脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

この手順の全体的な目標は、脳奇形障害の新規候補遺伝子を特定し、その原因となる役割を生体内で直接確認することです。この戦略は、脳の発達と関連する病状に関連する分子経路を発見することにより、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この戦略の主な利点は、脳障害に関連する新しい遺伝子の発見と新しい診断ツールの開発に役立つことです。

このアプローチを使用して、異常なニューロンの移動によって引き起こされる脳奇形である脳室周囲結節性ヘテロトピアの病因におけるC6orf70遺伝子の重要な寄与を明らかにすることができます。手順を実演するのは、私たちの研究室のエンジニアであるFabienne Schallerです。E15妊娠ラットを、書面によるプロトコルに概説されている手順、および機関および国のガイドラインに従って準備します。

動物が適切に麻酔されていること、眼科用軟膏が目に適用されること、および腹部が適切に剃られ、消毒されていることを確認してください。鋭いハサミを使用して、尾側腹部の正中線の皮膚と筋肉に2センチの垂直切開を行った後、腹腔から1つの子宮角を慎重に露出させます。摂氏37度に温めた生理食塩水を滴下して、胚に潤いを与えます。

処置中、子宮を湿らせてください。DNAを注入するには、胚を片手でそっと持ち、頭に簡単にアクセスできるようにします。次に、もう一方の手を使用して、マイクロインジェクターに接続されたガラスキャピラリーを、正中線から1ミリメートル、深さ2〜3ミリメートルの左側にある左側脳室に慎重に挿入します。

マイクロインジェクターを使用して、約1マイクロリットルのDNAをファストグリーンで注入し、注射を視覚的に監視できるようにします。DNAを細胞にエレクトロポレートするには、まず通常の生理食塩水を3 x 7 mmの電極の表面に滴下します。次に、正極を注入側に置き、負極を注入していない右心室に置きます。

フットコントロールペダルを使用して、950ミリ秒間隔で5つの電気パルスを送ります。エレクトロポレーション後、子宮角を腹腔に戻し、滅菌生理食塩水を追加して、胚がより自然に位置を特定し、術中の体液損失を考慮に入れます。吸収性の外科用縫合糸で筋肉壁を閉じ、次に単純な中断縫合糸を使用して皮膚を閉じます。

術後鎮痛を最大 48 時間、または施設のガイドラインに示されているように提供します。ラットを清潔なホームケージに戻し、麻酔から出てくるまで監視します。プロトコルの書面による部分に概説されているように、脳を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、PBSで10分間洗浄します。

洗浄中は、溶解したアガロースの温度が摂氏50度を超えないように、PBSで50ミリリットルの4%寒天を準備します。アガロースをプラスチックの埋め込み型に流し込み、脳をアガロースに入れます。埋め込まれた脳を摂氏4度に置き、アガロースを少なくとも1時間重合させます。

アガロースが重合した後、脳の周りから余分なアガロースを取り除き、次に脳をビブラトームベースプレートに接着し、ブレードに垂直な脳の前方後方アクセスを確保します。接着剤が乾くのを数分待った後、接着された脳のプレートをビブラトームチャンバーに入れます。ビブラトームにPBSを充填し、厚さ100ミクロンの切片をスライスし始めます。

切片作成後、切片を顕微鏡スライドに移し、余分な液体を取り除きます。次に、封入剤を数滴加え、セクションの上にカバースリップを置きます。一晩乾燥させます。

レーザー走査型共焦点顕微鏡で10倍の倍率を使用して切片を画像化します。画像を解析するには、まず定量画像解析に適したソフトウェアを使用して画像を8ビットに変換します。次に、代表的なGFPポジティブ蛍光セルを1つ選択し、推定をクリックし、フリーハンド選択ツールを使用してセルの境界を描画することにより、その形状を手動で定義します。

ソフトウェアは、セルの直径と強度のしきい値を自動的に保持します。「細胞を検索」をクリックすると、トランスフェクションされた細胞が皮質全体に局在化することができます。次に、必要に応じて、誤検出を手動で削除します。

領域ツールをクリックし、8つの領域ストライプを選択することにより、皮質の全厚さを8つの関心領域に分割し、個々のセクションで正規化します。ストライプ1と8はそれぞれ心室ゾーンと皮質プレートの上部に対応します。次に、[適用]をクリックして、ソフトウェアが皮質全体におけるGFPトランスフェクション細胞の相対位置をカウントできるようにします。最後に、[定量化の保存]をクリックして、分析用にデータをExcelファイルにエクスポートします。

アレイCGHと全エクソームシーケンシングにより、C6orf70は発生遺伝子異常の候補遺伝子として同定されました。定量的PCRにより、この遺伝子はPHF10およびDLL1とともにラット大脳皮質で発現していることが決定されました。以下の画像は、エレクトロポレーションの5日後におけるE20ラット脳の代表的な新皮質冠状切片を、緑色蛍光タンパク質コンストラクト単独、またはC6orf70コード配列を標的とするshRNAと組み合わせた、または相対的に効果のないミスマッチコンストラクトを用いて

フィラメントAノックダウンは、ニューロンの移動障害の制御として使用されました。C6orf70を標的とするshRNAを用いた子宮内エレクトロポレーション、またはフィラメントAは、白い矢印で示されているように、心室領域内のGFP陽性細胞の停止を誘発しましたが、GFPを単独で発現する細胞、またはミスマッチコンストラクトと組み合わせて発現する細胞は、ニューロンの移動を変化させませんでした。この手順を試みる際には、ニューロンの増殖、移動、または成熟のいずれかで、皮質発生のどの状態を分析したいかを念頭に置くことが重要です。

げっ歯類の胚の脳で子宮内エレクトロポレーションを行うことを学ぶには、長いトレーニング期間、スキル、および定期的な練習が必要であることを忘れないでください。