脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。

この実験の全体的な目標は、ex-vivo光遺伝学を使用して、神経投影とマイクロ回路の機能的およびシナプス特性を調査することです。これには、チャネルロドプシンの発現と、特定の投影でのその活性化とパッチクランプ記録の組み合わせが含まれます。この方法は、脳領域内および脳領域間の局所的および長距離接続のシナプス特性に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

これは、恐怖行動をサポートする神経回路を調査していることを示しています。この技術の主な利点は、従来の電気刺激技術では対応できない回路やシナプスを研究できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、必要なすべてのステップを最適な方法で実行するという課題を克服する必要があります。

これには、ウイルス注射の定位ターゲティング、チャネルrhodpsinの最適な発現時間の特定、良質な脳切片の調製、安定した光の活性化と記録が含まれます。この部分の手順を開始する前に、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現するように操作された組換えアデノ随伴ウイルスベクターを、定位手術によって内側前頭前皮質に導入されました。サファイアブレードをはめ込み、厚さ320ミクロンにカットするように設定して、ビブラトームを準備します。

承認された方法に従って犠牲を払い、脳を切除した後、メスを使用して小脳を切り取り、内側前頭前皮質を含む脳の前部を分離します。脳の前部を氷冷した切断液にスライスするまで入れます。冷却ユニットを使用して、摂氏4度に維持された氷冷切断液を切断チャンバーに充填します。

溶液を酸素化します。濾紙で脳を拭き取り、乾かします。ビブラトームステージに対して35度の角度でカットされた4%の寒天ブロックを接着し、脳組織の後部をこのブロックに接着します。

スライスしながら安定性を確保するために、脳ブロックの前と後ろに2つの追加の寒天ブロックを接着します。ティッシュを貼り付けたステージをカッティングチャンバーに置き、水没していることを確認します。急性スライスのカットを開始します。

各スライスを半分にカットし、室温で酸素化ACSFが供給されるインターフェースチャンバーに移します。急性扁桃体スライスを切断した後、界面チャンバーを摂氏36度のウォーターバスに入れ、スライスを35〜45分間回復させます。注入部位を含むスライスの一部をポストホック分析のために固定するには、2枚の濾紙で挟み込み、PBS中の4%パラホルムアルデヒドに一晩浸します。

ここでは、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現するように操作された組換えアデノ随伴ウイルスベクターを、定位手術により内側膝状核と隣接する後層内核の内側分裂に導入しました。脳を手に入れたら、メスを使って脳の小脳と前部を切除し、その後、以前と同様に氷冷した切断液で脳の中央部を冷却します。濾紙で脳を拭き取り、ビブラトームの段階に接着します。

繰り返しになりますが、スライス中の安定性のために、脳の後ろに追加の寒天ブロックを固定します。摂氏4度の切断液で満たされた切断チャンバーにステージをはめ込んだ後、扁桃体を通して320ミクロンの冠状切片を切断し、それらを半分に切断し、以前と同様に界面チャンバーに切片を回収します。蛍光照明を用いた実体顕微鏡で注射部位を確認します。

ファイバーや細胞の光遺伝学的活性化のためのパッチ顕微鏡を準備するには、取り付けられた発光ダイオードまたはLEDを光送達経路の中央に配置します。パワーメーターを使用して、背面焦点面と各対物レンズの出力におけるLEDの光強度を470ナノメートルの波長で測定します。スプレッドシートを使用して、光量をミリワット/ミリメートルの二乗で計算し、各対物レンズの検量線を作成します。

次に、界面チャンバーから急性扁桃体スライスを取り出し、顕微鏡に取り付けたスライスチャンバーに入れます。インターフェースチャンバーで上向きのスライス面が記録チャンバーでも上向きになるようにスライスを配置します。スライスを新鮮な酸素化ACSFで毎分1〜2ミリリットルの速度で灌流します。

気温は約31°Cです。蛍光灯を点灯し、発現する特定の蛍光タンパク質に適したフィルターセットを選択します。5倍対物レンズを使用して、概要を把握します。

また、ターゲット領域内のファイバー密度を評価するための60倍の対物レンズ。次に、実験の必要に応じて、顕微鏡の光路の開口部を開くか制限します。パッチ記録を取得するには、パッチピペットに内部溶液を充填し、電極ホルダーに取り付けます。

パッチピペットに陽圧を加え、ゆっくりと浴液に下げます。次に、視覚的制御の下で、マイクロマニピュレータを使用してパッチピペットをスライスに下げます。パッチピペットで目的のニューロンに側面と上部からアプローチします。

ピペットが細胞の表面に到達したら、細胞表面に見えるくぼみで示されるように、陽圧を解放します。負圧を加えてギガシールを取得します。さらに吸引力を加えてメンブレンパッチを破裂させ、全細胞記録を取得します。

次に、細胞からの電気的応答を記録しながら、470ナノメートルの波長光でチャネルロドプシンを活性化することにより、接続されたLEDで標識されたファイバーを刺激します。シナプス刺激の場合は、データ収集ソフトウェアのデジタル出力を使用してLEDをトリガーします。LEDの刺激強度を手動で調整します。

次に記録された細胞に対して、または特定の試験物質の存在下で、必要に応じて、開口部を開いたり制限したりして刺激を繰り返します。記録後、スライスを2つの濾紙で挟み込み、4%のパラホルムアルデヒドに一晩沈めて、事後分析用にスライスを固定します。内側前頭前皮質からの線維は光遺伝学的対パルス刺激を使用して刺激され、興奮性シナプス後電流は基底外側扁桃体主ニューロンと介在ニューロンから記録されました。

これらの代表的なトレースは、刺激から誘発される対脈拍促進と対脈抑制を示しています。次の2つの画像は、内側前頭前皮質からの線維の光遺伝学的活性化によって誘発されるフィードフォワード阻害を示しています。この最初の画像は、基底外側扁桃体主ニューロンの代表的な興奮性シナプス後電流70ミリボルトと0ミリボルトの抑制性シナプス後電流を示しています。

抑制性シナプス後電流は、興奮性シナプス後電流と比較してシナプス潜時が長く、それぞれジシナプス入力と単シナプス入力を示します。この画像は、50ミリボルトの位相興奮性および抑制性シナプス後電流シーケンスによって誘発される光が、AMPAカイニン酸拮抗薬であるCNQXによって遮断され、抑制性シナプス後電流のジシナプス性をさらにサポートしていることを示しています。この画像は、塩化物チャネル遮断薬、ピクロトキシン、およびピクロトキシンとCNQXの併用による50ミリボルトでの興奮性および抑制性シナプス後電流配列の後続のブロックの影響を示しています。

抑制性シナプス後電流はピクロトキシンによってブロックされ、残りの興奮性シナプス後電流はCNQXによってブロックされます。一度マスターすれば、脳スライスの準備と光誘発反応の記録は、数時間から丸一日で行うことができます。前提条件は、良好な注射部位と、研究対象の細胞および突起におけるチャネルロドプシンの十分な発現です。

この手順に続いて、標識された軸索やシナプスの解剖学的研究などの他の方法を、光顕微鏡および電子顕微鏡レベルで実行できます。これにより、活性化シナプスの解剖学的および分子的特性と機能を相関させることができます。このビデオを見れば、光活性化繊維と脳スライスの分析に必要なすべてのステップを十分に理解できるはずです。

これには、チャネルロドプシンの発現、標識線維の評価と活性化、シナプス応答の記録と解析が含まれます。