Name: Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぼう、密閉型細胞培養系を用いたヒト多能性幹細胞および神経幹細胞の培養法。無菌性と再現性を確保し、cGMP・cGLP準拠の前臨床研究に応用可能です。

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著者はXvivo囲まれた細胞培養系を使用することを学んで彼らの助けのためのBiospherixのスタッフ、特にマット・フリーマンを承認したいと思います。実験室でのインフラストラクチャを設定する際に自分の仕事のためのマイルズ＆ケリー建設会社、Inc.のスタッフ、特にラス・ヒューズ。実験室の改造を調整中で自分の仕事のための設備とサポートサービスの小児病院オレンジ郡の部門のスタッフは、特にアダムLukhardとデヴィンHugie。データ管理インフラストラクチャおよびリモートアクセスを設定する際に彼らの助けのための情報システムのオレンジ郡部門の小児病院のスタッフは、特にベトナムトラン。オレンジカウンティエグゼクティブ・マネジメントチームの小児病院プロジェクトの彼らの長年の支援、特に博士マリア・ミノンやブレントDethlefsため。この作品は、子供のオレンジ郡の病院や再生Medicinためのカリフォルニア工科大学によって資金を供給されましたPHSへの補助金TR3-05476を通じて電子。すべての著者は、この作品にも同様に貢献しました。

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
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<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

彼らはバックチャンバを顕微鏡とする処理チャンバにインキュベーターから移動すると、CPF内で増殖した細胞は、酸素や二酸化炭素の濃度に変化は見られません。各チャンバー内の条件は、細胞をインキュベーターから削除される前にセルが保持されている特定のインキュベーターに一致していることが重要です。装置内の雰囲気は、連続的にHEPAろ過され、酸素と二酸化炭素濃度に関してはカスタマイズ可能です。細胞は、それぞれ、標準のPSCまたはNSCのための濃度は、5％と9％で成長させることができます。または代替の濃度が異なる細胞タイプまたは特定の実験のために選択することができます。したがって、この装置は、医療グレードの酸素、二酸化炭素、及び窒素（ 図4）の一定の源が供給されます。これらのガスのすべての3つは、一定の供給を確保ガス固有のマニホールドシステムによって供給されています。装置はまた、からなる校正ガス混合物が供給され酸素10％（±0.01％）、二酸化炭素。マニホールドシステムは、セル製造施設の外に収容され、ガスは、天井を介して施設にパイプされています。校正ガスは、施設内に収容されています。装置は、さらにまた、天井を通して、ハウス真空が供給されています。ユニットを送信する電子監視システム及び無線を使用して、すべてのマニホールドの出力圧力が常に監視されています。任意の圧力が範囲から外れる場合には、セル生産設備のオペレータは、自動的に電話をし、適切な処置をとることができるよう通知されます。 装置の電力要件は、6つの専用の120 V回路天井から下降し、一定の供給を確保するために、病院のバックアップ発電機に接続することによって満たされます。装置の動作は、無停電電源装置から給電PCベースのコンピュータにソフトウェアを介して制御されます。これらの電源とコンピュータの手配でも公共の電源システムに障害が発生した場合に継続的にシステム関数ことを確認してください。装置を制御するソフトウェアは、酸素と二酸化炭素濃度の制御、ならびに温度、湿度、及びチャンバ圧力を可能にするユーザーフレンドリーなグラフィカル・インターフェース（ 図1）を有しています。すべてのこれらのパラメータの値は、連続的に、すべての装置パラメータの実行記録を提供するために記録されています。このデータは、それらの完全性を保護するために毎晩、リモートサーバー上にバックアップされます。コンピュータとソフトウェアが評価および/または任意のパラメータを変更するには、管理ユーザーがリモートでアクセスすることができます。また、コンピュータとソフトウェアは、装置パラメータの対話的な評価を可能にし、ローカルユーザーとトラブルシューティング、リモートからアクセスすることができます。追加の警報送信ユニットを装置に接続されたセル生産設備のオペレータは装置の任意の範囲外の状態が通知されるように。リモートアクセスCapabilitiesは、ログインして範囲外の状態を具体的に評価することができます。 装置は、モジュラーシステムの両方マクロとミクロの意味で設計されています。このようなインキュベータや処理室のような個々の細胞培養モジュールは、互いに対してそれらの寸法および要件に関して、ならびにそれらのレイアウトにカスタマイズすることができます。さらに、個々のモジュールの制御機能の多くは、それ自体は、モジュール、そのような個々の雰囲気ガスコントローラは、例えば、容易にシステムに重大な影響を与えることなく交換することができることです。 そのような細胞培養物の顕微鏡可視化および操作のための1つのような特殊な処理チャンバは、容易にシステムに適合されます。細胞は生きて染色することができ、そしてコロニーをt内部同じ大気条件に切開することができるように、位相差および蛍光顕微鏡の両方がシステム（ 図6）内にあります彼はインキュベーター。処理室の側壁で密封されたグロメットを介して、ケーブルの配線は、通常はカート（ 図6）に、このような電源やコンピュータなどの機器は、装置の外に保つことができます。 セル生産設備内の処理室は、従来のBSCとは異なる空気流パターンを有します。従来のBSCで、空気の流れは、中央排気口から流下した後、キャビネットの床の前方及び後方部分に二つの異なる吸気口によって取り込まれている2つの別々の流れ、に分かれます。これとは対照的に、CPFは、天井の前方部分で単一の通気口があります。空気が下向きにし、それがその後、吸気口の中に上向きに描かれている室の奥に向かって流れます。 CPFは、本質的に非常にきれいであるが、このユニークな気流パターンは、技術者がわずかに汚染のリスクを低減するために、それらの技術を調整しなければならないことを意味します。従来のBSC、ラボワーカーの場合と同様にhouldの回避は、オープン細胞培養プレートとメディアボトルの上流に手を置きます。しかし、上流の方向は、CPFに変更されましたセル生産設備の研究室自体はかなり標準であり、-20℃の冷凍庫を装備しています、-80℃の冷凍庫、4℃の冷蔵庫、遠心分離、および水浴。研究室では、便利なハンズフリー操作用のフット・コントロールとのシンクがあります。この研究室では、機能の臨床セル生産施設となるようにするためには、しかし、いくつかの追加の修正がまだなされなければなりません。まず、装置自体が揮発性有機化合物、微粒子、及び汚染除去のために使用される二酸化塩素の濃度を監視する能力を有するようにアップグレードされなければなりません。第二に、FACS機を含む処理チャンバは、バッファモジュールを介して収容し、装置の残りの部分に接続されてもよいです。これは、細胞選別とTRの精製を可能にします適切な環境条件下でansplantable細胞集団。最後に、装置全体が柔らかい壁クリーンルーム内に収容されなければなりません。これは装置5のための国際標準化機構（ISO）クラス8環境を提供します。 CPFの高い無菌性およびコンピュータ制御の性質は、細胞ベースの治療法との良好な製造プロセスと将来のアプリケーションのための理想的なシステムになります。汚染の危険性が大幅に緩和されるが、より重要なことには、細胞増殖の条件は、自動的に記録され、コンピュータシステムによってアーカイブされます。ガス濃度、温度、湿度、およびシステムへのアクセスのすべてのイベントの偏差は厳密に文書化されています。製品の品質上の問題を調査するときに非常に役立つことができます。しかし、まだ制限があります。任意および全ての試薬 ​​および消耗品（ 例えば、培地成分、ピペット、プレート）の使用量は、別々に文書化されなければなりません。加えますitionally、CPFの監視システムによって文書の変数とは全く無関係である生じる可能性がある（ヒューマンエラーの多くの形態を含む）の潜在的な問題が多数あります。このように、高度に訓練された人材とタスクの詳細なマニュアル文書化の必要性は、所定の位置に残ります。

標準的な幹細胞培養技術は、細胞に過度のストレスを与え、細胞を許容できない汚染リスクにさらすいくつかの環境制約に苦しんでいます。標準的な細胞培養条件下で細胞が耐える可能性のあるストレスの中には、二酸化炭素と酸素濃度の急激な変化があります3,4。これは、細胞がインキュベーターからバイオセーフティキャビネットや顕微鏡に移動されたときに発生しますが、これは細胞にとって最適ではない可能性があります。以前の研究では、多能性幹細胞と神経幹細胞の両方を低酸素状態で培養することの利点が確認されており4,11、最良の結果を得るためには、これらの条件が連続的である必要がある。さらに、細胞の培養と操作のほぼすべての段階で、実験室の環境と人員が細胞に影響を与えるため、細胞汚染のリスクが高くなります。従来のクリーンルームは、汚染リスクを大幅に低減する効果的な方法の1つですが、高価で設置面積が大きく、二酸化炭素や酸素濃度に関連するストレス要因に対処できていません。
汚染リスクとガス濃度の両方に対処することができ、cGMP基準9を満たす資格を持つ細胞生産施設は、基礎科学研究だけでなく、臨床応用にも高品質の細胞を提供します1,6,7。このような細胞生産施設は、少なくとも、以下の構成要素からなる:細胞培養の供給および操作のための加熱作業スペースとして機能するプロセスチャンバー;試薬、チューブ、およびツールの初期滅菌用の層流フード。フードとプロセスチャンバーの間に2つの緩衝エアロックチャンバー。プロセスチャンバーからアクセス可能な2つの細胞培養インキュベーター。プロセスチャンバーに隣接する顕微鏡チャンバーと、そして最後に、これらのモジュール内の条件を設定および監視するためのコンピューターソフトウェア。この基本インフラを利用することで、多能性幹細胞や多能性神経幹細胞の標準的な摂食・継代などの手法から、センダイウイルスによるリプログラミング、in vitro遊走研究、神経幹細胞の分化による電気生理学的特性評価など、より専門的な手法まで、さまざまな作業を行うことができます。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo ソフトウェア</td><td>Biospherix</td><td>バージョン i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 マニホールド</td><td></td><td>Amico P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 マニホールド</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 マニホールド</td><td>ウエスタン イノベーター</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 DP21 カメラと蛍光</td><td>オリンパス株式会社</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝ナトリウム</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子 2</td><td>R&D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>プロチド</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>ハンクスベースの細胞解離バッファー</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>R&D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 血清サプリメント</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml セロジカルピペット</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml セロロジカルピペット</td><td>オリンパスプラスチック</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml セロロジカルピペット</td><td>オリンパスプラスチック</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清ピペット</td><td>オリンパス プラスチック</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 血清ピペット</td><td>オリンパス プラスチック</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 フラスコ</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 & マイクロ;l ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro;l ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

この論文は、基礎研究と前臨床研究のために、カスタムメイドの市販の閉鎖型細胞培養システムの使用方法を説明しています。バイオセーフティキャビネット(BSC)とインキュベーターは、基礎研究および前臨床研究のための細胞株の培養と拡大の標準と長年にわたりなってきました。しかし、多くの幹細胞研究室の焦点が基礎研究から臨床応用に移るにつれて、細胞培養システムには追加の要件が必要になります。すべてのプロセスは十分に文書化され、無菌性と再現性に関する優れた要件を備えている必要があります。従来のインキュベーターでは、給餌、継代、またはその他の操作のために細胞が取り出されるたびに、ガス濃度と温度が大きく変動します。このような中断は、cGMPおよびGLPガイドラインの標準ではない環境の一因となります。これらの中断は、特に細胞が治療目的に利用される場合に最小限に抑える必要があります。標準的なBSCおよびインキュベーターシステムからクローズドシステムに移行する動機は、そのような中断を無視できるからです。クローズドシステムは、細胞培養物を供給および操作し、温度とガス濃度が一定である制御された環境で細胞培養を維持するための作業スペースを提供します。このようにして、多能性幹細胞と多能性幹細胞は、その派生の瞬間から最終的に治療に使用されるまで、最適な健康状態を維持することができます。

本稿では、いくつかの詳細にセル生産施設、クローズドシステムの内部で細胞を培養するユニークな側面について説明します。セル生産設備の大部分は、小さなフットプリントを有し、容易に6×7.5 m 2の部屋（ 図2）内に収容することができるカスタムメイドの、囲まれた、細胞培養装置を含みます。時間がない時に実験者や環境にさらさ装置内の細胞です。この装置は、複数のモジュールで構成さ：処理チャンバ、層流フード、フード処理室、二つの細胞培養インキュベーター、処理室に隣接顕微鏡室との間で2緩衝エアロックチャンバ（ 図3）。システムは、環境変数を制御および監視することを可能にするソフトウェア（ 図1）によって制御されます。このソフトウェアを実行しているコンピュータは、無停電電源装置です。ガスは番目に供給されます酸素、窒素及び二酸化炭素（ 図4）のためのマニホールドの集合によって電子システム。アクティブセットと予備セット - デバイス用のガスがタンクごとの2セットを持つマニホールドシステムによって供給されています。アクティブセットがドローダウンされた場合、マニホールドは、自動的に予備セットとスタッフの順序交換タンクに切り替わります。電源は、バックアップ発電システムです。 多能性神経幹細胞は、新規の機器に固有の追加の合併症と以前に開発されたプロトコル9を使用して、この施設で、低酸素条件下で増殖させることができます。多能性幹細胞は、次いで、単離し、拡張され、完全にトランスフェクトされたコロニーを同定するために多能性特異的抗体を用いて、センダイウイルスを使用して導出することができます。 （ 図5AおよびB）は 、これらのiPS細胞から、神経幹細胞及び神経細胞は、デュアルSMAD阻害を用いて導出することができ、それらの表現型は、USIを確認しました<html> NG NSC特異的抗体（ 図5C及びD）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> セル生産設備については、図1のグラフィカルインタフェース。（A）CPFのグラフィカルな表現は、デフォルト画面で、（ 図1に2F） 図3。バッファモジュール1の上にマウスのクリックで示したCAD図面と一致しましたO 2の値が（ 図3の3）処理室に一致するように設定され、その制御画面（B）を開きます。同様に、プロセスチャンバまたはインキュベータ1をクリックすると、値は適宜変更または監視することができるそれぞれのコントロール画面（それぞれCおよびDを 、）、起動します。<html>目標確認= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> セル生産設備2.図。（A）右フロントビューから見たシステム。天井に電力とガスの接続と右に顕微鏡のアクセサリーやコンピュータとカートに注意してください。 （B）右で見られるバッファモジュールへのアクセスドアを持つ層流フード。後方から見た（C）は、2つのインキュベータ（黒ドア）を有するプロセスチャンバ。 （D）システムの右側を通るビュー顕微鏡を示す距離で見られるバッファ室へのドアで監視。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> セル生産設備の図3. A CAD図面は装置に入るすべてのアイテムは最初の層流フード内で乾燥させ、アルコールと空気で拭いている（1）。アイテムはその後UCPCモジュールに渡される前にフロントバッファモジュール（2F）内の適切な雰囲気に移行、またはされているプロセスチャンバー（3）。細胞は、2つのインキュベータ（4,5）で培養します。ライブ細胞染色、コロニーピッキング、一般的な細胞形態および移行解析の評価は、UPCモジュールで行われ、または顕微鏡商工会議所（6）。最後に、廃棄物はリアバッファモジュール（2R）を介してシステムを出る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> ガスと電力の図4.ソース。（A）は、実験室のすべてのインキュベーターを供給するようにCO 2マニホールドは、4×4のセットアップです。 （B）O 2マニホールドは、2×2の設定のみを供給し、セル生産設備があります。システムのための窒素はまた、自動的に（左下）cryofreezersを埋める（右へ）液体窒素マニホールドに取り付けられた気化器（ちょうど終了記号以下のC、）で生成されます。マニホールドは、160 L液体窒素タンクの二対によって供給されている2×2の設定です。 CO 2、O ​​2、およびN 2は、閉止弁（D）を介して天井から供給されます。ハウス真空はまたこの場所で供給されます。システムに電源を供給する電源ケーブルの一対だけ供給ガスの閉止弁の背後に見られます。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> センダイウイルスと低酸素症に派生図5.多能性幹細胞。（A）SC187-SF4-2I0-E3 iPS細胞iPS細胞（命名法のStover ら 9で見つかった）、位相コントラスト10X。 （B）SC88.1-UH1-2I0性IPSC AF-594で標識したTRA-1-60、1でライブ染色：メディアで100希釈。すべてのiPS細胞は、センダイウイルスで5％のO 2のセル生産設備に導入しました。 （C）チャンバースライドで5％O 2で成長したSC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC由来のNSCの位相コントラスト。次いで、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ヒトネスチン一次抗体で染色し、アレックス-488二次抗体ました。すべてのスケールバーは100であります1;メートル<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

これは、従来のバイオセーフティキャビネットとインキュベーターに取って代わり、最大の無菌性と再現性を可能にする密閉型細胞培養システムで多能性幹細胞(PSC)と神経幹細胞(NSC)を増殖させるプロトコルです。この装置は、臨床適正製造基準(cGMP)および臨床適正ラボ基準(cGLP)のガイドラインを満たしています。

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

この装置を使用する全体的な目的は、最大限の無菌性を維持しながら、定義された大気条件下で幹細胞を培養することです。本日は、細胞培養パラメータを極めて精密に制御できる密閉型細胞培養施設の利用方法について実演します。当研究室では、この施設を多能性幹細胞および万能性幹細胞の培養に使用しています。この手法の主な利点は、細胞を処理する際、どこにいても常に一定の環境に置かれることです。細胞の操作中であっても、インキュベーター内や顕微鏡下であっても、酸素、CO2、および温度への曝露がサイクル全体を通じて一定に保たれます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のスタッフサイエンティストであるAlexander Stoverが行います。この手順を開始するには、モジュールをクリックしてガス濃度を調整します。現在の設定が表示される新しいウィンドウで、「Setpoint」の下にある既存の酸素設定値（setpoint value）をクリックし、このモジュールに必要な酸素濃度を入力します。次に、緑色のチェックマークをクリックして設定値を確定します。二酸化炭素についても同様の操作を行い、酸素のみ調整可能なバッファチャンバーを除くすべてのモジュールに5%の二酸化炭素の設定値を入力します。次に、プロセス値（Process Values）として表示される現在のガス濃度をモニタリングし、新しい設定値に達していることを確認してください。その後、すべてのモジュールのガス設定値を適切な値に調整します。互いに開放されるチャンバーの二酸化炭素および酸素濃度を一致させます。例えば、5%oxygenで細胞を培養しているインキュベーターを開封する前に、プロセスチャンバーを5%oxygenに調整します。また、プロセスチャンバーに物品を追加するために使用するバッファーチャンバーも5%oxygenに調整してください。続いて、ガス調整と同じ画面を使用して、プロセスチャンバーの温度を37 °Cに設定します。その後、プロセスチャンバーの床面温度を37 °Cに設定します。各インキュベーターの下にあるインキュベーションモジュールバンクをクリックし、バンクの温度を37 °Cに調整します。ラミナーフローフード内で、システム内に導入するすべての材料に70% ethanolをスプレーし、乾燥させます。フラスコや細胞プレートは、70% ethanolを浸した滅菌ガーゼスポンジで穏やかに拭き取ります。次に、バッファーチャンバーの外面ドアと内面ドアの両方がしっかりと閉まっていることを確認し、外面ドアを開けてアイテムを中に配置してから、ドアを閉めます。ソフトウェアを使用してバッファーモジュールを選択し、「Dilution Factor」タブをクリックします。「Log Factor」ボックスに1を入力し、「start」をクリックします。グラフィカルインターフェースの「Dilution Factor」の点滅が止まったら、バッファーチャンバーの内扉を開き、材料をプロセスチャンバーへ移動させます。プロセスチャンバーからアイテムを取り出すには、まずバッファーチャンバーで希釈係数（Dilution Factor）処理が行われたことを確認してください。次に、インナードアを開けて取り出したいアイテムを中に入れ、ドアを閉めます。その後、アウタードアを開けてアイテムを取り出します。各インキュベーターの底部にあるウォーターパンに、3枚のシャーレを配置します。これらのシャーレに滅菌水を満たし、インキュベーター内で設定した相対湿度の設定値を維持するために不可欠な水位を保持してください。グラフィカルインターフェース内で、「incubator」をクリックします。次に、設定値にある相対湿度の既存の値をクリックし、85%と入力します。その後、緑色のチェックマークをクリックしてこの値を確定させます。続いて、導入する細胞の種類に応じて、バッファーチャンバー、プロセスチャンバー、およびインキュベーターを必要なガス設定値に調整します。滅菌ガーゼとベンザルコニウム塩化物ベースの製品などの不燃性消毒剤を用いて、プロセスチャンバーの表面を清掃します。次に、手袋およびドアハンドルなどの頻繁に触れる表面を清浄します。続いて、ラミナーフローフードの表面とバッファーチャンバーを70% ethanolで清掃し、乾燥させます。その後、細胞が入ったフラスコまたはプレートをフード内に設置し、エタノールを浸した滅菌ガーゼスポンジで外表面を軽く拭きます。次に、フラスコまたはプレートをバッファーチャンバーに入れ、「Dilution Factor」を実行します。完了後、直ちにフラスコまたはプレートを適切なインキュベーターに移動させてください。インキュベーターはプロセスチャンバーの背後にあるため、細胞を配置する際は棚をプロセスチャンバー側へ引き出し、インキュベーターのドアを不必要に長時間開いたままにしないようにしてください。このステップでは、細胞培養培地を準備します。培地容器のキャップをわずかに開けた状態で20分間放置し、システム内の二酸化炭素および酸素濃度と培地を平衡化させます。その後、ウェルから古い培地を除去します。多能性幹細胞の場合、培地交換中の乾燥を防ぐため、少量の古培地を残してほぼすべての古培地を除去します。神経幹細胞の場合は、古培地の半分を除去します。その後、細胞培養プレートに新鮮な培地を添加し、プレートを所定のインキュベーターに戻します。ここにiPSCsの画像を示します。これらは、培地で1/100に希釈したAF594標識Trial 160で生細胞染色したiPSCsです。すべてのiPSCsは、細胞作製施設において、Sendai virusを用い5%酸素条件下で導入されました。こちらは、チャンバースライド内で5%酸素条件下で培養したiPSC由来神経幹細胞の位相差像です。その後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、抗ヒトNestin一次抗体およびAlexa Fluor 488二次抗体で染色しました。習熟すれば、適切に実施することで、一連の操作を2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、開始前にガス濃度を正しく設定することが重要です。この手順の後、リプログラミングや分化などの他の手法を実施することで、低酸素状態が多能性やマルチポテンシーに与える影響など、さらなる疑問を明らかにすることができます。この技術の開発により、幹細胞生物学分野の研究者が小児神経変性疾患の治療に向けた臨床用細胞の製造を探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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