Name: 遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶ遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング法。ラベリング不要で単一細胞の胆汁酸輸送を直接観察し、代謝メカニズムの解明に活用できます。

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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、生きた細胞内の胆汁酸輸送の時空間ダイナミクスを監視することができる新規な遺伝的にコードされた胆汁酸センサーを使用するための詳細なプロトコールを提示します。このバイオセンサーは、それによって、FRETベースの胆汁酸センサー（BAS）を形成する、FXR-LBDに融合されセルリアンとシトリン蛍光タンパク質で構成されています。 細胞培養およびFACSまたは（共焦点）顕微鏡の基本的な経験をしたとき胆汁酸センサーは、使用中の比較的簡便です。しかし、いくつかの側面は、いくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります。胆汁酸輸送体と組み合わせた胆汁酸センサーを使用する場合には、木炭濾過血清を含む培地中で細胞を培養することが推奨されます。木炭は、さらに血清からの吸着によって胆汁酸のレベルを低下させます。これは非感受性センサーの最も一般的な原因であるため、特に、NTCPなどの輸入の存在下では、これは、培養中のセンサの飽和を防ぐために重要です実験中。そのため、他のセンサは、より大きなダイナミックレンジ8を作成し 、胆汁酸に対する感度を変更する突然変異を含む（Nucl...

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、高い時間および空間分解能1と生細胞中の細胞機能のより良い理解を得るために使用されます。 FRETは、励起されたドナーフルオロフォアからのエネルギーは、アクセプターフルオロフォアへ転送されます。 FRETの効率は、ドナーとアクセプターフルオロフォアとその方向との間の距離に強く依存するため、2つの蛍光体に影響を与えるコンフォメーション変化の敏感な読み出しです。この現象は、小分子のイメージングのためのFRETベースのバイオセンサーを生成するために利用されます。それらの濃度の変化は、ドナーフルオロフォア2対アクセプターの発光強度の比の増加/減少するように監視することができます。例えば、FRETベースのカルシウムのバイオセンサーは細胞3生き内遊離カルシウム濃度の迅速かつ安定した検出を可能にします。 FRETベースのバイオセンサの他の利点は、単一の生細胞内で撮像され、T相続人の非侵襲性は、それらの能力が異なる細胞型および細胞区画4を標的とします。 細胞内の胆汁酸動態の多くの側面は、まだよく理解されていません。例えば、少しは、共役および非抱合型胆汁酸輸送の規制の根底にあるメカニズムについて知られています。既存の技術は、この輸送は、主に、ルシフェラーゼベースのレポーター、放射性標識胆汁酸、または蛍光胆汁酸類似体を利用する監視します。後者は、おそらくそれらの特性に影響を与え、胆汁酸の修飾を必要とします。ルシフェラーゼベースのレポーターは悪い時間分解能を持っています。また、これらの技術は、サンプルの損失をもたらし、単一細胞でのイメージングには適用されません。したがって、それはレシオメトリック検出5,6の利点を備えているので、特に、FRETバイオセンサーを使用して、輸送活性の生きた単一細胞イメージングを可能にする方法を使用することが有益であろう。一方、CFの変種P / YFPのフォームは、最も頻繁に、FRETペアを使用し、自己会合を誘発する変異を有するmOrangeとmCherryをを使用して、新しい戦略がレッドシフト胆汁酸センサー7を含む小説センサー、とのFRETツールボックスの拡大につながっています。 我々は以前ファルネソイドX受容体（FXR）のリガンド結合ドメインと融合されるドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）で構成され、遺伝的にコードされたFRET胆汁酸センサー（BAS）を、作成した（FXR-LBD）そして、LXXLLモチーフ8を含むペプチド 。胆汁酸依存的にFXR-LBDとこのペプチドの仲間。 FXRの活性化の際に、シトリンと紺碧の間の距離は、立体構造の変化に起因する変更されます。哺乳動物細胞株における、FXR活性化の結果シトリン/セルリアン比で明らかに検出可能な増加で、精製されたセンサーは、反対方向に動作し、FXRの活性化の際に減少FRET比をもたらしました。このセンサー（CytoBAS）細胞質の胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。細胞内ターゲティングモチーフのカルボキシル末端付加することで、BASの構築物は、異なる細胞区画における胆汁酸濃度の測定が可能、核（NucleoBAS）およびペルオキシソーム（PeroxiBAS）を標的とすることができます。ペルオキシソーム標的モチーフの添加は胆汁酸への応答性を損なうものではないが、細胞透過性FXRリガンドは、ペルオキシソーム8内 PeroxiBASの任意のFRETの変化を誘導しませんでした。この矛盾の性質は不明であるため、プロトコルは以下CytoBASとNucleoBASに焦点を当てています。 この遺伝的にコードされたFRETセンサーの使用は、最近、肝胆汁酸輸送体+ /タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP）Naおよび有機溶質輸送体アルファ/ベータ（OSTαβ）を8含む細胞で実証されました。 NTCPは、主要な肝胆汁酸輸入国であるとOSTαβは基底外側の腸胆汁です電気化学的な胆汁酸濃度勾配9、10に依存輸入および輸出の両方として機能することができる酸トランスポーター。最近のデータは、NTCP、および/またはOSTαβによる胆汁酸輸送の際に、リガンド - FXR-LBD相互作用の結果として、FRET比の堅牢かつ高速応答を観察することができることを示しました。 ここで、我々は、そのような共焦点顕微鏡分析および蛍光セルソーター（FACS）などのFRETを測定する方法のための詳細なプロトコルを記述する重要なステップを強調表示し、潜在的な問題に対処し、別の方法を説明します。この遺伝的にコードされたFRETセンサーを使用して、FXR-LBDと胆汁酸との相互作用を定量化し、生細胞内で直接監視し、リアルタイムでの胆汁酸の輸送および動態を可視化する迅速かつ簡単な方法を提供することができます。 CytoBASとNucleoBASをコードする哺乳動物発現プラスミドは、市販されています。したがって、このバイオセンサーは、さらにに貢献することができます胆汁酸輸送体またはFXRを活性化し、胆汁酸の生物学およびシグナル伝達をより深く洞察を提供する化合物の理解。

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグルス培地 (DMEM)</td><td>ロンザ</td><td>BE12-614F</td><td>L-グルタミンを含まない高グルコース</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)</td><td>ロンザ</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200mM)</td><td>ロンザ</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (10x)</td><td>ロンザ</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25細胞培養フラスコ</td><td>VWR国際</td><td>392-0253</td>ラ<td>ミニンコーティング</td></tr><tr><td>T-175細胞培養フラスコ</td><td>VWR国際</td><td>392-0238</td>ラ<td>ミニンコーティング</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>VWR国際</td><td>734-0229</td><td>ポリ-L-リジンおよびラミニンコーティング</td></tr><tr><td>10cmディッシュ</td><td>VWR国際</td><td>392-0243</td><td>ラミニンコーティング</td></tr><tr><td>ジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticin) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>クローニングシリンダー (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>フェノールレッド不</td></tr>使用 <tr><td>ポリスチレン丸底チューブ (5 ml) Facs チューブ</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>キャップなし、非滅菌</td></tr><tr><td>Falcon 2,063 チューブ (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>スナップキャップ、滅菌済み</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 ウェルカバーガラス</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td></td></tr> 滅菌<tr><td>チャコールろ過 FBS</td><td>Life テクノロジー</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>その他の化学物質</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝的にコードされたfretベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer（FRET）は、単一細胞におけるタンパク質のフォールディング、相互作用、局在を監視するための強力なツールとなっています。FRETの原理に基づくバイオセンサーは、生細胞内の細胞内シグナル伝達イベントを高い時間的および空間的分解能でリアルタイムに可視化することを可能にしました。ここでは、ファルネソイドX受容体リガンド結合ドメイン(FXR-LBD)に融合した2つの蛍光色素からなる遺伝的にコードされた胆汁酸センサー(BAS)の応用について述べます。これにより、多数の胆汁酸種や他の(合成)FXRリガンドによって活性化される胆汁酸センサーが形成されます。このセンサーは、核(NucleoBAS)やサイトゾル(CytoBAS)などのさまざまな細胞コンパートメントを標的にして、胆汁酸濃度を局所的に測定できます。これにより、細胞性胆汁酸の流入、排出、内因性胆汁酸の細胞内分布を迅速かつ簡単に定量でき、蛍光タグや放射性核による標識は必要ありません。さらに、BAS FRETセンサーは、FXRリガンド結合のモニタリングにも役立ちます。最後に、このFRETバイオセンサーは、スペクトル的に異なる他の蛍光色素のイメージングと組み合わせることができることを示します。これにより、細胞内胆汁酸動態と、i)目的タンパク質の局在および/または存在量、またはii)単一細胞内の細胞内シグナル伝達の複合解析が可能になります。

提示FRET-BASセンサはFXRのリガンド結合ドメイン（LBD-FXR）2つのフルオロフォアシトリンと紺碧に取り付けられている）とLXXLLモチーフに基づいています。このセンサは、高い空間分解能と時間分解能（ 図 1 A）と生細胞内で胆汁酸輸送の調査を可能にします。セルリアンとシトリンの変異は分子内複合体（ 図 1 B）の形成を促進するために適用しました。胆汁酸および他のFXRリガンドは、FXRに結合し、それによりコンホメーション変化によってシトリンと紺碧の間の距離を変化させます。哺乳動物生細胞では、これは、増加したFRET効率（シトリン増加、セルリアン減少）（ 図 1 C 1 D）が得られます。共焦点...

私たちは、遺伝的にコード化されたBAS FRETセンサーを使用して、生細胞内の胆汁酸動態を研究するための詳細なプロトコルを提供します。この胆汁酸センサーは、幅広い細胞タイプにおける胆汁酸輸送とFXR活性化を研究(調節)するためのユニークなツールです。

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

この手順の全体的な目標は、遺伝的にコード化されたFRET胆汁酸センサーを使用して、高い空間的および時間的分解能で胆汁酸の輸送とダイナミクスを簡単に視覚化することです。このセンサーは、胆汁や動態とグルコース、脂質、エネルギー代謝との関係など、代謝に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、胆汁酸の標識を必要とせずに、胆汁酸の輸送を単一の生細胞に直接監視できるようになったことです。この手法は、細胞と胆汁酸の輸送とダイナミクスに関する洞察を提供します。また、効果や活性化、単一生細胞の可視化、タンパク質局在と胆汁酸輸送のイメージングを組み合わせるためにも使用できます。遺伝的にコードされた胆汁酸センサー、以下、センサーは、ドナーのセルリアン蛍光色素と、例外的なシトリン蛍光色素分子で構成されています。2つの蛍光色素は、FXR核胆汁酸受容体のリガンド結合ドメインによって結合され、FXR補因子であるペプチドに融合しています。2つの蛍光色素の2つの遺伝子操作されたアミノ酸の変化は、セルリアンとシトリンの間の分子間相互作用を促進します。センサーを運ぶ2つの異なる構造が利用されています。1つの構造では、センサーにはc末端核局在信号が含まれているため、核に蓄積します。他のコンストラクトでは、センサーはターゲティング配列を欠いており、したがって細胞質に局在します。次のビデオプロトコルは、生細胞内のセンサーをイメージングする方法に焦点を当てています。テキストプロトコルは、センサーを発現する細胞を設計する方法と、それらを事実によってさらに分析する方法をカバーしています。細胞のイメージングの準備として、センサーを所望の密度で発現する細胞を、完全な培養培地に無菌の8ウェルカバースリップボトムチャンバースライドでプレートします。細胞が60 t0 70%のコンフルエントに増殖したら、実験を進めます。チャンバースライドに付着した細胞を、200マイクロリットルの1x PBSまたはLeibovitz L-15培地で1回洗浄します。次に、溶液を吸引し、CO2制御が不要なように、300マイクロリットルのLeibovitzL-15培地と交換します。Leibovitz L-15の代わりにPhenol Redを使用したDMEMを使用する場合は、センサーがPHに敏感であるため、データ収集中にPHを追跡することを計画してください。次に、実験で使用する化合物を、GW4064やTCDCAなどの3倍から5倍の濃縮液で希釈液を調製します。イメージング中に50〜100マイクロリットルのアリコートを追加する準備をして、溶液がスライドチャンバー内で迅速に混合されるようにします。次に、共焦点顕微鏡のイメージングソフトウェアを起動し、レーザーをオンにします。顕微鏡には、63倍の油対物レンズ、摂氏37度のインキュベーションチャンバー、および紫色の405ナノメートルレーザーが装備されている必要があります。次に、顕微鏡の設定を調整します。取得モードをXYTに設定すると、単一の焦点面のタイムラプスイメージングが可能になります。画像取得速度を20秒間隔に設定して、休憩中にコンパウンドを追加できるようにします。また、ミッション検出のスペクトル範囲を必ず設定してください。トランスイルミネーションを使用して細胞に焦点を合わせます。次に、ソフトウェア コントロールで、関心領域を定義する円を描画します。蛍光強度が類似し、サイズと形状が正常な細胞を選択します。セルの周囲に近づくように描画しないでください。次に、測定を開始します。それらの値に注意し、セルリアンとシトリンの蛍光が安定するまで測定を続けます。蛍光安定性が達成されたら、測定中に選択した時点で50〜100マイクロリットルの胆汁酸または他の化合物を追加します。ピペッティングの際はチャンバーの端を避け、ゆっくりと液体を加えてください。このステップを正しく実行することは、実験にとって重要です。繰り返しになりますが、先に進む前に蛍光が安定するのを待ちます。5〜10マイクロモルの濃度で100マイクロリットルのGW4064を慎重に追加して実験を終了します。蛍光が再び安定するまで録音を続けます。次に、実験を保存し、データを avi ファイルとしてエクスポートします。画像Jに保存されたaviファイルを開くには、プラグイン、スタック、スタックインターリーバーを選択します。次に、[編集]、[選択]、および[マネージャーに追加]をクリックして、RLIマネージャーウィンドウを開きます。次に、オプションを切り替えて、すべて表示します。楕円選択ツールを使用して、特定のセルをカバーするいくつかのROIを描画します。細胞は何らかの焦点ドリフトまたは移動を受ける可能性が高いため、細胞の周囲に近づかないでください。また、セルの外側の領域に 1 つの円を描画して、背景信号を決定します。セル内のセンサーを発現していない領域も使用できます。次に、ROIを1つ選択し、プラグインをクリックしてから、比率プロファイラーをクリックします。3つの画面がポップアップします。RAW、レシオ、レシオプロファイル。RAWウィンドウは、シトリンの強度の増加を青い線で示し、FRETがある場合はセルリアンの減少を赤い線で示します。比率ウィンドウには、シトリンとセルリアンの比率に関する情報が表示され、FRETの増加に伴って増加します。比率プロファイルウィンドウには、両方のチャネルの蛍光強度測定値の値が表示されます。顕微鏡固有のセットアップファイルを使用すると、チャンネルの順序が逆になって表示されることがあります。次に、比率プロファイルウィンドウから統計分析用のスプレッドシートにデータをコピーします。次に、選択した他のすべてのROIとバックグラウンドROIに対して同じ操作を行います。生細胞の定量的強度に基づくFRET実験を、センサーを発現し、内因性胆汁酸トランスポーターを欠くU2OS細胞に対して実施しました。細胞をTCDCAで処理した。これにより、FRETに変更はありませんでした。細胞をGW4064で処理すると、シトリンとセルリアンの平均比が著しく増加しました。センサーが他のタンパク質と組み合わせることができることを実証するために、センサーをNTCPおよびOSTα-βと共発現させるU2OS細胞を設計しました。その結果、TCDCAとGW4064にシトリン/セルリアン比が明らかに増加したことが示されました。このビデオを見れば、胆汁酸センサーを使用して胆汁酸のダイナミクスを分析する方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、このテクニックは1時間で完了することができます。この手順は、目的のタンパク質の細胞内局在など、より多くのイメージング情報を含めるように簡単に拡張できます。このタンパク質の波長がセンサーと異なる限り。光退色を防ぐためには、細胞を発現するセンサーをできるだけ暗くしておくことが重要です。

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