Name: の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション PilGで Xylella fastidiosa (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶナノマイクロ流体フローチャンバーを用いたXylella fastidiosaの攣縮運動の可視化と機能解析。この方法により、細菌の運動性と病原性の関係を詳細に観察し、ブドウのピアス病対策に寄与する知見が得られます。

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この研究は、米国農務省、農業研究サービスによってサポートされていました。この資料に記載の商品名や商用製品は、特定の情報を提供する目的のためだけに記載されていると、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。

1.細菌コロニーの周辺フリンジ<ol><li> Xを育てます28℃でfastidiosa（ のXf）テメキュラ野生型22、pilG欠失変異体のXfΔpliG（前述削除戦略23を使用）、およびその相補XfΔpliG-C（以前染色体ベースの遺伝的相補戦略24を用いて説明した）PD2培地寒天プレート上で25 5-7日のために、C。 </li><li> 15分間121°C（249°F）で水にオートクレーブセロファン（1×1cm 2の）。 、セロハンの1枚をピックアップ空のペトリ皿にセロハンの一角に触れて水を抜く、慎重に寒天表面と空気乾燥の15％の上にセロハンを築きます。 </li><li>個々のXを拾いますfastidiosaコロニー滅菌丸い楊枝で寒天プレートに寒天表面の15％に重ねセロハンの滅菌シート上に無菌的に細胞を発見。プレートをインキュベート2〜3日間28℃でS。 </li><li> 2X対物レンズと10倍の接眼レンズを解剖顕微鏡を用いて、コロニーのエッジ形態を調べます。コロニーの周辺のフリンジを撮影。 </li></ol> 2.顕微鏡やマイクロ流体フローチャンバー<ol><li>以前5,18に記載したものと同様のフォトリソグラフィ手順を使用したマイクロ流体デバイスを製造します。標準的なリソグラフィ方法26を使用して、マスターのシリコンウェハ上のコンピュータ支援設計ソフトウェアを持つ4つの並列チャネルを設計します。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）でシリコンウェハマスターからマイクロ流体チャンバを作成します。シリコンウエハーマスター上に未重合PDMSを注いで、1時間60℃でそれを硬化させます。ウェハマスターからPDMSのレプリカをはがし、ガラスカバースリップの同じサイズとして22ミリメートルX 40ミリメートルにブレードとPDMSレプリカをトリミングします。 </li><li> PDMSのレプリカ、ガラスカバースリップ（22×40 mm 2）とし、microscを公開2分27用30 Wで空気プラズマにOPEスライド（51のx 76ミリメートル2）。サンドイッチガラスカバースリップと微小流体室を構築するためのガラス顕微鏡の間にPDMS本体。 </li><li>パターン化チャネルの各端部にPDMS貫通孔​​（5.5ミリメートル直径）ドリル。長い12〜20センチメートルにシリコーンゴムチューブをカットします。 PDMSレプリカのチャネルの各開口端​​部に、シリコーンゴム管（外径5.1ミリメートル、内径2.1 mmのを0.8mmの壁）の一端を挿入し、1時間60℃で重合していないPDMSとそれを密封します。 </li><li>プラスチック製のルアーコネクタのとげの終わりにチューブの他端を接続します。アルミホイルで組み立てられたマイクロ流体チャンバをラップし、20分のためにそれらをオートクレーブ。 </li><li> Xの細菌細胞を収集fastidiosa野生型、変異型のXfΔpliG、および相補XfΔpliG-C PD2培地プレートから使い捨て接種ループを使用して、掻き介して。細胞密度を調整しますPD2ブロス中の600nmで0.05の光学密度を、以前23記載されているように。 1ミリリットルガスタイトシリンジに細菌の細胞溶液を収集します。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流体デバイスをマウントします。 PD2ブロスを含む5ミリリットルガスタイトシリンジに導入管を接続します。シリンジポンプで5ミリリットルガスタイトシリンジを取り付けます。 </li><li>廃棄物容器に排出管を接続します。 0.2μL分の媒体流量を維持-1で30分間、システムを安定化します。 </li><li>細菌細胞溶液を含む1ミリリットルガスタイトシリンジに側入口管を接続します。チャネルに到達するまで、ゴム管を介して細菌の細胞溶液を洗い流します。チャンバーからの事前の画像キャプチャに結合していない細胞をフラッシュするために0.2μlの分の媒体流量-1別の30分間の維持。 </li><li>光を制御するために、顕微鏡の視野-調整部分の下顕微鏡シャッターをマウントします。シャッター共同にシャッターを接続しますntrolシステムやコンピュータにシャッター制御システムを接続します。 </li><li>顕微鏡のビデオポートにデジタルカメラをマウントし、それをコンピュータに接続します。タイムラプス撮影のソフトウェアを実行して、メニューから「シャッター」機能を選択して、ソフトウェアとシャッターへの接続を確立するためのソフトウェアでデフォルトとして自動的にインストールシャッターを認識しています。 </li><li>自動的にソフトウェアのデフォルトのキャプチャデバイスとしてデジタルカメラを認識し、ソフトウェアとデジタルカメラとの通信を確立するためにタイムラプスレコーディングソフトウェアのメニューから「デジタルカメラ」機能を選択します。 </li><li> 20X位相差光学系を用いて、チャネルのいずれかで細菌細胞を見つけ、その後、画像キャプチャの前に40X対物レンズに切り替えます。 </li><li>顕微鏡から画像を取得するには、メニューからデフォルトパラメータを使用して、「画像取得」機能を​​選択し、タイムラプス録画ソフトウェアを実行します。次に、「タイムラプスを取得」機能を開き、6-24時間は、Xのけいれん運動性を観察するために必要な実験に応じての持続時間30秒5,18,28に時間間隔を設定fastidiosa 5,18,28。タイムラプス撮影を開始するために「OK」をクリックします。メニューから「スタック機能」をクリックして、録音を終えた後、コンピュータ上の保存先フォルダ内の画像をスタックに「名前を付けて保存」を選択します。 </li><li>複数のチャネルについては、6時間、最初のチャンネルから30秒ごとにタイムラプス画像をキャプチャします。標的細胞を見つけるために次のチャネルに顕微鏡の対物レンズを移動します。実験は4つのチャネルを利用するように設定されている場合は、4つのチャネルを順次それぞれの画像をキャプチャするために上記のようにタイムラプス機能を繰り返します。限り3として日間連続タイムラプス画像キャプチャを続けます。全ての実験は、室温（23±2℃）で行いました。 </li><li>タイムラプス画像をコンパイルしますタイムラプス撮影イメージングソフトウェアを使用して、ビデオファイル。タイムラプス撮影のソフトウェアを実行して、メニューから「スタック機能」をクリックして、コンピュータから積み重ねられたファイルを開くには、「オープンスタック機能」を選択します。 </li><li>すべての画像を選択し、「AVI」出力フォーマットを選択し、スタックモジュールから「映画を作る」機能を起動します。コンピュータ上の保存先フォルダ内のビデオファイルを保存するために「名前を付けて保存」をクリックします。 </li><li>コンピュータ上の保存先のフォルダからコンパイルされたムービーを選択し、それらを再生。そして、生成されたビデオファイルの中の細菌細胞の単収縮運動の活動の結果の可視化を通じて単一細胞の運動性を観察します。 </li></ol>

<ol><li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li>
<li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%2C+a+regional+problem+or+global+threat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li>
<li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%3A+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li>
<li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+and+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility%2C+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li>
<li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li>
<li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li>
<li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li>
<li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+%27stick-and-roll%27+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion%2C+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li>
<li>Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).</li>
<li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li>
<li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li>
<li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li>
<li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Operon%2C+Pil-Chp%2C+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li>
<li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemoreceptors%3A+High-performance+signaling+in+networked+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li>
<li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li>
<li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa%3A+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li>
<li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li>
<li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+Media+for+the+Pierce%27s+Disease+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-%28dimethylsiloxane%29+and+their+chemical+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li>
<li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

本研究では、Xの動きの挙動を特徴付けfastidiosa PilG変異体のXfΔpilGと新たに設計された複数の並列-ナノチャネル微小流体チャンバ内のその相補XfΔpilG-C株。新たに設計された微小流体室は、単一の50μm幅のチャネル18と以前の設計に比べて幅が100μmのナノチャネルと最大4つの並列チャンバを持つことができます。改善され、より広いナノチャネルは、メディアが流れると細菌細胞の導入を容易にします。また、このマイクロ流体室は、構築し、組み立てるために1）簡単です。 2）比較的安価。 3）実験的な要件を変化させることに容易に適用できます。結果として、このチャンバ設計は、多様な実験微小環境下での細菌細胞の運動の長期的観察を可能にします。 電流throuのOW FLを安定させますGH微小流体チャネルは、実験環境の様々な環境下で細菌細胞の運動性の観察のための無傷の流入微小流体微小環境を作成するための重要なステップです。前の細菌細胞の導入にメディアと...

Xylellaのfastidiosaはブドウでピアース病を含む、経済的に重要な作物の多数の疾患を引き起こすグラム陰性非鞭 ​​毛、病原性細菌である（ ヴィティスヴィニフェラ L.）1,2、3。この細菌は導水木部に限定されています船。ブドウの感染は、水ストレスや栄養不足3における木部船と結果の閉塞を引き起こします。成功植民地化は、植物3の残りの部分に感染の初期のサイトから移動する細菌の能力に依存します。運動性をけいれんすると、鞭毛に依存しない細菌の延長を経て動き、添付ファイル、およびXに特徴付けられている極性IV型線毛4の後退の手段でありますfastidiosa 5,6,7。 単収縮運動性は、レーザーピンセット及び原子間力顕微鏡（AFM）8,9,10により観察されました。これらの技術を用いて、TN.のIV型線毛によって生成された魔術の運動能淋菌およびP.緑膿菌は、FL uorescentlyラベリング線毛と微視的にその動きを捕捉することによって特徴づけられました。両方の方法は、個々の細菌の接着力を詳述しているが、手順が複雑で時間9,10を消費しています。微小流体チャンバは、長距離個 ​​々の細胞の遊走、ならびに細菌細胞5,6の小さな凝集物を観察するために使用しました。これらのチャンバは、タイムラプス画像記録システム11,12,13,14と統合プレートに微細加工・ナノチャンネルとして設計されました。マイクロuidic室デバイスが移動行動や細菌の細胞間相互作用を研究するためのいくつかの利点を提供FL：（ⅰ）それは、複数のチャネル機能を備えた統合プラットフォームを提供します。 （ⅱ）それは細菌のナノスケールの特徴における単一細胞の運動や集計を調べることができます。 （ⅲ）それが直接メートルを可能にしますicroscopic細菌細胞の画像記録とタイムラプス解析、（iv）は、それは微小環境中の細菌の個々のおよび/または集団の長期的、空間的および時間的な観測を提供します。 （V）チャネルにおける培地の流量を正確に制御することができ、（VI）培地の非常に少量（1 ml）を各実験について必要とされます。 最近では、微小流体流動システムは、様々な微小環境14,15,16の下で細菌細胞の挙動を調査するために採用されています。接着性およびE.の表面付着大腸菌 15、X. fastidiosa 16、およびアシドボラックスは、ガラス表面への14の微小流体チャンバーを用いて評価したcitrulli。 アシドボラックスcitrulliのIV型線毛によって媒介凝集し、バイオフィルムの形成は、14を分析しました。 A.のさらに、運動流Cの下で観察citrullionditionsは、IV型線毛は、Aの植民地化と普及に重要な役割を果たしていることを実証しました樹液流条件下での木部船でcitrulli。 緑膿菌およびXのけいれんの運動能fastidiosa細胞が正常に微細加工フローチャンバー5,6,17内の流体流れに逆らって観察しました。 IV型線毛は、XのpilBとpilQ変異体を欠損しましたfastidiosaは深く微小流体デバイス5,6,18における流動条件でけいれん運動の速度を変更することが見出されました。微小流体デバイスにおける細菌の接着および運動性について行った研究は、微小流体チャンバが、インビトロで線毛媒介細菌の単収縮運動性および遊走を分析するのに特に適していることが示されました。これらの結果は、内の細胞 - 細胞付着、凝集・定着を促進するけいれん媒介移行メカニズムを説明しますホストは、最終的には全身感染につながります。 XのPIL-のCHPオペロンfastidiosaは、エンコード信号の伝達が20を経路pilG、線毛、pilJ、ピル、chpBとchpCが含まれています 。膜貫通化学受容体は、ペリプラズムドメイン内の化学的刺激を結合して、最終的には細菌のけいれんの運動性を制御するために、それらの細胞質部分のシグナル伝達カスケードを活性化します。 Xのピル-のCHPオペロン中fastidiosa、ホスホシャトルタンパク質PilGはチェイに相同体です。 E.でcoliおよびP.緑膿菌、崔はべん毛モータータンパク質19、21と相互作用する走化性システムのレスポンスレギュレーターです。 Xの病原性に向けてピル-のCHPオペロンの貢献が、 fastidiosaは 、最近20の環境シグナルへとX.の規制/モータIV型線毛に応答した走化性オペロン中pilGの役割を調べましたfastidiosaは、UNCでありますリア。 Xの攣縮運動の活動に走化性レギュレータpilGの洞察を解明するために、 fastidiosa、微小流体チャンバーはXのけいれんの運動性を評価するために使用されますfastidiosa。 X.のfastidiosaのpilGは、 欠失変異体 のXfΔpliG、補完的な歪みXfΔpliG-Cおよびin vitroでその野生型の表現型を比較することを特徴としています。結果は、Xのけいれん運動中pilGの役割を強調表示しますfastidiosa。

<table><tbody><tr><td>Biology materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</td></tr><tr><td>pilG 欠失変異体 Xf&Delta;pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., et al., 2007 26</sup</td></tr><tr><td>>pilG 相補的株 Xf&Delta;pliG-C&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., et al. 1998 23</td></tr><tr><td>Physical materials and equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable inoculating loops</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>細菌収集などの定量的手順</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 シリコーン エラストマー キット</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 デジタル カメラ</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>画像、ビデオ録画、測定&nbsp;</td></tr><tr><td>チューブライン</td><td>エッジウッド、ニューヨーク</td><td></td> #T4300 <td>シリンジとマイクロ流体チャンバーに接続</td></tr><tr><td>プラスチックルアーコネクタ</td><td>エッジウッド、ニューヨーク</td><td></td><td>シリンジとマイクロ流体チャンバーに接続</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>ポンプの運転中に流量を調整できます。</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV#</td><td>1005</td><td>流れるブロスを提供</td></tr><tr><td>倒立オリンパス IMT-2 顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>画像観察と記録</td></tr><tr><td>SPOT-RT デジタルカメラ</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>画像、ビデオ録画、測定</td></tr><tr><td>顕微鏡シャッター</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>コントロールカメラ」露光時間</td></tr><tr><td>顕微鏡シャッター制御システム</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 シングルチャンネル CE/UL/CSA 承認済み シャッタードライバー</td></tr><tr><td>MetaMorph Image software</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Real-time super-resolution image processing&nbsp;</td></tr></tbody></table>

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; pilg</em&gt;で<em&gt; xylella fastidiosa</em

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylellaのfastidiosaは、植物の経済的に重要な多くの疾患の原因となるグラム陰性非鞭 ​​毛細菌です。けいれん運動性は、Xを提供しますXの病原性に寄与する、長距離イントラ植物の動きと植民地化のための手段をfastidiosa fastidiosa。X.のけいれん運動fastidiosaは、IV型線毛によって運営されています。 XylellaのfastidiosaのIV型線毛はpilG、シグナル伝達経路に関与しているピル-Chpのオペロンをコードするタンパク質における走化性の調節因子によって調節されています。 Xの攣縮運動にpilGの役割を解明するために、 fastidiosa、pilG欠損変異体のXfΔpilGとネイティブpilGを含むその相補株XfΔpilG-Cを開発しました。タイムラプス画像記録システムと統合マイクロ流体チャンバはXfΔpに痙攣運動を観察するために使用されましたILG、XfΔpilG-Cおよびその野生型株。 この記録システムを使用して、長期の空間的および時間的な凝集の観察結果、個々の細胞および単収縮運動を介して細菌の集団の移動を可能にする。X.変異XfΔpliGがけいれん欠損表現型を示し、一方fastidiosa野生型および相補XfΔpilG-C株は、直接的にマイクロ流体フローチャンバーにおいて観察された典型的な単収縮運動の特性を示しました。この研究は、pilGは Xのけいれん運動性に寄与することを実証していますfastidiosa。マイクロ流体フローチャンバーは、単収縮運動性を観察するための手段として使用されます。

IV型線毛によって媒介される単収縮運動を示す周辺コロニー縞の存在は、Xのコロニーが観察されましたfastidiosa野生型および相補性のXfΔpliG-C株（ 図1）。ミュータントXfΔpliGは 、しかし、コロニーの周囲（ 図1）の周りにフリンジを示しませんでした。ナノマイクロ流体フローチャンバー内の細菌細胞のタイムラプスイメージングは、けいれん運動性は、両方の野生型X.で観察されたことを明らかにしましたfastidiosa相補XfΔpliG-C（補足V1、V3）、XfΔpilG変異細胞は、実験（補足V2）を通して運動性をけいれん示さなかったのに対し。変異XfΔpilGの細胞は、PD2ブロス（補足V2）に比較的小さな緩い凝集体を形成しました。 Xのとは対照的に、細胞fastidiosa野生...

本研究では、ナノマイクロ流体フローチャンバーは、視覚化し、機能的にXylella fastidiosa、グレイプバインのピアース病を引き起こす細菌の単収縮運動を特徴づけるために使用しました。

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

このプロトコルの目的は、タイムラプス画像記録システムを統合したナノマイクロ流体フローチャンバーを用いて、細菌のツイッチング運動に関与する遺伝子の機能を特性解析することです。この手法は、細菌のツイッチング運動など、細菌の表現型および関連する遺伝子機能に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、個々の細胞および集団の凝集移行を、特異的かつ制御された条件下で観察できることです。この手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるXiangyang Shi博士が行います。標準的な欠損戦略を用いて、Temecula野生型Xylella fastidiosa、pilG欠損変異株、および相補株をすべてPD2培地寒天プレート上で培養します。細菌を28°Cでインキュベートします。

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

プリオン様のタンパク質凝集体の伝播は、最近、多くの神経変性疾患に関与していることが明らかになりました。このプロトコルの目標は、線虫C.エレガンスをモデルシステムとして使用して、タンパク質の拡散を監視し、プリオン様現象を調査する方法を説明することです。...

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。...

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

タイプIIIの分泌システムを介した宿主細胞へのエフェクターの転座は、グラム陰性菌の間で一般的な病原性戦略です。転座の定量分析のために、β-ラクタマーゼエフェクター融合ベースのアッセイを適用しました。エルシニア感染細胞では、ベータラクタマーゼによるFRETレポーターの変換をレーザー走査型顕微鏡を用いてモニターします。...

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

最近の発見は、細菌のべん毛モーターがさまざまな環境信号を感知し、それに応じて改造することを示唆しています。ここで議論されているビーズアッセイは、環境ストレス要因に対する細胞適応におけるリモデリングの役割を説明するのに役立つと期待されています。...

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

このプロトコルでは透明なゼブラフィッシュ幼虫に蛍光に分類されたt.

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

細菌細胞は空間的非常に組織されます。遅い成長Myxococcus...

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

このプロトコルは、緑膿菌のさまざまなタイプの運動に関与する遺伝的要因を特定するための迅速かつ効率的な方法を提供します。...

緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

学ぶナノマイクロ流体フローチャンバーを用いたXylella fastidiosaの攣縮運動の可視化と機能解析。この方法により、細菌の運動性と病原性の関係を詳細に観察し、ブドウのピアス病対策に寄与する知見が得られます。

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

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