Name: 脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶ脳スライスにおけるex vivo光遺伝学を用いた恐怖回路の機能・シナプス特性の解析法。channelrhodopsin発現とパッチクランプ記録により、局所および長距離神経投射のシナプス動態を詳細に解明できます。

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代表的な結果を取得するための協力をいただいたCora Hübner氏とAndrea Gall氏に感謝します。この研究は、Excellence Initiative(EXC 307)の枠組み内でDeutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)が資金提供するExcellence Initiativeである、テュービンゲン大学のWerner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience(CIN)とCharitable Hertie Foundationの資金によって支援されました。

倫理文は：すべての実験手順は、研究における動物の使用に関するEU指令に従ったと地元の動物実験委員会によって承認された（Regierungspräsidiumチュービンゲン、バーデン・ヴュルテンベルク州、ドイツの状態）テュービンゲン大学の責任。 1.定位注入手順<ol><li>滅菌器を使用して滅菌ツール（はさみ、メス、クランプ、ドリル、針、縫合糸材料）を準備します。例えば滅菌外科用ドレープ上の滅菌綿スワップ、消毒、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で、およびH 2 O 2のような滅菌ツールや他の必要なソリューションや手術用品を配置します。 </li><li>製造元の指示に従って水平微小電極プラー上に幅3mmのボックスのフィラメントを使用して、注射剤（ 図1A、挿入図）用ガラスマイクロピペットを引き出します。 注：深い注射のために、電極のテーパーが十分でなければなりません腹最も座標に到達するのに長い（約5ミリメートル;座標のため、1.10を参照してください）​​。 </li><li>プレミックスウイルス溶液1μl及び滅菌PBS中の0.1％ファーストグリーン液0.2μlの（ガラスピペット内の溶液の優れた視認性のため）。先端の細い（ 図1A、挿入図）とマイクロリットルピペットを使用してウイルス液と高速グリーンの混合物とガラスピペットを埋めます。 注：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAVの）と協力はバイオセーフティーレベル1（BSL 1）仕事と考えられ、BSL 1実験室で実施する必要があります。この研究（ 図1C）で使用rAAVsは以下の通りであった：1）のmPFC：のrAAV-HSYN-のChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）16。 2）MGM / PIN：のrAAV-CAGh-のChR2（H134R）-mCherry（血清型2/9）23。 3）mpITC / BLA：のrAAV-EF1A-DIOhChR2（H134R）-YFP（血清型2/1）23 </li><li>小動物麻酔機（：誘導のための酸素中3％イソフルラン）を使用して、マウスを麻酔。 注：この研究で使用したマウスは4でした -7週齢と以下の株と遺伝子型の：のC57Bl6 / J野生型（ 図2Aと3A-Dでの実験）。 GAD67-GFP 24（ 図2Bおよび3E-Hでの実験）。 TAC2-Creを25（ 図2Cおよび3I-Jでの実験）。 </li><li>耳と目の間に頭を剃ります。綿棒を使って剃った頭に消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔中に目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。皮下鎮痛剤（メロキシカムベースの5mg / mlの溶液0.1 ml）でマウスを注入します。 </li><li> （：保守のための酸素中2％イソフルラン）定位フレーム（ 図1A）でマウスを置き、ガス麻酔のマスクを介して麻酔を維持します。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 注：全体の外科手術中に無菌状態並びに可能を維持します。使い捨てフェイスマスクを着用し、手術用外出WN、および手袋。 </li><li>はさみを使って頭の上に皮膚切開を行います。優しく、鈍鉗子を使用して、側に皮膚を引っ張って頭蓋骨の表面を露出するようにクランプで固定し、そしてH 2 O 2とクリーン頭蓋骨。 </li><li> （ 図1B）両半球のための先端の細い油性マーカーとドリル穴を使用して頭蓋骨上のマーク注射部位。 （ブレグマ（ミリメートル）から）この研究での注射のためにされている座標：のmPFC：0.3±横前方1.9、腹2.1。 MGM / PIN：1.8±横、3.0事後、腹側3.8。 mpITC / BLA：3.35、および4.75腹±横、1.45後部。 </li><li>圧力噴射装置に接続された定位フレーム上に充填されたガラスピペットをマウントし、ブレグマの位置にピペットをもたらします。 </li><li>ファインストレートチップピンセットを用いてガラスピペットの先端を折り。ウイルス溶液のエアロゾル発生を防止するために静かにこれを行います。いくつかの圧力パルスを印加し、ヴィルの液滴の押し出しを観察することにより、ピペットチップが開いていることを確認しますsのソリューション。 </li><li>目標噴射座標に移動し、圧力噴射装置で次の設定を使用してピペットコンテンツ（〜0.5マイクロリットル）の半分を注入：圧力：20 psiで、平均パルス長さ：30ミリ秒、パルスの平均数：50。 </li><li>それを後退ゆっくり（1ミリメートル/分）の前〜1分間の場所にピペットを残します。 注：必ずピペットは、他の半球で同じピペットで手順を繰り返す前にブロックされていないことを確認します。ブロックされたチップの場合には、クリーンまたは再びブレグマで先端とゼロピペット位置を断ちます。 </li><li> PBS（pH7.4）でクリーン頭蓋骨、一緒に皮膚を引っ張って、個々のボタンの縫合糸で切開部を縫合優しく、クランプを取り外します（3から4ノット）。傷の周りに消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔を停止し、それが完全に目を覚ましになるまで無人マウスを放置しないでください。単一収容さを維持するか、完全に回復するだけで他の動物の会社に戻ります。術後、健康状態を監視し続ける、とadminisター鎮痛剤必要に応じて。地元の動物実験委員会が提案したルールに従って手順に従ってください。 </li></ol>急性スライスの調製<ol><li> ACSF、切削液、ツール（はさみ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット）、および寒天ブロックを準備します。 注：人工脳脊髄液（ACSF）の1 Lは、実験ごとに必要であり、以前に公表16,23のように二重蒸留H 2 O中の化学物質を溶解することにより調製されます。切断溶液を2 M 硫酸マグネシウムストック溶液0.87 mlをACSF 200mlのを補充することによって調製されます。 </li><li>含酸素ACSFおよび95％O 2および5％CO 2を用いて実験を通して溶液を切断します。 </li><li>深くイソフルラン（酸素中3％）を使用して、小動物麻酔機を用いてマウスを麻酔。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 </li><li>大きなハサミを用いてマウスを刎ねると、すぐに冷やします氷のように冷たい切削液中のヘッド。 </li><li>吻側に尾からの単一の正中切開によるオープン頭蓋骨と優しく鉗子を使用して、側面に頭蓋骨の部分を押してください。急速にそっと小さな丸いスパチュラを用いて頭蓋骨からそれを持ち上げることにより、脳を削除します。メスで小脳をカット。氷のように冷たい切削液に脳を置きます。 </li><li> mPFCの注射部位の場合：（のmPFC含む）メスを用いて脳の前部を切断し、スライスまで氷冷切断溶液に入れました。 </li><li>濾紙で余分な切削液を削除し、ビブラトームステージに脳の後部を接着。 </li><li>傾斜扁桃体スライスについては、35°の角度（ 図1D、中央）で切断寒天ブロック（4％）に脳を接着。冠状扁桃体スライス、MGM / PINの注射部位とのmPFCの注射部位については、ステージ上で直接脳を接着（ 図1D、左、右）。スライスしながら、安定性のための脳の後ろに追加寒天ブロックを配置します。 </li><li> Plac冷却ユニットを用いて4℃に維持する氷冷酸素切削液でチャンバー切削Eステージ。サファイアブレードを用いて扁桃体（320ミクロン）の急性スライスを準備します。室温で酸素ACSFに付属のインターフェースチャンバー内のスライスを配置します。 </li><li> 45分 - 急性扁桃体スライスの調製後、35スライスを回復するために、36℃の水浴中でインターフェースチャンバーを配置。その後、RTにインターフェースチャンバーを返します。これらのスライスから記録するために、ステップ3.2に進みます。 </li><li>急性扁桃体スライス（ - 2.9 2.8ステップ）のために、前述したようにステップ2.10の開始時には、注射部位のスライスをカット。水浴内のスライスの回復は、ここで必要とされていません。オプション：すぐに蛍光灯や適切なフィルターセットを搭載したステレオスコープ上のスライスを観察し、注射部位の位置を推定するために。 </li><li> 2濾紙とsubmer間を挟んで事後分析のための注射部位を含むスライスを修正しました。PBS溶液をO / Nで4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれらを銀杏。注射部位の分析のためのステップ4.1に進みます。 </li></ol>シナプス前繊維の3可視化と刺激<ol><li>繊維と細胞の光遺伝学活性化のためのパッチ顕微鏡を準備します。 <ol><li>光伝送路に取り付けられた発光ダイオード（LED）を中心。 </li><li>後焦点面でのLEDの光強度を測定し、470nmでの適切な波長を選択するパワーメータとの各目的の出力で。 </li><li>ミリワット/ mm 2での光強度を計算し、470 nmの波長の測定値のための各目的のための（光出力（ミリワット/ mm 2）と対LEDの輝度（％））の検量線を作成します。 </li></ol></li><li>蛍光ランプを備えた正立顕微鏡に装着スライスチャンバー内のインターフェース室と場所から急性扁桃体スライスを取得します。このようなSLICそのスライスを配置するように注意してくださいインターフェースチャンバーに上向きE面は、記録チャンバー内に上向きに向いています。 〜31℃の温度で2 ml /分 - 1の割合で新鮮な、酸素ASCFでスライスを灌流。 </li><li>発現される特異的蛍光タンパク質のための適切なフィルターセットとの組み合わせで蛍光灯を使用して、スライス内のシナプス前線維を観察します。概要（ 図1E）を得るために5倍対物レンズを使用し、対象領域内の繊維密度の評価のために60倍対物レンズ。 注：GFPとYFPの場合、使用フィルターセット「グリーン」（励起20分の472、ビームスプリッタ495、放射490 LP）mCherryをするために指定されているフィルタセット「赤」（励起40分の560、ビームスプリッタ585、放射70分の630）を使用します材料/機器テーブルインチ</li><li>開くか実験（ 図2D）のために所望のように顕微鏡光路の開口を制限します。 </li><li>パッチ記録を入手するには、内部溶液でパッチピペットを記入し、私はマウントn電極ホルダー。パッチピペットに正の圧力を適用し、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて、スライスに視覚的な制御の下で最初に浴溶液にした後、それを下げます。 <ol><li>サイドとトップからパッチピペットを用いて、関心のニューロンに近づきます。ピペットは、細胞の表面上にあるときに正の圧力を解放し（細胞表面上に目に見えるディンプル）と、負圧を適用することによって、「ギガシール」を得ます。 </li><li>全細胞記録を得るために、膜パッチを破壊するために、さらに吸引を適用します。続いて、細胞からの電気的応答を記録しながらCHR（470 nm）を活性化するための適切な波長を使用して接続したLEDとラベルされた繊維を刺激します。 </li><li>シナプス刺激のために、低いLED強度で開始し、所望のシナプス電流振幅に達するまで増加します。 図中の（タイミングやパルス長さを制御するためのデータ取得ソフトウェアでデジタル出力を設定することで、LEDの例をトリガー3）。 注：他のソフトウェア及び/又はTTL発生装置は、LEDをトリガするために使用することができます。 </li></ol></li><li>次に記録セルのためおよび/または特定の薬物の存在下で所望のように顕微鏡光経路におけるオープンまたは制限された開口部（ステップ3.4）で繰り返し刺激。 </li><li>記録した後、2枚の濾紙の間でそれらを挟んで、4％PFA O / Nでそれらを沈めることによって事後分析のためのスライスを修正します。 </li><li>電気生理学的データを分析します。 注意：使用して、適切なソフトウェアは、個々の刺激をオフライン用に記録されたスイープデータを視覚化します。薬物の効果を分析する場合、すべての個々のスイープのためのシナプス電流振幅に対する薬物効果の時間経過を得るために、ピーク検出ルーチンを使用します。薬剤効果が定常状態に達したときに決定します。実験条件ごとの平均≥10個々のスイープにソフトウェアを使用し、数値のための代表的な平均応答を準備する（CF 図3B-D、FH、J右パネル）。 注：いくつかの代替のソフトウェアパッケージは、データ分析のために使用することができます。 </li></ol> 4.注射部位の事後分析<ol><li> （再イメージングは​​、ステップ3.7から、所望される場合）PBS中で3回の部位を記録する（ステップ2.12から）注射部位のスライスを洗ってください。これは、繰り返し10分間回転シェーカー上に新鮮なPBSで3回溶液を交換することによって行われます。 </li><li> PBS中の2％寒天溶液を調製し、そしてそれは〜65℃に冷却しましょう​​。小さな直径30mmのペトリ皿の底に平らな場所スライスは、寒天内のスライスを埋め込み、それが固体になるまで冷却しましょう​​。 </li><li>ビブラトームのステージに埋め込まれたスライスまたはスライスと寒天ブロックを接着し、PBSでチャンバーを切断内のステージを配置します。 </li><li>切除70μmの厚さにスライスを埋め込まれました。オプション：切除した後、切片を細胞構築（ 図3A、C）、および/ ​​またはBを明らかにするNeurotraceと、 すなわち 、染色することができますYFPまたはmCherryをするためのyの免疫蛍光染色は、CHR融合タンパク質からの信号をブーストします。 </li><li>取り付けメディアとスライドとカバースリップ上のマウントスライス。画像注射部位と、所望であれば、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡（ 図2A-C）を用いて、投影領域内の繊維を含む、画像スライス。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、すべてではない簡単に、最も上に実装することができ、神経回路やローカル接続のex vivo光遺伝学調査のための方法を説明し、落射蛍光光ポートのLED〜470 nmのとそれらを装備することにより、直立スライスパッチクランプ記録のセットアップ。スライスにおける軸索突起の光遺伝学刺激の主な利点は、対応する線維路が明確に定義されていない、またはに保存されない、知られていなかったので、それは、特定の活性化と、従来の電気刺激とアクセスできませんでした接続の特性の調査を可能にすることです単一の脳切片。恐怖回路に関連する重要な一例として、扁桃体へのmPFC入力の特性を分析するために適用することができる方法を例示します。 電気的な線維トラクト刺激が広く、過去の研究に使用されている場合であっても、これらの管は、多くの場合、起源の異なる領域からの繊維を運びます。例えば、学習を恐れるように関連する回路には、視床核や皮質領域の異なる感覚からの突起がそれぞれ、内部および外部のカプセルを通じて混在して実行します。光遺伝学刺激の利点は、それが定義された領域からの繊維のサブセットの...

可視化および脳領域および神経細胞の特定のタイプとの間の特定の接続の同時活性化のための正確なツールは、健康な脳機能及び疾患状態の根底にある機能的接続性を理解する上でより重要になってきています。理想的には、これは、ニューロンが通信識別される正確なシナプス特性の生理学的な調査を必要とします。これは、単一の急性脳スライスに保存することができない脳の領域間の接続に特に当てはまります。過去において、これは、主に別の実験で達成されました。一方、 生体内で注入された神経トレーサーは、後続の光や前およびシナプス後パートナーの電子顕微鏡分析と組み合わせて使用されてきました。原点の領域からの線維トラクトがスライス標本に保存し、アクセスされたとき一方、電気刺激は、標的領域内の細胞とシナプス通信メカニズムを評価するために使用されています。 彼らの可視化を可能にし、事後解剖学的分析の1-ながら、光遺伝学の出現により、蛍光タンパク質に融合したようなChannelrhodopsins（CHRS）などの光依存性陽イオンチャネルの標的発現は、今ニューロンとその軸索軌道の活性化を可能にします4。線維路が分離または特定の軌道ではないので、1）従来の電気刺激によるアクセスできませんでした脳領域からの入力を評価：親細胞体5から切断場合でもCHRを発現する軸索は刺激することができるので、それはに脳スライスで可能です不明です。 2）明確に想定するが完全には理解された特定の入力の出身地域を特定します。そして、3）の両方のローカルおよび長距離の突起で、定義された細胞型の間の機能の接続性を調べます。そのため、多くの利点を、脳スライス内の回路のこの光遺伝学マッピングは、ワイドになっていますlyが最後の年で使用され、蛍光タグ付きCHRSの発現のための種々のウイルスベクターは、商業的な供給業者から容易に入手可能です。電気刺激はまた、通路または他の近くの細胞、および均等に迅速かつ時間的に正確な刺激の繊維を募集する可能性があるため、従来の電気刺激を超える光遺伝学活性化のいくつかの重要な利点は、刺激電極の配置、繊維の刺激の特異性に起因する組織への損傷はありません。さらに、ウイルスベクターの定位注射を容易Cre依存の発現および/ ​​または特異的プロモーター7を用いて達成することができる特定の脳領域6及び条件または細胞型特異的発現を標的とすることができます。ここでは、この技術は、恐怖システムにおける長距離のマッピングとローカル回路に印加されます。 扁桃体は恐怖と感情的な思い出8,9の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。別にあちこち扁桃体、内側前頭前皮質（のmPFC）および海馬（HC）のmは、相互に扁桃体に接続されている構造は、恐怖や絶滅思い出10,11の買収、統合と検索の側面に関与しています。 mPFCの細分化における活性は12,13を述べてハイとローの両方の恐怖を制御する際に二重の役割を果たしていると思われます。これは、一部には扁桃体の活動と出力を制御することになる扁桃体へのmPFCからの直接接続によって媒介される可能性があります。そのため、最後の年に、いくつかの研究では、扁桃体14-17でのmPFCの求心性および特定の標的細胞間のシナプスの相互作用を調査するためにex vivoでスライス実験で始まりました。 恐怖学習中は、エアコンと無条件刺激についての感覚情報は、特定の視床と皮質領域からの突起を介して、扁桃体に到達します。 basolの側部（LA）内のニューロンへのこれらの入力の可塑性ateral扁桃体（BLA）が恐怖条件9,18の基礎となる重要なメカニズムです。増加する証拠は、扁桃体における並列プラスチックプロセスが恐怖記憶19を制御するための阻害要素を伴うことを示唆しています。クラスタ化された抑制性ニューロンのグループは、GABA作動性内側paracapsularインターカレーション細胞（mpITCs）であるが、その正確な接続性と機能が不完全20-22を理解されています。ここでは、光遺伝学の回路マッピングはmpITCsは視床と皮質中継局23からの直接の感覚入力を受け取ることを実証し、求心性および遠心性これらの細胞の接続と扁桃体における標的ニューロンへの影響を評価するために使用されます。 mpITCsまたはBLAニューロンにおけるCHRの特異的な発現を効果的BLAの活性を制御新規フィードフォワードとフィードバック抑制回路に置く、mpITCsを阻害することを明らかにし、局所的相互作用のマッピングを可能にするだけでなく、相互にBLA校長ニューロン、によって活性化されます23。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr>定<tr><td>位フレーム</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>は他のマウス用定位フレームと交換可能</td></tr><tr><td>Steretoxic フレーム マウスアダプター</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>他のマウス用定位フレームと交換可能</td></tr><tr><td>マウス用ガス麻酔マスク</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>はもう利用できず、アイテム番号に置き換えられています。51609M</td></tr><tr><td>圧力注入装置、Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company、米国</td><td>T25-2-900</td><td>その他の圧力注入装置(ピコスプリッツァーなど)は、</td></tr><tr><td>Kwik Fillガラスキャピラリー</td>を使用することができます <td>World Precision Instruments、ドイツ</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器、IsoFlo</td><td>Eickemeyer、ドイツ</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC温度調節器および加熱パッド</td><td>FHC、米国</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>横型マイクロピペットプーラー モデル P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&nbsp;</td><td>ペンベクターコア、米国</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP(血清型2/1)&nbsp;</td><td>ペンベクトルコア、米国</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン</td><td>ロス、ドイツ</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔薬、イソフランCP(1ml / ml)</td><td>CP製薬、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防腐剤、ベタジン(プロビドンヨード)</td><td>パーデュア製品、米国</td><td>BSOL32</td><td>は、他の消毒剤</td></tr><tr><td>鎮痛剤、メタカム溶液(5mg / mlメロキシカム)</td><td>ベーリンガーインゲルハイムに置き換えることができます、ドイツ</td><td></td><td>は他の鎮痛剤で置き換えることができます</td></tr><tr><td>Bepanthen目の軟膏</td><td>バイエル、ドイツ</td><td>0191</td><td>は他の目の軟膏で置き換えることができます</td></tr><tr><td>ドリルNM3000(SNKG1341およびSNIH1681)</td><td>Nouvag、スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox縫合針</td><td>ファインサイエンスツール、ドイツ</td><td>12050-01</td><td></td></tr>編<tr><td>組シルク縫合ファイン</td><td>サイエンスツール、ドイツ</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">録音、光刺激、分析</td></tr><tr><td>人工脳脊髄液(ACSF)</td><td>組成については参考文献#16および#23</td><td></td><td></td>を参照してください</tr><tr><td>組成物の内部パッチ溶液</td><td>参考文献#16および#23</td><td></td><td></td>を参照してください</tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>ロス、ドイツ</td><td>P027.1</td>精製<td>された2Mストック溶液を調製します水</td></tr><tr><td>スライサー、Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific、ドイツ</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュスライサー用冷却ユニット、CU65</td><td>Fisher Scientific、ドイツ</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>サファイアブレード</td><td>デラウェア ダイヤモンド ナイフ</td><td></td><td>カスタムオーダー、会社</td></tr><tr><td>にお問い合わせください Stereoscope、SZX2-RFA16</td><td>オリンパス、日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite 蛍光灯 (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>パッチ顕微鏡, BX51WI</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B パッチアンプ&nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp software, Version 10</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>used to control data acquisition and stimulation</td></tr><tr><td>Bath temperature controler, TC05</td><td>Luigs &ノイマン、ドイツ</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>3軸マイクロマニピュレーターミニ25</td><td>ルイグス&ノイマン、ドイツ</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター コントローラー SM7</td><td>Luigs &ノイマン、ドイツ</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>パッチピペット用ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器、ドイツ</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>界面チャンバー用硝酸セルロース濾紙&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech、ドイツ</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LEDユニット、CoolLED pE</td><td>CoolLED、UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLEDまたはUSL 70/470および適切なアダプターは、LED刺激のための2つの代替選択肢</td></tr>です <tr><td>CoolLED 100デュアル適応</td><td>CoolLED、英国</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLEDまたはUSL 70/470および適切なアダプターは、LED刺激</td></tr><tr><td>LEDユニット、USL 70/470</td><td>Rappの2つの代替選択肢です光電子</td><td>L70-000</td><td>CoolLEDまたはUSL 70/470および適切なアダプターは、LED刺激のための2つの代替選択肢です</td></tr><tr><td>デュアルポート</td><td>アダプターRapp Optoelectronic</td>は<td>、会社</td><td>CoolLEDまたはUSL 70/470と適切なアダプターは、LED刺激フィルター</td></tr><tr><td>セット赤(励起)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F49-560</td>フィルターのための2つの代替選択肢です <td>F46-008</td></tr><tr><td>として購入することができます&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(ビームスプリッター)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F48-585</td><td>フィルターはセットF46-008</td></tr><tr><td>&nbspとして購入できます。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(エミッション)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F47-630</td><td>フィルターはセットF46-008として購入できます</td></tr>フィルター<tr><td>セット緑(励起)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F39-472</td><td>代替品:フィルターセットF36-149またはF46-002(バンドパスエミッション付き)</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(ビームスプリッター)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F43-495W</td><td>代替品:フィルターセットF36-149またはF46-002(バンドパスエミッション付き)</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(エミッション)</td><td>AHF、ドイツ</td><td>F76-490</td>代替<td>:フィルターセットF36-149またはF46-002(バンドパスエミッション付き)</td></tr><tr><td>LaserCheck、ハンドヘルドパワー</td><td>メーターCoherent、米国</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorProソフトウェア、バージョン6</td><td>Wavemetrics、電気</td><td>生理学データ分析用の米国、その他の代替ソフトウェアパッケージも使用できます&nbsp;</td><td></td></tr><tr>IgorPro <td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td> 電気生理学データ分析用の<td>ニューロマティックマクロスイート</td><td>、その他の代替ソフトウェアパッケージも使用できます&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">注射と投影の事後分析</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末 (PFA)</td><td>Roth, Germany</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar for embedding and resectioning</td><td>Roth, Germany</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>30 x 10 mm petri dish for embedding</td><td>SPL Life科学</td><td></td><td>の代替物が使用可能</td></tr><tr><td>スライド、スーパーフロスト</td><td>R.ランゲンブリンク、ドイツ</td><td>61303802</td><td>代替物は</td></tr><tr><td>カバースリップ</td>を使用可能 <td>R.ランゲンブリンク、ドイツ</td><td>3000302</td><td>代替品は</td></tr><tr><td>Vecta Shield封入剤</td>を使用可能 <td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td>代替封入剤は</td></tr>、<tr><td>平坦化のための硝酸セルロースフィルターを使用することができます固定用スライス</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

光遺伝学のアプローチは、現在広く光によって光活性化タンパク質と神経活動のその後の操作の標的発現を組み合わせることにより、神経集団や回路の機能を研究するために使用されています。 Channelrhodopsins（CHRS）は、光依存性カチオンチャネルであり、蛍光タンパク質に融合させたときに、それらの発現は、視覚化し、特定の細胞型の同時活性化と脳の定義された領域での軸索投射を可能にします。ウイルスベクターの定位注射によって、CHR融合タンパク質は、構成的にまたは条件規定された脳領域の特定の細胞で発現することができ、それらの軸索突起は、その後、脳切片におけるエクスビボ光遺伝学の活性化を介して、解剖学的及び機能的に研究することができます。従来の電気刺激の方法で対処することができなかった接続のシナプスの性質を理解することを目的とする場合に、または新規affeを識別する際に特に重要です以前に十分に理解された家賃と遠心性接続。ここでは、いくつかの例は、この技術が扁桃体に恐怖関連の回路の解明にこれらの質問を調査するために適用することができる方法を示しています。扁桃体は恐怖と感情的な思い出の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。証拠の多くの行は、内側前頭前皮質（のmPFC）は恐怖の取得と絶滅のさまざまな側面に関与するが、扁桃体との正確な接続がちょうど理解され始めていることを示唆しています。まず、光遺伝学活性化は基底扁桃体（BLA）中のmPFCの求心性と標的細胞との間のシナプス伝達の側面を研究するために使用することができる方法をex vivoで示されています。また、このエクスビボ光遺伝学アプローチは、扁桃体においてGABA作動性ニューロンのグループを使用して新規の接続パターンを評価するために適用することができる方法を説明するが、一例としてparacapsularインターカレー細胞塊（mpITC）。

このセクションでは、ex vivo光遺伝学アプローチと感覚と調節長距離BLAとmpITCニューロンへの突出部だけでなく、mpITCとBLA間のローカル接続のプロパティの生理学的特性を調査するために、異なる実験戦略の代表的な結果のワークフローを示しています。 マウス脳への所望の座標に選択されるウイルスベクターの定位注射した後（ 図1A-C、ウイルス発現時間は2から6週間は、実験に応じて）、扁桃体における注射部位と投影領域の急性脳スライスが用意されていますパッチクランプ実験のために適切な角度で、注入部位（ 図1D）の事後分析のために注入された脳領域から。録音や光遺伝学の刺激を開始する前に、蛍光標識された細胞または軸索のプロターゲット領域（扁桃体）でjectionsが結合した蛍光ランプ（ 図1E）を使用して、パッチクランプ記録のための正立顕...

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

この実験の全体的な目的は、ex-vivoオプトジェネティクスを用いて、神経投射およびマイクロ回路の機能的およびシナプス的特性を調査することである。これには、チャネルロドプシンの発現と、パッチクランプ記録を組み合わせた特定の投射における活性化が含まれる。この手法は、脳領域内および領域間における局所的および長距離のコネクティビティのシナプス特性に関する重要な疑問を解決するのに役立つ。ここでは、恐怖行動を支える神経回路の調査を用いて説明します。この手法の主な利点は、従来の電気刺激法ではアプローチできない回路やシナプスを研究できることです。一般的に、この方法に慣れていない方は、必要なすべての工程を最適な方法で遂行するという課題を克服する必要があります。これには、ウイルス注入の定位標的設定、チャネルロドプシンの最適な発現時間の特定、高品質な脳切片の調製、および安定した光活性化と記録が含まれます。本手順のこのステップを開始する前に、蛍光タンパク質と融合したチャネルロドプシンを発現するように設計された組換えアデノ随伴ウイルスベクターを、定位手術によって内側前頭前皮質に導入しておきます。サファイアブレードを装着し、切片厚を 320 micron に設定してビブラトームを準備します。承認された方法に従って安楽死させ、脳を取り出した後、メスを用いて小脳を切り離し、次に内側前頭前皮質を含む脳の前部を分離します。スライスを行うまで、脳の前部を氷冷した切片作成用溶液に浸しておきます。冷却装置を用いて、4 °Cに維持された氷冷切片作成用溶液をカッティングチャンバーに満たします。溶液に酸素を供給します。フィルターペーパーで脳を拭いて乾燥させます。35度の角度にカットした4%アガロースブロックをビブラトームのステージに接着し、脳組織の後端をこのブロック上に接着します。切片作成時の安定性を高めるため、脳ブロックの前後にさらに2つのアガロースブロックを接着します。組織を装着したステージを切断チャンバーに入れ、完全に浸漬していることを確認します。急性切片の切断を開始します。各切片を半分に切り、室温で酸素化したACSFを満たしたインターフェースチャンバーに移します。急性扁桃体切片の作成後、インターフェースチャンバーを36°Cの水槽に入れ、切片を35～45分間回復させます。事後解析用に、注入部位を含む一部の切片を2枚のフィルターペーパーで挟み、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドに一晩浸漬して固定します。ここでは、蛍光タンパク質と融合させたチャネルロドプシンを発現するように設計された組換えアデノ随伴ウイルスベクターを、立体定位手術により内側膝状体の中核および隣接する後内板核に導入しました。脳を取り出した後、メスを用いて小脳と脳の前部を除去し、前述と同様に脳の中央部分を氷冷した切断溶液で冷却します

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウスの脳から傾いた扁桃体スライスの生成を示しています。脳はビブラトーム標本ステージ上で斜めに配置され、扁桃体とシナプス接続を形成する内側前頭前野からの扁桃体と軸索を含むスライスを取得します。脳切片は生理学的温度に維持され、さらなる実験のために組織を保存します。...

マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成

このビデオは、マウスの脳から薄い冠状脳スライスを調製し、内側前頭前皮質からのシナプス接続が豊富な扁桃体領域を露出させる方法を示しています。その後、スライスは酸素化された人工脳脊髄液に回収され、ニューロンの生存能力が維持されます。...

マウス脳から扁桃体領域を露出させる冠状脳スライスの生成

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。...

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

このビデオは、マウスの急性扁桃体脳スライスを使用して、内側前頭前皮質(mPFC)と扁桃体ニューロンとの間のシナプス接続を解析する手順を示しています。これらのマウスのmPFCニューロンは、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現します。チャネルロドプシンは、光の活性化により、mPFCニューロンにおけるイオン流入と活動電位の生成を促進します。その結果、mPFCニューロンは、シナプス後扁桃体ニューロンに結合する神経伝達物質を放出し、シナプス後電流をトリガーして、mPFCと扁桃体の接続性を視覚化するために記録されます。...

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in...

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

観察的恐怖パラダイムは、げっ歯類の代理凍結を感情的共感のモデルとして評価します。この手順では、観察者のげっ歯類を同種のデモンストレーターにさらし、嫌悪感のある足のショックを受けて、共感的な凍結反応を引き出す必要があります。観察的恐怖アッセイを採用することにより、研究者は感情的共感の根底にある神経メカニズムを調査できます。...

マウスにおける感情的共感のモデルとしての観察的恐怖

学ぶ脳スライスにおけるex vivo光遺伝学を用いた恐怖回路の機能・シナプス特性の解析法。channelrhodopsin発現とパッチクランプ記録により、局所および長距離神経投射のシナプス動態を詳細に解明できます。

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

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