBSは、マウスES細胞の多能性について事前に試験を受けています</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>シーリングテープ</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>アルコールフリー細胞凍結容器</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>F1 ES細胞培養用阻害剤</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>F1 ES細胞培養用</td></tr><tr><td>阻害剤 LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>F1 ES細胞培養用阻害剤</td></tr></tbody></table>

生成crispr / cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancersは、組織特異的な遺伝子発現を位置と向きに依存しない方法で制御することにより、細胞の同一性を制御します。これらのエンハンサーは、多くの場合、遺伝子間領域の調節遺伝子から遠位に位置したり、別の遺伝子の体内にさえ位置します。エンハンサー活性の位置に依存しない性質により、エンハンサーをそれらが調節する遺伝子と一致させることは困難です。エンハンサー領域の欠失は、エンハンサー活性の直接的な証拠を提供し、内因性遺伝子転写におけるエンハンサーの役割を明らかにするためのゴールドスタンダードです。従来の相同組換えに基づく欠失法は、近年のゲノム編集技術の進歩により、多数のモデル生物のゲノムを迅速かつ正確に位置特定することが可能になりました。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、特注の発現プラスミドからのガイドRNAによってCas9をゲノムに標的化することが容易であるため、多くの細胞タイプや生物のゲノムを迅速かつコスト効率よく操作するために使用できます。必須遺伝子調節要素のホモ接合性欠失は致死性につながるか、細胞表現型を変える可能性がありますが、転写エンハンサーのモノアレル欠失は、この交絡問題なしに遺伝子発現のシス調節の研究を可能にします。ここに提示されるのは、F1マウス胚性幹(ES)細胞(Mus musculus129 x Mus castaneus)におけるCRISPR/Cas9媒介欠失のプロトコルです。モノアレルの欠失、スクリーニング、および発現解析は、これらの細胞で平均125 bpごとに発生する2つの対立遺伝子間の一塩基多型(SNP)によって促進されます。

ここで説明するプロトコルは、CRISPR / Cas9ゲノム編集（ 図1）を使用して生成された1アレルエンハンサー削除細胞における遺伝子発現のシス -regulationを研究するためにF1 ES細胞を使用しています。遺伝子型決定および遺伝子発現のためのgRNAおよび対立遺伝子特異的プライマーの設計は、このアプローチにおける重要な要因です。各対立遺伝子特異的プライマーセットは、対立遺伝子特異性を確認するために、定量PCRによって検証されなければなりません。唯一のそれぞれのゲノムDNA標的を増幅対立遺伝子特異的プライマーは、（ 図2）理想的です。理想的には、これらのプライマーは、その3 &#39;末端にSNPを持っています。それらは誤った遺伝子型25対正確なそれらの増幅を5 Ct値の差の最小値を表示する場合、以下の対立遺伝子特異性プライマーを使用することができます。 3 &#39;端から4 番目の塩基よりも5&#39;より多くのSNPを運ぶプライ...

エンハンサー活性の実験的検証は、機能喪失分析によって最もよくアプローチされます。ここで紹介するのは、CRISPR/Cas9を介した欠失を使用して、ハイブリッドゲノム(Mus musculus129 x Mus castaneus)を含むF1 ES細胞における遺伝子転写の対立遺伝子特異的調節を研究する効率的なプロトコルです。

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

本手順の全体的な目的は、アレル特異的なCRISPR/Cas9媒介欠損を用いて、マウス胚性幹細胞における遺伝子転写の調節を研究することです。この手法の主な利点は、ハイブリッドゲノムを使用してモノアレル欠損を生成し解析できることです。これにより、生存不能である可能性のあるモノアレル増強欠損を解析する必要がなくなります。この手法は、機能ゲノミクス分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、特定のエンハンサーがどの遺伝子を制御しているのか、また、その遺伝子の活性が特定のエンハンサーにどの程度依存しているか、といった点です。本手法は幹細胞の多能性に関する洞察を提供できるだけでなく、他の系にも応用可能です。例えば、幹細胞がどのように運命を変えてニューロン、血液細胞、または筋肉になるかを理解するのに役立ちます。使用するガイドRNA（gRNA）を設計、構築し、その配列を確認した後、エンドトキシンフリーのプラスミドをES細胞にトランスフェクションする準備をします。遠心分離機を用いて、Mus musculus 129とMus castaneusを交配させて作製したF1胚性幹細胞 1×10⁶個を、1.5 mLチューブ内で 300 ×g で5分間遠心し、ペレット化します。遠心分離後、上清を捨て、キットメーカー提供の再懸濁バッファーを100 µL加えます。標的DNA領域を欠失させるには、P Cas9 GFP 5-primeおよび3-prime gRNAプラスミドをそれぞれ5 µg加えます。ピペットを用いて、静かに混ぜ合わせます。気泡が入らないように注意してください。次に、マイクロポレーターの電子ピペットチップを使用して、チップ内に空気が入らないように注意しながら、エレクトロポレーションミックスを100 µL吸引します。その後、ピペットをトランスフェクション装置に装着してください。適切なプロトコルを選択し、スタートボタンを押します。エレクトロポレーションの動作中にチップを観察してください。正しくセットアップされていれば、チューブ電極から小さな気泡が発生します。スパークが発生した場合は気泡が存在することを示しており、トランスフェクションを妨げます。この場合は、新しい細胞バッチを用いてエレクトロポレーションをやり直す必要があります。エレクトロポレーション後、トランスフェクションした細胞を、10 mLのES細胞培地を含む10 cmのゼラチンコートディッシュに排出します。トランスフェクションした細胞を37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。48時間後、フローサイトメーターを用いてCas9 GFP陽性ES細胞をソートして単離します。次に、10 mLのES細胞培地を含む10 cmのゼラチンコートディッシュに、1〜1.5 × 10⁴個のGFP陽性細胞を播種します。この低密度で播種することで、個々のES細胞コロニーのピックアップが容易になります。4〜5日後、顕微鏡を用いて、球状の単一ES細胞コロニーを識別します。ピペットを使用して、各コロニーを、ゼラチンで前処理され30 µLのtrypsomを含む96ウェルプレートの各ウェルに転移します。すべてのコロニーをピックアップし、培地中で分散させた後、ほとんどのウェルのコンフルエンシーが70%を超えるまで、二酸化炭素インキュベーター内にて37°Cで培養します。通常、これには約2日かかります。細胞を継代する準備が整ったら、培地を除去し、30 µLのtrypsinを添加します。細胞を5分間インキュベートします。次に、トリプシンを中和するため、各ウェルに180 µLのES細胞培地を加えます。ピペッティングを行い、単一細胞懸濁液にします。各ウェルから70 µLを、130 µLのES細胞培地を分注したゼラチンコート済み96ウェルプレート3枚のそれぞれに転移します。37 °Cでインキュベートします。プレートが70〜85%のコンフルエンシーに達したら、以降のセクションで説明するように、各クローンのジェノタイピングおよび発現解析に使用します。付属文書に従って、細胞ストックを凍結します。ここでは、目的の欠失を確認するために、クローンをスクリーニングするための4組のプライマーを設計します。これらには、内部プライマー、外部プライマー、および5'末端と3'末端の両方のgRNA標的部位に対するgRNA隣接プライマーが含まれます。まず、ここに表示されているウェブサイトにアクセスし、129およびCas遺伝子型に対応する一塩基多型（SNP）トラックを入手します。これにより、Mitchell LabのCRISPRウェブページに誘導されます。そこで、指定されたリンクをクリックしてください。サイトは、MM-9マウスゲノムアセンブリにおける129系統とCasゲノム間のSNPを表示するトラックを含むUCSCゲノムブラウザにリダイレクトされます。次に、欠損させる領域の座標を入力し、「go」をクリックしてください。目的の欠損部位の中央付近で、3つ以上のSNPを含む約500塩基対の領域をズームアップします。SNPが少ない場合、アレル特異的プライマーの設計は困難になることがあります。完全なアレル特異的プライマーの設計が不可能な場合は、緩やかなアレル特異的プライマーを使用しても構いません。その際、qPCR結果の解析時に、欠失クローンと非欠失クローンのCT値を比較することを忘れないでください。次に、上部パネルの「View」をクリックします。ドロップダウンメニューから「DNA」を選択してください。「Get DNA in Window」ページが表示されます。配列のフォーマットオプションで「すべて大文字（all uppercase）」を選択し、「Get DNA」をクリックして、ターゲット配列をすべて大文字の形式で表示させます。この配列をコピーしてWordドキュメントファイルに貼り付けます。次に、その配列を129 cast snipトラックと比較し、スニップ（snip）の位置をハイライトして、129個のスニップを小文字でマークします。129の配列が完了したら、それをコピーしてFast Day形式の配列を2種類作成します。1つは129用、もう1つはCas用です。Casの配列では、各スニップ位置に正しい塩基を代入し、そのスニップを小文字で表記してください。次に、配列に対応するゲノム（129またはCas）をラベル付けします。その後、ブラウザにPrimer3Plusのアドレスを入力します。適切な領域に、スニップ置換後の129配列をペーストします。デフォルト設定を使用してプライマーを設計します。内部アレル特異的プライマーを設計するには、「Task」の右側にあるドロップダウンメニューをクリックして「Primer List」を選択し、次に「Pick Primers」をクリックします。フォワードプライマーとリバースプライマーのリストが表示される新しいページが開きます。選択ボックスをチェックして、3'末端または3'末端から4塩基以内に小文字でスニップ（snip）がマークされたフォワードプライマーまたはリバースプライマーを選択します。3'末端にスニップがあるプライマーは、qPCRにおいてアレル特異性が向上することに留意してください。画面下部の「Send to Primer3 Manager」をクリックします。選択したプライマーを表示する新しいページが開きます。2番目のプライマーを選択するには、プライマーリストのページに戻り、戻るボタンをクリックしてメインページに戻ってください。タスクのドロップダウンメニューから、「Detection」を選択します。メインページが更新され、下部にフォワードプライマーとリバースプライマーの配列入力ボックスが表示されます。最初のプライマー配列を適切なボックスに貼り付けます。次に、「Main」タブの隣にある「General Settings」タブに移動し、産物サイズの範囲の設定を 80 から 200 base pairs に変更します。「Pick Primers」をクリックします。最初のプライマー配列に対して、5つの候補プライマーペアが表示されるページが開きます。プライマーの左側にあるチェックボックスを選択して、リストからプライマーセットを選び、画面下の「Send to Primer3 Manager」をクリックします。これらが、129 内部アレル特異的プライマーになります。これらの手順を繰り返し、castアレル用のプライマーを設計します。次に、この手法を外側のアレル特異的プライマーおよび非アレル特異的プライマーの設計に適用します。最後に、付属の文書に記載されている方法でqPCRを用い、プライマーのアレル特異性を検証します。先に準備した96ウェルプレートからゲノムDNAを抽出します。プレートを短時間遠心分離し、凝結した液滴をウェルの底に集めます。このDNAは、欠損スクリーニングのテンプレートとして使用します。次に、384ウェルプレートを用いて、各クローンについてqPCRを重複して行います。2ステップPCRを実施し、続いて検出を伴う融解曲線分析を行います。ラン終了後、まず内部アレル特異的プライマーを用いて、各アレルの増幅を確認します。一方のアレルが増幅しないか、あるいはアレル間でCT値に5サイクル以上の差がある場合は、これらのクローンがヘテロ接合型欠失を有していることを示唆しています。両アレルとも増幅しない場合は、ホモ接合型欠失を有していることを示唆します。次に、外側のアレル特異的プライマーを用いて、各アレルの増幅を確認します。標的欠失が1 KBより大きい場合、欠失が存在する場合にのみ、外側プライマーによる増幅が起こります。CT値が22から28であれば、欠失が確認されます。標的欠失が1 KBより小さい場合は、電気泳動によりアンプリコンサイズを確認してください。欠失クローンの96ウェルプレートを、アレル特異的な内部プライマーを用いたqPCRによりスクリーニングした。グレーのバーはCas特異的プライマーによる増幅を、黒のバーは129特異的プライマーによる増幅を表す。内部プライマーでのCT値が低いか、あるいは増幅が見られない場合は、ターゲットの欠失を示している。一方または両方の対立遺伝子に欠失を持つクローンを、外側プライマーを用いてスクリーニングします。外側プライマーによる増幅で、欠失の有無を確認します。モノアレル欠失を持つクローンについては、gRNA標的領域に隣接するプライマーを用いてスクリーニングを行い、欠失のない方の対立遺伝子にインデル（挿入または欠失）が生じていないことを確認します。その後の発現解析には、非欠損アレル上の標的部位に大きなインデル（挿入・欠損）がないモノアレルクローンのみを使用します。ここでは、129またはCas SCR欠損クローンの代表的な結果を示しています。SCRは、ES細胞において最近報告されたSox2特異的なエンハンサーです。赤色のバーはSox2 Casアレルによる発現を、青色のバーはSox2 129アレルの増幅を示しています。この図からわかるように、129アレルまたはCasアレルのSCRを欠損させると、CISにおけるSox2の発現が減少しました。このビデオを視聴することで、CRISPR技術を用いて大きな欠損を導入する方法と、アレル特異的プライマーを用いて欠損クローンのジェノタイピングを行う方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶCRISPR/Cas9を用いた1アレル欠失法でマウス胚性幹細胞におけるエンハンサー機能と遺伝子発現制御を研究する方法。ハイブリッドゲノムを活用した機能ゲノミクス解析に役立ちます。

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

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