ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

この手順の全体的な目的は、胚の妊娠中期にウイルス模倣体であるpolyを腹腔内投与し、マウスに母体免疫活性化（MIA）を誘導することです。この手法は、免疫機能不全が脳の発達や行動の乱れにどのようにつながるかといった、神経免疫学分野における重要な疑問を明らかにすることに役立ちます。本手法の主な利点は、自閉症や統合失調症の環境的リスク因子としてMIAを研究したい研究者向けに特別に設計されている点にあります。

一般的に、この方法に慣れていない方は苦労することがあります。なぜなら、MIA誘導法のわずかな違いが、子のダウンストリーム応答に大きな影響を及ぼす可能性があるためです。タイミングを合わせた交配ペアを作成するには、まず、発情周期を同期させるため、標準的なマウスケージにメスマウスを1ケージあたり5匹ずつ隣接して飼育し、イヤーパンチで各個体を識別します。暗期が始まる0〜2時間前に、メスマウスを1ケージあたり2匹ずつに分け、個体ごとに体重を測定して記録した後、メス2匹のケージにオス1匹を加えてください。

暗期終了後0～4時間以内に、各雌マウスの尾の付け根をそっと持ち上げ、前肢でケージの格子を掴ませた状態で、膣口に白色の塊があるかを確認します。プラグが確認できない場合は、200 µLのピペットチップを慎重に膣口に挿入してください。凝固による抵抗があれば、プラグが形成されていることが確認されます。

腟栓が確認されたマウスを新しいケージにまとめます。腟栓の存在は交尾が行われたことのみを証明するためです。胎生10.5日から11.5日にかけて、腟栓のあった雌マウスをそれぞれ尾の付け根から持ち上げ、腹部の膨らみを確認します。その後、マウスの体重を測定して妊娠を確認し、妊娠個体を個別の清潔なケージで飼育します。poly(I:C)粉末を50 mLのコニカルチューブで計量します。

胚齢12.5日に、コニカルチューブに入ったpoly(I:C)の適量に対し、対応する容量の0.9%塩化ナトリウム溶液を加え、蓋を閉じます。溶液が透明になるまで、生理食塩水の液滴を粉末の上で優しく転がします。その後、チューブを遠心分離し、poly(I:C)溶液をマイクロ遠心チューブに移します。

分光光度計を用いて、poly(I:C)溶液の260 nmと280 nmの吸光度比を測定します。この比は、製造元の記載通り1.54から1.82の間である必要があります。次に、1匹目のマウスを計量し、計算された量に相当するpoly(I:C)溶液を0.3 mL用インスリン注射器に充填します。

次に、マウスを尾を持って持ち上げ、ケージの天板の上に置き、項皮を固定します。ここで、針の針先を上に向け、マウスに対して約20度の角度で、上側の2つの乳頭の中間に刺入し、poly(I:C)溶液を投与します。その後、マウスをケージに戻します。

すべてのマウスへの注射が完了した後、他の交絡因子の影響を避けるため、ケージを静かで人通りの少ない部屋に配置し、翌朝にマウスの体重を測定します。行動試験の少なくとも3日前までに、8〜12週齢の成人母体免疫活性化（MIA） offspringのケージ beddingを交換してください。試験の30分前に、マウスを試験室に慣らします。

プレパルス抑制試験では、マウスを圧電センサー上のプレキシガラス製シリンダー内に拘束します。120 decibelsのホワイトノイズを6回提示し、5分間プレパルス抑制チャンバーに慣らします。その後、表に記載されているランダムに組み合わせた音を提示し、その結果をベースラインの驚愕反応と比較して、MIA動物のプレパルス抑制を判定します。

オープンフィールド試験では、17 cm × 17 cmの中心ゾーンを定義した正方形のオープンアリーナの隅にマウスを配置し、天井設置カメラを用いてマウスの軌跡を10分間記録します。その後、中心ゾーンへの進入回数と中心ゾーンでの滞在時間を定量化します。大理石埋没試験では、深さ5 cmに圧縮された清潔なアスペンチップを敷いた試験ケージにマウスを10分間順化させます。その後、マウスをホームケージに戻し、試験ケージ内に直径1.5 cmの紺色のガラス製大理石20個を4 × 5の格子状に緩やかに配置します。

次に、マウスを10分間テストケージに戻し、その後、動物をホームケージに戻して、テスト期間中に埋められたマーブルの数を数えます。胎生12.5日目のPoly(I:C)投与は、母体胎盤胎児軸に急性炎症反応を誘発し、脳の発達および行動表現型に慢性的影響を及ぼす可能性があります。実際に、Poly(I:C)は投与3時間後に、母体脾臓、胎盤、および胎児脳においてより高いIl6遺伝子発現を誘導します。

一般的に、生理食塩水投与の成体子孫と比較して、MIA投与の成体子孫はオープンフィールド試験において、センターゾーンへの進入回数が少なく、センターゾーンでの滞在時間が短くなります。また、poly(I:C)を注入した動物は、マーブル埋没試験においてより頻繁な埋没行動を示し、プレパルス抑制が低下します。小脳小葉7におけるプルキンエ細胞の喪失もMIA子孫のもう一つの特徴であり、生理食塩水注入コントロールと比較して、これらの動物の小脳小葉7ではカルビンジン陽性プルキンエ細胞の数が減少しています。

この手順を行う際は、MIA誘導後の妊娠マウスを刺激しないようにすることが重要です。その後、さらなる環境相互作用を研究するために、出生後のストレスや感染などの追加因子を導入することができます。