Name: ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶ ウイルスミミックポリ（I：C）を用いたマウス母性免疫活性化誘導法。妊娠中期の腹腔内投与により、自閉症や統合失調症の神経発達障害モデルを再現性高く構築し、免疫機能と脳発達の関連を解明する。

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私たちは、MIAモデル、自閉症、統合失調症研究の進歩への貢献のために後半博士ポール・H・パターソンを尊重したいと思います。我々は、このプロトコル上の彼の偉大なサポートのためにサルキスK. Mazmanianを認めます。ルーベンM.バイヨン、イヴェット・ガルシア・フローレス、カレンC. Lencioni、および行政支援のためのレスリーA.ノイマン。撮影上の支援のためのアリKhoshnanとヤンC.コ。 MIA誘導に対する助言のためのエレインY.シャオとナタリアMalkova。彼らの専門家畜産用のジェフリー・S・コクラン、ホアキン・グティエレス、クワンF.リー、ハイメ・ロドリゲス、ロレーナC.サンドバル、とナタリーA. Verduzco。この作品は、（ポール・H・パターソンにNIH 5P50MH086383-04、）NIHコンテセンター賞によってサポートされていました。自閉症は（ポール・H・パターソンに、＃7670）を語ります。 （サルキスK. Mazmanianへ＃322839）シモンズ財団。 NIHトレーニンググラント（K.-HCにNIH / NRSA T32GM07616）。 （ZY）は、カリフォルニア工科大学の夏学部研究フェローシップ（SURF）。アムジェン学者カリフォルニア工科大学（ZYへの）プログラム。そしてポストドクトラルフェローシップFRオム国家科学委員会、台湾（NSC 101から2917-I-564から039、W.-LWへ）。

すべてのプロトコルは、カリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認の下で実施しました。 時限交配ペアの1.準備<ol><li>遺伝子発現解析のために、少なくとも6行動実験のためのダムと3を使用してください。 注：マウスの​​約50％は時限交配から差し込まれるように、推定された雌マウスの二重番号を使用します。 </li><li>なし妊娠前に、年齢の8-16週でメスのマウスを使用してください。 注：女性のマウス雄マウスの前に性的な露出を持っていますが、妊娠していない許容可能です。 </li><li>ハウスは、雌マウスは、一緒に、お互いの隣に自分の発情周期を同期させるためにケージを置きます。 5成体マウスの筐体を可能にするために、5.5インチ以上の高さと75平方インチインテリアフロアで、標準的なマウスケージを使用してください。耳パンチを用いて、各メスのマウスにラベルを付けます。 </li></ol> 2.時限マットを設定しますINGペア<ol><li>暗サイクルが始まる前に、時限交配0-2時間を設定します。各ケージに2匹の雌マウスを置きます。マウスを取り出し、それらを個別に量ります。各雌のマウスの体重を記録します。 </li><li> 2雌マウスと各ケージに1人の男性にマウスを置きます。父方の交絡影響を最小限にするためにトリオの交配を使用してください。 </li></ol> 3.プッシープラグチェック（E0.5） <ol><li>暗サイクル終了後に雌マウス0-4時間を確認してください。ゆっくり尾の付け根からメスのマウスを持ち上げて、マウスがワイヤグリッド、ケージ上部、またはケージの縁をつかむことができます。 </li><li>膣栓の兆候を検索：膣のプラグインは膣口に見える白っぽい塊です。プラグがはっきりしない場合は、そっと膣口に200μlのピペットチップを挿入します。凝固からの抵抗は、膣プラグ形成を確認します。 1日に1回、膣プラグを確認してください。 注：ワギナプラグは交尾が発生したことを示すだけであり、したがってグラムありませんuarantee妊娠。膣栓マウスの特定の系統において同定することが困難であり得ます。プラグ識別の精度を高めるために、経験豊富なマウスの介護者から助けを求めます。 </li><li>新しいケージに差し込まマウスを移動して、グループがそれらを収容します。胚0.5日（E0.5）などの膣プラグ外観の日を定義します。 </li></ol> E10.5-11.5 4.、妊娠をチェックします<ol><li>ゆっくり尾の付け根を持ち上げて、マウスがワイヤグリッド、ケージ上部、またはケージの縁をつかむことができます。 例えば 、妊娠の兆候をチェックするために腹部領域を観察し、腹部の膨らみ（ 図1）。 注：妊娠の兆候が常にE10.5よりもE11.5でより明白です。 </li><li>妊娠を確認するために、マウスを計量。妊娠中のマウスは、一般的に非妊娠マウス（ 図2）と比較して、E12.5でE10.5で約20％重く、30％より重い重量を量ります。シングル家のきれいなケージで妊娠マウス。 </li></ol> 5. 20ミリグラム/キロポリ（I：C）の準備<ol><li>遺伝子発現解析のためにグループごとの行動実験のために、グループごとに少なくとも6ダムを使用し、3。解決策：ポリ（C I）の対応する量を準備します。 </li><li> 40ミリグラム/ mlの最終濃度を作るために50mlコニカルチューブ中のパウダー：ポリ（C I）を量ります。最小化し、注入量による応力を標準化、ポリ5μlのを注入するために、（I：C）マウスの体重（5μL/ gの、または5ミリリットル/キログラム）の各グラムのための溶液。 1kg当たり：MIAを誘導するために、我々は、ポリ20mgの（C I）を注入します。 注：ポリ濃度（I：C）必要に応じて溶液（20ミリグラム/キログラム）/（5ミリリットル/キログラム）= 4 mg / mlです。ポリので（私は：C）粉末を10％ポリ含む溶液（I：C）を、我々は（4 mg / mlで）/0.1=に40mg /ポリミリリットル（C I）の最終濃度を確認する必要があります。 注意：ポリ（I：C）粉末は、非常に軽いです。コニカルチューブにへらから転送中の任意の粉末を失わないように注意してください。 </li><li>円錐形の槽に0.9％塩化ナトリウム（生理食塩水）の対応するボリュームを追加eとキャップを閉じます。溶液が透明になるまで粉末：そっとポリ（C I）を介して生理食塩水の液滴を圧延することによって粉末を溶かします。 1分（ 図3C）、800×gでコニカルチューブを遠心。 0.22μmのフィルターにより溶液：ポリ（C I）をフィルタリングします。 1.5または2ミリリットルのマイクロチューブに：（C I）溶液にポリを転送します。オプション：ソリューション：ポリ（C I）の260/280比を測定するために、分光光度計を使用してください。製造業者によって記載されるように比率が1.54から1.82（ 図3）との間にあることを確認します。注：ポリ（I：C）を溶解するために使用される生理食塩水粉末をし、制御インジェクションとして働くには、滅菌し、医薬品グレードであるべきです。 </li></ol> 6.生理食塩水またはポリ（I：C）E12.5での注射<ol><li>スケール上でマウスを計量し、ケージに戻します。 （I：C）マウス：体重（グラム）5を乗じ=目標噴射量（μl）を生理食塩水とポリ両方のための注射の量を計算するには、次の式を使用します。 INSUL 0.3ミリリットルを使用します30グラムのマウス用の溶液、 例えば、150μlの：注射器で計算された生理食塩水の体積または20 mgの/ kgのポリ（C I）を策定します。 </li><li>ゆっくり尾の付け根によってマウスをピックアップし、ケージの上に置きます。ストレスによる交絡の影響を避けるために、穏やかに、マウスを扱います。その2つの上部のニップル（ 図4）の中心にマウスに対して約20°の角度、アップベベル、針を挿入し、生理食塩水またはポリ（I：C）を注入ソリューションを。注：針を注射した後、各マウスのために交換する必要があります。 </li><li>バックそのホームケージにマウスを置きます。他の交絡の影響を回避するために、静かな、交通量の少ない部屋にケージを置きます。 </li></ol> 7.ポリデイ・アフター（I：C）注射（E13.5） <ol><li>次の朝に注射したマウスを確認してください。体重を測定するためのスケールを使用してください。 注：ポリ（I：C）は、通常INJ日後に生理食塩水を注射したマウスよりも少ない重量を得る妊娠マウスに注射しection。 </li><li>子孫が生まれされるまでマウスを邪魔しないでください。 </li></ol> MIAの子孫の8ゲージ<ol><li> MIA誘導の交絡の影響を最小限にするために、MIAの子孫の使用状況を把握するために以下に示すガイドラインに従ってください。 <ol><li>産子数が5未満である早産または遅延誕生から、または場合リットルを除外します。 </li><li>産子数が10よりも大きい場合、CO 2による過剰な子犬を安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 9.オプション：MIA後急性炎症反応を調べ<ol><li>金融機関の動物管理委員会が承認したプロトコルに記載された方法を用いて射出：生理食塩水またはポリ（C I）の後に妊娠マウス3時間を生け贄に捧げます。 注：頸椎脱臼は、しばしば、それがダムと胚のCO 2 /安楽死薬の効果を最小化するように好ましいです。 </li><li>大人の妊娠マウスから脾臓を収集し、胎盤と胎児のブラジャーを隔離実体顕微鏡下インチ<ol><li>脾臓収集のため、解剖のプレート上にマウスを置くと妊娠マウスの腹部に70％エタノールを噴霧します。皮膚を通して胸郭下の腹部領域の中央に縦のカットを作るために滅菌ハサミを使用してください。 </li><li>脾臓は、左上腹部の象限に位置しています。脾臓を分離するために鉗子を使用してください。臓器の周りの脂肪組織を除去するために、繊細なタスクワイパーに脾臓をロールバックします。脾臓組織の約50ミリグラムを収集し、500μlのRNAとエッペンドルフチュー​​ブに個別にそれらを配置する核酸の分解を防ぐためにバッファまたはのTRIzolを安定させます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li><li>胎盤の収集のために、優しく身体から子宮角を引き出します。オートクレーブ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされたペトリ皿に子宮角を置き、氷上で料理を残します。子宮壁を開き、羊膜を露出させる引き裂くために、2つの鉗子を使用してください。 <ol><li>慎重に胎盤と胎児を損傷することなく、羊膜嚢を開くために鉗子を使用しています。胎児から胎盤を分離し、可能な限り胎盤に近いへその緒を切りました。胎盤から羊膜片を除去。個別バッファまたはのTRIzolを安定さ500μlのRNAを用いてエッペンドルフチュー​​ブに胎盤を置きます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>胎児の脳の収集のために、解剖まで、ステップ9.2.2からバッファを安定化RNAで胎児を格納します。実体顕微鏡下で繊細な＃5ピンセットを用いて脳の心室から軟膜オフ膜をいじめます。慎重に胎児の脳からすべての膜を除去します。バッファまたはのTRIzolを安定さ500μlのRNAを用いてエッペンドルフチュー​​ブに個別に胎児の脳を置きます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>組織からRNAを抽出し、RNAをcDNAに変換します。実TによりcDNAにおけるIL6遺伝子発現を分析しますIME PCR。 </li><li> TRIzolの製造プロトコルに従うことによって、組織からRNAを抽出します。組織は、RNA安定化緩衝液中に保存されている場合。サンプルを解凍し、バッファをスピンダウン。 500μlのトリゾールで別のエッペンドルフに先端によって組織を転送し、RNA抽出を続けます。 </li><li>濃度、260/280およびRNAの260/230比を測定するために、分光光度計を使用してください。比が2.0以上であることを確認します。 </li><li> 10μlの最終体積にDNアーゼIをミックス1μgのRNAを、1μlの10×反応緩衝液、1μlのRNaseフリーのDNase、およびヌクレアーゼフリー水でRNAを処理したことにより、DNAの混入を排除。 30分間37℃でマスターミックスをインキュベートします。反応を終了させるために1μlのDNaseを停止液を追加します。 65℃で10分間混合物をインキュベートします。 </li><li> cDNAとRNAを逆転写。 20μlの反応を使用し、反応あたりの全RNAのμgの1まで。転写（RT）反応ミックスバッファーを逆5X 4μLを混ぜ、1μlの回転ERSE転写酵素は、DNアーゼIおよび4μlのヌクレアーゼフリーH 2 Oで処理した後の11μlのRNA鋳型は、最終的な20μlの溶液を作製します。 RT用サーマルサイクラー条件をプログラムします。一般的な条件は次のとおりです。ステップ1：5分間25℃。ステップ2：30分42℃。ステップ3：5分間85℃。ステップ4：4℃で保持します。 cDNAの5倍に希釈します。短期保存の場合、4℃でのcDNAを保存します。長期保存の場合、-20℃でのcDNAを凍結します。 </li><li>リアルタイムPCRによりcDNAにおけるIL6遺伝子の発現を分析し、βアクチン遺伝子発現に対してIL6遺伝子発現を正規化します。 <ol><li> IL6およびβアクチンを検出するためのマスターミックスを行います。 25μlの反応を使用し、各遺伝子のマスターミックスを12.5μlのSYBRグリーンミックス、10μMのフォワードプライマー0.5μlの、10μMのリバースプライマーと6.5μlのヌクレアーゼフリーH 2 O0.5μlのは、 </li><li> 5μlの5倍に希釈したcDNA aを置きます光学96ウェル反応プレートのウェルの底部T。最終的な25μlのPCRミックスを作るために、各ウェルにマスターミックスのピペットを20μl。各サンプルの各遺伝子を三連。光学接着フィルムを用いてプレートをシール。 4°Cを使用したリアルタイムPCRの標準プログラムで3分間800×gでプレートをスピンダウン：ステップ1：50℃で2分間;ステップ2：10分95°C;ステップ3：1分15秒、温度60℃、95℃の40サイクル。解離曲線のための追加のステップを追加します。 </li></ol></li></ol> 10. MIAアダルト子孫（オプション）で行動異常を調べます。 <ol><li> 8-12週間の年齢で動作テストを実行します。少なくとも3日間のテストの前にケージの寝具を変更します。少なくとも30分の試験前の行動試験室にマウスを順応させます。 </li><li>プレパルス抑制（PPI）については、その下に圧電センサーとプレキシガラス筒内でマウスを抑えます。 PPIにマウスを順応させます5分間のチャンバ。 120デシベルホワイトノイズ（驚愕）の6試験でマウスを公開します。 </li><li>次に無作為バックグラウンドノイズの14試行の混合物、驚愕の14試行、プレパルス5 DB（背景雑音が5 dBの高い）+驚愕（PPI5）の14の試験、及びプレパルス15 DB（15 dBの以上の14の試験をマウスにさらしますバックグラウンドノイズ+驚愕（PPI15）より。 </li><li> 120デシベルの試験の最初の6試験のための驚愕反応を平均します。他の個々の刺激のための驚愕反応を平均します。 /驚愕 - （PPI5またはPPI15驚愕）によりプレパルス抑制に値をひそか。 </li><li>オープンフィールドテストでは、オープン平方 ​​アリーナ（50×50×50 cm 3）での隅にマウスを置きます。天井取り付けられたカメラを通して10分間マウスの軌跡を記録します。中央ゾーン（17×17 cm 2）でのように舞台の中心を定義します。手動または画像ベースの自動解析ソフトによって中心ゾーンで過ごした走行距離、中心ゾーンエントリ、及び時間を定量化します。 </李&gt; <li>大理石の埋設試験では、10分間圧縮5センチメートル深い、きれいな、アスペン松寝具テストケージにマウスを順応させます。そのホームケージにマウスを返します。静かに4×5の配置の仕方で20紺1.5センチメートル直径のガラス玉を配置します。 10分間のビー玉でバックテストケージにマウスを置きます。 10分の試験時間内に埋設されたビー玉をカウントします。 </li></ol> 11. MIAアダルト子孫（オプション）で小脳の神経病理を調べます。 <ol><li>麻酔薬によって生理食塩水とMIAの大人の子孫を安楽死させます。心臓血管系を通って50ミリリットルのPBS、続いて50ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドでマウスを灌流。 </li><li>慎重に脳を取り出して、4で一晩、4％パラホルムアルデヒドで脳を後置 °C。 PBSで3回脳を洗浄し、使用まで4℃の冷蔵庫で0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS中で脳を格納します。 注：後置脳を0.02％SODでPBS中に保存することができ月までのための冷蔵庫の中イウムアジ化。 </li><li>矢状ビブラトームを使用して、50μmの薄いスライスにセクションの脳を。柔らかい筆ペンを使用して、脳切片を収集します。室温で30分間、0.6％過酸化水素でセクションをインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性を終了します。 </li><li>室温で一晩ブロッキングバッファー（PBS中0.1％トリトンX-100及び0.02％アジ化ナトリウムを有する10％のヤギ血清）中に希釈した抗カルビンジン抗体で切片をインキュベートします。次いで、室温で2時間、ブロッキング緩衝液で希釈したビオチン化二次抗体を対応のセクションをインキュベートします。 </li><li>アビジンDHのセクションをインキュベートします - ビオチン化ペルオキシダーゼH複合体のバッファを室温で1時間ビオチンを検出します。抗原を可視化するためにペルオキシダーゼ基質を使用してセクションを開発します。ステップ間にPBSで3回のセクションを洗ってください。顕微鏡スライド上にセクションをマウントします。画像顕微鏡下でのセクション。 </li></オール&gt;

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<li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li>
<li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

異なる時間窓でのMIAの誘導は、げっ歯類の異なる脳の発達のイベントを乱し、その結果、子孫に異なる行動異常と神経病理につながります。 E12.5で射出：ここでは、ポリ（C I）を有するマウスにMIAを誘導するためのプロトコルを説明しました。 MIA誘導のこの方法は、行動、神経学、免疫学、および子孫8,10,11,16に自閉症や統合失調症に関連した胃腸の異常をもたらします。 MIAは、環境リスク因子であるので、それは、それに注意することが重要であり、子孫の表現型は、神経発達障害の遺伝的モデルのマウスのそれよりも高い変動を有することが期待されます。したがって、正確にかつ一貫してMIAを通して自閉症および統合失調症に関連する表現型を生成するために、その結​​果を混乱させる可能性のある追加の変数を最小化するために特に重要です。 プロトコルに記載タイムラインは近くに従わなければなりませんLY。正しい噴射時間ウィンドウはMIAが所望の段階での子孫の脳の発達を乱すことを確実にするでしょう。重要な脳の発達が発生している期間、皮質層におけるプルキンエ細胞と尾状核被殻の開発、および...

母体の免疫活性化（MIA）の概念は、自閉症や統合失調症1と母体感染との関連について疫学研究に由来します。胎盤や母体のウイルス感染2,3-後の胎児の脳で検出可能な複製ウイルス病原体が存在しないために、子孫に感染の影響は、母体の免疫系の活性化ではなく、病原体そのものに起因すると仮定されています。 MIAと精神障害との間の因果関係を解明するために、化学的に合成され、ウイルスを模倣する二本鎖RNAポリイノシンの注入：ポリシチジル酸：妊娠げっ歯類に（ポリ（I C））が広くMIAの動物モデルとして使用されています4,5。ポリ（I：C）は、Toll様受容体3（TLR3）によって認識され、そしてポリ全身投与（I：C）は、ウイルスのような急性炎症反応を誘発します。メカニズムの一つはポリによって（I：C）の広報子孫に行動異常と神経病理をoduces母体の胎盤胎児軸6にプロおよび抗炎症性サイトカインの不均衡を引き起こすことによってです。いくつかのグループは、精神障害7の病因を理解するためにMIAモデルを採用している、と原因の研究グループ間の多様な関心に、免疫活性化の種々の時点では、脳の発達や行動7上の異なる摂動を達成するために使用されてきました。 胚12.5日目に妊娠マウスに正常MIAは、行動、神経学的に誘導することが可能であることを実証した（E12.5）を、（C I）、カリフォルニア工科大学のPaul H.パターソン研究所は、ポリ注入の戦​​略を採用しています自閉症や統合失調症8-11に関連付けられている子孫および免疫学的変化。私たちの前の作品はMIAの子孫が行動異常（ 例えば、社会impairmenを表示することを示していますトン、通信赤字、反復的な行動、不安様行動、および潜在的阻害赤字8,10,12）、免疫調節不全およびサイトカイン不均衡8,13,14、胎児の脳の遺伝子発現15の変化、小葉VIIにおけるプルキンエ細胞の損失小脳11、海馬9におけるシナプスの性質の変化、遺伝子X環境の相互作用13、腸の透過性の変化、および腸内細菌叢の組成物16の。さらに、治療および予防戦略は、このモデルシステム13,16,17から開発されています。 E12.5でMIAを誘導することにより、他の人がMIAは、脳の脳シナプトソーム超微細構造の異常、脳ミトコンドリア呼吸鎖機能亢進abnormalties、脳シナプトソーム分子のダウンレギュレーション17を胎児ミクログリア活性化および前脳基底部18、株特異的な相互作用19におけるコリン作動性発達変化を生み出すことが示されています、抑うつ様行動、認知および海馬の長期増強（LTP）における障害、および成体の海馬の神経新生20の赤字。 だけでなく、自閉症や統合失調症の病因を研究するためにこのモデルを適用する方法のパラダイム：ここでは、ポリ（C I）によりE12.5でMIAを誘導する方法の詳細な方法を提供します。 MIAが障害4の様々な危険因子であることに注意することが重要であり、その成果は、時間と誘導の方法だけでなく、妊娠中のダムの飼育に非常に敏感です。このように、研究室間の些細な矛盾は、多くの場合、低い再現性および/または子孫で異なる表現型をもたらします。我々の方法は、特に自閉症や統合失調症のための環境リスク因子としてMIAの研究に興味のある人のために設計されており、詳細な説明は、研究者がデータの再現性を向上させるのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>ポリイノシン&ndash;ポリシチジル酸カリウム塩</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 塩化ナトリウム INJ. USP</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2インチ</td> <td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 円錐形スクリューキャップチューブ</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 分光光度計</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>1000</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td>オプション</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子 イノックス 先端サイズ .10 X .06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>オプション</td></tr><tr><td>RNAlater RNA 安定化試薬</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>オプション</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026&nbsp;</td><td>随意</td></tr><tr><td>RQ1 RnaseフリーDNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成キット</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>オプションのFastStartユニバーサルSYBRグリーンマスターミックスとROX&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>4913922001</td><td>オプション</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR</td><td>ABI</td><td>7300</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>プライマー:Il6 フォワード</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>プライマー:Il6 リバース</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ TTGGTCCTCTTAGCCACTCCTTC</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>プライマー:β-actin forward</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>オプション</td></tr><tr><td>プライマー:ベータアクチンリバース</td><td>ライフテクノロジー</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>MicroAmp光学96ウェル反応プレート</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>MicroAmp光学接着フィルム&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>SR-LAB装置 (PPI)</td><td>San Diego Instruments&nbsp;</td><td>SR-LAB</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Marbles</td><td>PENN-PLAX</td><td>ブルージェムストーン ビー玉</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>MACRON</td><td>2621-59</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000 S</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>アジ化</td><td></td>ナトリウム <td>Σ S2002</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>ウサギ抗カルビンジン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11426</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ 抗ウサギ IgG抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABCキット</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>PK-4000</td><td>Optionl</td></tr></tbody></table>

ウイルスミミックポリ（i：c）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

母体免疫活性化(MIA)モデルは、さまざまな精神疾患の環境リスク因子のげっ歯類モデルとしてますます高く評価されています。多くの研究により、MIA モデルが自閉症や統合失調症に関連する顔、構成、および予測妥当性を示すことができることが示されています。MIAをモデル化するために、研究者はしばしばウイルス模倣ポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリ(I:C))を使用して、妊娠中のげっ歯類の免疫系を活性化します。一般に、免疫活性化ダムの子孫は、自閉症や統合失調症に関連する行動異常や生理学的変化を示します。しかし、異なる用量で異なる時点でのポリ(I:C)注射は、異なる段階で脳の発達を混乱させることにより、異なる結果をもたらす可能性があります。ここでは、妊娠半ばの胚 12.5 日 (E12.5) で 20 mg/kg ポリ (I:C) の腹腔内 (i.p.) 注射により MIA を誘導する詳細な方法を提供します。この方法は、母体-胎盤-胎児軸に急性炎症反応を誘発することが示されており、最終的には自閉症や統合失調症に関連する脳の摂動と行動表現型をもたらします。

<html>注射20 mgの/ kgのポリ：E12.5における（I C）は、母体の胎盤胎児軸に急性炎症反応を惹起し、脳の発達や行動の表現型12,13への慢性効果を沈殿させることができます。炎症性サイトカインのレベルの上昇は、インターロイキン（IL）-6は、MIA後の急性炎症反応の信頼できる指標です。注射12,13：IL6遺伝子胎盤における発現および胎児脳のピーク時間は、3時間後のポリ（I：C）です。母性脾臓胎盤胎児脳（ 図5）（。データはWu らから適応、2015）13を横切って高いIL6遺伝子の発現を誘導する（I：C）私たちは、そのポリを示しています。研究者は、MIA、 例えば、母体の食生活、遺伝的変異マウス、抗炎症薬、 などの後に急性炎症反応を変化させる可能性がある要因を研究するために、他の治療と、このパラダイムを組み合わせることができます。 <html>...

母体の免疫活性化（MIA）は、自閉症と統合失調症の環境リスク因子のモデルです。この記事の目的は、このモデルの再現性を高めるために、妊娠中のマウスでMIAを誘導する方法の段階的な手順を提供することです。

ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

この手順の全体的な目的は、胚の妊娠中期にウイルス模倣体であるpolyを腹腔内投与し、マウスに母体免疫活性化（MIA）を誘導することです。この手法は、免疫機能不全が脳の発達や行動の乱れにどのようにつながるかといった、神経免疫学分野における重要な疑問を明らかにすることに役立ちます。本手法の主な利点は、自閉症や統合失調症の環境的リスク因子としてMIAを研究したい研究者向けに特別に設計されている点にあります。一般的に、この方法に慣れていない方は苦労することがあります。なぜなら、MIA誘導法のわずかな違いが、子のダウンストリーム応答に大きな影響を及ぼす可能性があるためです。タイミングを合わせた交配ペアを作成するには、まず、発情周期を同期させるため、標準的なマウスケージにメスマウスを1ケージあたり5匹ずつ隣接して飼育し、イヤーパンチで各個体を識別します。暗期が始まる0〜2時間前に、メスマウスを1ケージあたり2匹ずつに分け、個体ごとに体重を測定して記録した後、メス2匹のケージにオス1匹を加えてください。暗期終了後0～4時間以内に、各雌マウスの尾の付け根をそっと持ち上げ、前肢でケージの格子を掴ませた状態で、膣口に白色の塊があるかを確認します。プラグが確認できない場合は、200 µLのピペットチップを慎重に膣口に挿入してください。凝固による抵抗があれば、プラグが形成されていることが確認されます。腟栓が確認されたマウスを新しいケージにまとめます。腟栓の存在は交尾が行われたことのみを証明するためです。胎生10.5日から11.5日にかけて、腟栓のあった雌マウスをそれぞれ尾の付け根から持ち上げ、腹部の膨らみを確認します。その後、マウスの体重を測定して妊娠を確認し、妊娠個体を個別の清潔なケージで飼育します。poly(I:C)粉末を50 mLのコニカルチューブで計量します。胚齢12.5日に、コニカルチューブに入ったpoly(I:C)の適量に対し、対応する容量の0.9%塩化ナトリウム溶液を加え、蓋を閉じます。溶液が透明になるまで、生理食塩水の液滴を粉末の上で優しく転がします。その後、チューブを遠心分離し、poly(I:C)溶液をマイクロ遠心チューブに移します。分光光度計を用いて、poly(I:C)溶液の260 nmと280 nmの吸光度比を測定します。この比は、製造元の記載通り1.54から1.82の間である必要があります。次に、1匹目のマウスを計量し、計算された量に相当するpoly(I:C)溶液を0.3 mL用インスリン注射器に充填します。次に、マウスを尾を持って持ち上げ、ケージの天板の上に置き、項皮を固定します。ここで、針の針先を上に向け、マウスに対して約20度の角度で、上側の2つの乳頭の中間に刺入し、poly(I:C)溶液を投与します。その後、マウスをケージに戻します。すべてのマウスへの注射が完了した後、他の交絡因子の影響を避けるため、ケージを静かで人通りの少ない部屋に配置し、翌朝にマウスの体重を測定します。行動試験の少なくとも3日前までに、8〜12週齢の成人母体免疫活性化（MIA） offspringのケージ beddingを交換してください。試験の30分前に、マウスを試験室に慣らします。プレパルス抑制試験では、マウスを圧電センサー上のプレキシガラス製シリンダー内に拘束します。120 decibelsのホワイトノイズを6回提示し、5分間プレパルス抑制チャンバーに慣らします。その後、表に記載されているランダムに組み合わせた音を提示し、その結果をベースラインの驚愕反応と比較して、MIA動物のプレパルス抑制を判定します。オープンフィールド試験では、17 cm × 17 cmの中心ゾーンを定義した正方形のオープンアリーナの隅にマウスを配置し、天井設置カメラを用いてマウスの軌跡を10分間記録します。その後、中心ゾーンへの進入回数と中心ゾーンでの滞在時間を定量化します。大理石埋没試験では、深さ5 cmに圧縮された清潔なアスペンチップを敷いた試験ケージにマウスを10分間順化させます。その後、マウスをホームケージに戻し、試験ケージ内に直径1.5 cmの紺色のガラス製大理石20個を4 × 5の格子状に緩やかに配置します。次に、マウスを10分間テストケージに戻し、その後、動物をホームケージに戻して、テスト期間中に埋められたマーブルの数を数えます。胎生12.5日目のPoly(I:C)投与は、母体胎盤胎児軸に急性炎症反応を誘発し、脳の発達および行動表現型に慢性的影響を及ぼす可能性があります。実際に、Poly(I:C)は投与3時間後に、母体脾臓、胎盤、および胎児脳においてより高いIl6遺伝子発現を誘導します。一般的に、生理食塩水投与の成体子孫と比較して、MIA投与の成体子孫はオープンフィールド試験において、センターゾーンへの進入回数が少なく、センターゾーンでの滞在時間が短くなります。また、poly(I:C)を注入した動物は、マーブル埋没試験においてより頻繁な埋没行動を示し、プレパルス抑制が低下します。小脳小葉7におけるプルキンエ細胞の喪失もMIA子孫のもう一つの特徴であり、生理食塩水注入コントロールと比較して、これらの動物の小脳小葉7ではカルビンジン陽性プルキンエ細胞の数が減少しています。この手順を行う際は、MIA誘導後の妊娠マウスを刺激しないようにすることが重要です。その後、さらなる環境相互作用を研究するために、出生後のストレスや感染などの追加因子を導入することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Lutz, D., et al.発育中のマウス脳と脊髄の子宮内形質導入後の超微細構造神経可塑性パラメータの評価。J. Vis.

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ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

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