シクロデキストリンNanospongeヒドロゲル中のイブプロフェンカプセル化の輸送特性：プロトンHR-MAS NMR分光研究

本研究の全般的な目的は、シクロデキストリンナノスポンジの合成を行い、それを薬剤担持ハイドロゲルへと変換し、高分解能マジック angle spinning核磁気共鳴分光法を用いてハイドロゲル内部の薬剤拡散性を調べることです。シクロデキストリンナノスポンジは、シクロデキストリン（CD）とEDTAの脱水縮合による段階成長重合によって調製されます。特に断りがない限り、本研究で用いるCDユニットのネットワークは、有機および無機種を吸収および放出することが可能な形態であることを示します。

高分解能マジック角回転（MAS）NMRの主な利点は、ドラッグデリバリーへの応用が期待されるポリマーホスト内に封入された薬物の移行特性をモニタリングできることです。合成手法は非常に単純であり、室温で実施されます。段階成長重合反応は約10分で完了します。

ポリマー水素結合ネットワークに捕捉された薬剤の例として、そして実際的な6倍希釈投与の代表として、イブプロフェンを選択しました。乾燥したβ-シクロデキストリンを100 °Cのオーブンで恒量になるまで乾燥させます。また、250 mLのDMSOおよび100 mLのトリエチルアミンを、プロトコルで使用する前に4 Å分子ふるいで24時間乾燥させておきます。

50 mLの単口丸底フラスコに25 mLのDMSOを導入します。磁気攪拌下で、5.675 gのβ-シクロデキストリンを加えます。ダマの形成を抑えるため、β-シクロデキストリン粉末は少量ずつDMSOに加えてください。

約30分後、10 mL graduat pipetteを用いて、均一な溶液に6 mLのトリエチルアミンを加えます。フラスコを室温に維持したウォーターバスに浸し、混合物を15分間攪拌し続けます。シクロデキストリンナノスポンジ1-4を調製する場合、激しく攪拌しながら5.124 gのEDTA二無水物を加えます。

次に、シクロデキストリンナノスポンジ1-8を調製するため、激しく撹拌しながら10.248 gramsのEDTA二無水物を加えます。3時間後、スパチュラを用いてフラスコからシクロデキストリンナノスポンジである固形物を回収し、乳鉢と乳棒で粗く粉砕します。固形物をアセトン浴で洗浄し、その後、ろ紙上で洗浄およびろ過を行います。

すべての固形物を室温で48時間空中乾燥させた後、乳鉢と乳棒を用いて乾燥した材料を細かく砕きます。その後、45 °Cで2時間真空保持します。高分解能マジック角回転NMR試料の調製では、まず重水中で0.27 Mのイブプロフェンナトリウム塩溶液を調製します。

2 mLのガラスバイアルに入った150 µLの溶液に、20 mgのシクロデキストリンナノスポンジ1-4と2 mgの無水炭酸ナトリウムを加えます。バイアルの中身を小型スパチュラで混ぜて均質化します。シクロデキストリンナノスポンジ1-8ポリマーについても、この工程を繰り返します。

均一で完全に膨潤したハイドロゲルを得ることは、良好な高分解能質量NMRスペクトルを得るための最初の重要なステップです。ハイドロゲルをNMRローターに配置する際は、ローターの回転不備の原因となる気泡が入らないよう、細心の注意を払ってください。小型のスパチュラを使用して、高分解能質量実験に適した5 mm NMRローターにゲルを導入します。

次に、ローターをNMR分光計の磁石内に挿入します。磁石内に入れた後、ニューマチックユニットを用いてローターを最大4,000 hertzまで回転させます。高分解能プロトンNMR実験を行うには、質量ニューマチック制御ユニットでローター回転速度を4 kHzに設定し、可変温度ユニットで試料温度を305 kelvinに設定します。

プロトン共鳴においてパルス勾配スピンエコーパルスシーケンスを用い、シクロデキストリンナノスポンジ1-4およびシクロデキストリンナノスポンジ1-8ハイドロゲル中のイブプロフェンの拡散HR質量スペクトルの1次元スペクトルを取得します。拡散実験はBP LEDパルスシーケンスを用いて行います。これは、間接次元において勾配強度が2%から100%まで線形に増加する勾配ランプを用いた擬似2次元実験です。

信号強度は、拡散時間と勾配パルス P30 に応じて減衰します。実験を適切に実施する前に、これらのパラメータを最適化する必要があります。最適化は、拡散時間を一定に保ちながら P30 を変化させ、2つの一次元測定を行うことで行います。

拡散時間を50から200ミリ秒の範囲で増加させ、可変拡散時間の測定を行います。各実験につき、32本のスペクトル配列を収集します。その後、テキストプロトコルに記載されている通りにデータを処理してください。

基本的なパルス磁場勾配スピンエコー実験により、ハイドロゲル中のイブプロフェンの分子平均二乗変位を測定できます。勾配強度が大きくなるにつれて、NMR信号強度は減衰します。この減衰のフィッティングにより、Z-squaredとして示される分子平均二乗変位が求められます。

さらに、平均二乗変位は拡散領域のタイプに関連しています。α指数は、拡散時間の関数としての平均二乗変位を対数-対数線形回帰させることで実験的に得られます。α指数の値は、ハイドロゲルマトリックス中におけるイブプロフェンの拡散領域を示す指標となります。

αが1に等しいとき、等方的で制約のない拡散が存在します。αの値が1未満である場合は、劣拡散領域であることが示されます。そして、αの値が1を超える場合は、超拡散領域となります。

ハイドロゲルマトリックスに封入されたイブプロフェンは、ポリマーの調製方法に応じて2つの異なる拡散領域を示します。ナノスポンジ1-4のハイドロゲルは、劣拡散領域によって表されます。対照的に、ナノスポンジ1-8のハイドロゲルは、わずかに超拡散的な領域によって特徴付けられます。

この反応に習熟すれば、適切に実施することで1時間以内に高収率かつ高純度で完了させることができます。得られた材料は、粘性ハイドロゲルを形成することで興味深い吸水能を示し、そこへ生物活性分子を容易に組み込むことが可能です。このような高分子マトリックスに封入された生物活性分子の輸送特性における分子状態は、HMS NMR技術を用いて実験的に解析することができます。

シクロデキストリンナノスポンジから調製したハイドロゲル中におけるイブプロフェンの拡散に関するNMRの結果は、ポリマーを適切に調製することで拡散を制御できることを示しています。シクロデキストリンナノスポンジハイドロゲルにおいて、イブプロフェンは亜拡散および超拡散の両方のレジームを示しました。この知見は、シクロデキストリンナノスポンジハイドロゲル・スキャフォールドの放出特性を独創的に設計するために活用できます。