脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

本プロセスの全体的な目的は、脳奇形疾患の新規候補遺伝子を特定し、その原因としての役割をin-vivoで直接的に確認することです。この戦略は、脳の発達および関連する病理に関連する分子経路を明らかにすることで、神経生物学分野における重要な課題の解決に寄与します。本戦略の主な利点は、脳疾患に関連する新規遺伝子の発見を促進し、新たな診断ツールの開発に役立つことです。

この手法を用いることで、神経細胞の移動異常によって引き起こされる脳奇形である心室周囲結節性異所性灰白質（PVNH）の病態におけるC6orf70遺伝子の重要な寄与を明らかにすることができました。本手順の実演は、当研究室のエンジニアであるFabienne Schallerが行います。書面によるプロトコルに記載された手順に従い、また施設および国のガイドラインに基づき、胎齢15日（E15）の妊娠ラットを準備してください。

動物が適切に麻酔されており、眼に眼軟膏が塗布され、腹部が適切に除毛および消毒されていることを確認します。鋭いハサミを用いて尾側腹部正中線の皮膚と筋肉に2 cmの垂直切開を加え、腹腔から子宮角の片側を慎重に露出させます。胚を保湿するため、37 °Cに予熱した生理食塩数を滴下します。

処置の間、子宮を常に湿らせた状態に保ってください。DNAを注入するには、胚の頭部が操作しやすいように片手で優しく保持します。次に、もう一方の手で、マイクロインジェクターに接続したガラスキャピラリーを、正中線から1 mm外側かつ深さ2〜3 mmに位置する左側脳室に慎重に挿入します。

マイクロインジェクターを用いて、注入状態を視覚的にモニタリングできるように、fast greenを含むDNAを約1 µL注入します。DNAを細胞内にエレクトロポレーションするために、まず3 mm × 7 mmの電極表面に生理食塩水を滴下します。次に、陽極を注入側に、陰極を注入していない右心室に配置します。

フットスイッチを使用して、950ミリ秒間隔で5回の電気パルスを印加します。エレクトロポレーション後、子宮角を腹腔内に戻し、胚がより自然に配置されるようにし、また術中の水分喪失を補うために滅菌生理食塩水を注入します。吸収性手術用縫合糸で筋壁を閉鎖し、その後、単純結節縫合で皮膚を縫合します。

術後の鎮痛処置を最大48時間、または施設基準に従って指示された期間提供します。ラットを清潔なホームケージに戻し、麻酔から覚めるまで観察します。プロトコルの記述部分に記載されている手順に従って脳を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、PBSで10分間洗浄します。

洗浄を行う間に、PBSを用いて4%アガロース溶液を50 milliliters調製します。この際、溶解したアガロースの温度が50 degrees Celsiusを超えないように注意してください。アガロースをプラスチック製の埋め込み用モールドに注ぎ、そこに脳を配置します。埋め込まれた脳を4 degrees Celsiusで保存し、アガロースを少なくとも1時間重合させます。

アガロースが重合した後、脳の周囲の余分なアガロースを切り取り、脳の前後軸が刃に対して垂直になるようにして、脳をビブラトームのベースプレートに接着します。接着剤が乾燥するまで数分間待った後、脳を接着したプレートをビブラトームのチャンバーに入れます。ビブラトームにPBSを満たし、厚さ100 µmの切片を作成します。

切片作成後、切片を顕微鏡スライドガラスに移し、余剰な液体を除去します。次に、封入剤を数滴滴下し、切片の上にカバーガラスを被せます。一晩乾燥させてください。

レーザー走査型共焦点顕微鏡を用い、10倍の倍率で切片を撮影します。画像を解析するために、まず定量的な画像解析に適したソフトウェアを使用して、画像を8ビットに変換します。次に、代表的なGFP陽性蛍光細胞を1つ選択し、「estimate」をクリックしてフリーハンド選択ツールを用いて細胞の境界を描き、その形状を手動で定義します。

ソフトウェアが細胞の直径と強度しきい値を自動的に保持します。[find cells]（細胞を検索）をクリックし、皮質全体でトランスフェクションされた細胞をソフトウェアに局在化させます。その後、必要に応じて、偽陽性を手動で除去してください。

リージョンツールをクリックし、8つのリージョンストライプを選択して、個々のセクションで標準化された8つの関心領域に皮質の全厚を分割します。ここで、ストライプ1と8はそれぞれ脳室帯と皮質板の最上層に対応します。次に、「適用（apply）」をクリックし、ソフトウェアに皮質全体におけるGFP導入細胞の相対的な位置をカウントさせます。最後に、「定量化を保存（save quantification）」をクリックして、解析用にデータをExcelファイルにエクスポートします。

アレイCGHおよび全エクソーム解析により、発達性遺伝子異常の候補遺伝子としてC6orf70が特定されました。定量PCRの結果、この遺伝子はPHF10およびDLL1とともにラットの大脳皮質で発現していることが判明しました。以下の画像は、緑色蛍光タンパク質のみのコンストラクト、またはC6orf70コード領域を標的とするshRNA、あるいは相対的に効果のないミスマッチコンストラクトを併用してエレクトロポレーションを行った5日後の、E20ラット脳の代表的な新皮質冠状断切片を示しています。

神経細胞移動の障害を対照とするため、Filament Aのノックダウンを用いました。C6orf70またはFilament Aを標的とするshRNAを用いた子宮内電極法により、白矢印で示すように、GFP陽性細胞が脳室帯内で停止しました。一方、GFP単独、またはミスマッチ構築物と組み合わせて発現させた細胞では、神経細胞の移動に変化は見られませんでした。この手順を行う際は、神経細胞の増殖、移動、あるいは成熟など、皮質発生のどの段階を解析したいかを考慮することが重要です。

げっ歯類の胚脳における子宮内電穿孔法を習得するには、長期のトレーニング期間、熟練した技術、および継続的な練習が必要であることを忘れないでください。