Name: 代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶマウスBcrp1の代替プロモーター検出と転写調節解析。インシリコ解析とルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、組織特異的な遺伝子発現制御メカニズムを解明する方法です。

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マウスESTデータベースのBLAST解析を用いたBcrp1の代替第一エキソンのインシリコ予測では 1 注：このプロトコルは、自分を確認するためにゲノム配列に一致するEST配列を整列する方法を次にBcrp1の2エクソン配列類似性とのESTのためのマウス発現配列タグ（EST）データベースを検索する方法を説明します（翻訳開始部位を含む）と、 Bcrp1エクソン2の5 &#39;末端にマウスBcrp1遺伝子相対的な位置。 <ol><li> Ensemblのゲノムブラウザ17の検索窓へのmRNA参照配列のID（NM_011920.3）を入力することにより、マウスのBcrp1エクソン2のシーケンスを取得し、をクリックして「GO。」次の画面で、完全長配列（16エクソンが含まれている）を選択します。 <ol><li>次の画面（「トランスクリプトベースの表示」）では、「16エキソン」を選択します。これは、Bcrp1のすべてのエクソンの配列を含む画面が表示されます。 Bcrp1のエクソン2は、5」をお読みます9;。-AAAGGC ... TATCAA-3 &#39;」は、得られた結果は、参照18に示したものと同様となります。 </li><li> 「ダウンロードシーケンス」オプションをクリックします。次の画面では、FASTA形式を選択して、[]をクリックし、「プレビュー」。次の画面で、クリップボードにエクソン2のプレビューシーケンスをコピーします。 </li></ol></li><li>国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイト20上のBLASTのホームページ19に移動します。 <ol><li> 「マウス」ゲノムを選択します。クエリボックスに、クリップボードからエクソン2配列を貼り付けます。 </li><li>データベースのドロップダウンから &quot;のEST」を選択し、最適化「高度に類似した配列、&quot;とし、選択した「BLAST」を実行時間は数分かかります。 BLASTの実行が完了すると、「結果」ページが表示されます。 </li><li> 「結果」ページの「説明」小見出しの下で、「ALL、 &quot;その後&quot;ダウンロード、 &quot;その後&quot; FASTA（完全を選択「ドロップダウンリストで、次に選択し、「シーケンス）続行 &quot;.txtファイルが表示されます;。オープンでクリップボードにファイル全体をコピーする.txtファイルは、マウスBcrp1のエクソン2と高い配列類似性を有するすべてのESTの配列を含みます。しかしないBcrp1遺伝子にエクソン2に関連してそれらの位置。 注：2015年4月15日に行われた分析は、Bcrp1エクソン2と整合し、これらを表1に記載されている14マウスのESTを同定しました。 </li></ol></li><li> Bcrp1遺伝子に2エキソンの5 &#39;であるEST配列の位置を特定します。マウスBcrp1遺伝子は染色体6コンティグNC_000072.6（：372099104 GI）に位置しています。 <ol><li> 「専門ブラスト」小見出しBLASTのホームページでは、選択して &quot;BLAST（bl2seq）を使用して、2つ（またはそれ以上）の配列を整列させます。」 </li><li>クエリボックスにクリップボードからテキストフ​​ァイルを貼り付けて、対象配列ボックスに372099104を入力します。プログラムの下で、「非常に類似した配列 &quot;のために最適化選択、および実行BLAST。 </li><li>結果ウィンドウが表示されたら、「線形」ウィンドウで、「グラフィックス」をクリックしてグラフィカルにアライメントを表示します。左右の矢印を使用し、Bcrp1 / ABCG2との配列アラインメントに集中するズーム。 </li><li>配列アラインメントを保存：「説明」ボックスに「ALL」を選択し、「ダウンロード」のドロップダウンの下で」、表（CSV）をヒット &quot;を選択し、をクリックして「続けます」。このファイルには、Bcrp1エクソン2の配列アラインメントおよびマウス染色体6コンティグにおけるヌクレオチドの番号に対する相対Bcrp1 EXON2に配列類似性を有するすべてのEST配列のアラインメントが含まれています。各完全なEST配列は、Bcrp1エクソン2と重複する配列を含む2のエキソン領域5 &#39;および3&#39;にまたがる複数のアラインメントを生成することがあります。 </li><li>エクソン2の5 &#39;末端の位置は第6染色体コンティグに58655638をヌクレオチド配列に対応するように、としてこれを指定しますその後、1、および58655638に各ESTの5 &#39;の部分配列の位置を計算します。 14のESTの結果を表1に示します。 注：潜在的な最初のエクソンとして（ すなわち 、負の塩基値を持つ）1の5 &#39;にあるEST配列を解析するように注意してください。例えば、 表1（AI647825及びAI664571）に示すBcrp1エクソン2と整合ESTの二つに残りの配列は、エクソン2には&#39;3でした。 </li></ol></li></ol> 2.評価Bcrp1の代替プロモーター機能<ol><li> レポーターのデザインはBcrp1 E1U、E1A、E1BとE1C促進のために構築します <ol><li> ESTデータベースの検索から得られたE1Uの配列を用いて、+1としてE1Uの最初の5 &#39;ヌクレオチドを​​指します。 </li><li>細菌人工染色体（BAC）の上流Bcrp1 / ABCG2遺伝子配列との配列を少なくとも100キロバイト含まれているマウス染色体6のクローンを得ますBcrp1 / ABCG2遺伝子（材料および機器のリストを参照してください）​​。 <ol><li>このようなルシフェラーゼレポータープラスミドをpGL3-Basicのような適切なレポーターベクターを特定します。 </li><li>レポーターベクター中の複数のクローニング部位を決定します。 KpnI、SacIで、Mlu1、NheI部位をSmaI、XhoIを、BglIIおよびHindIIIでは、5 &#39;から3&#39;方向のpGL3-Basicベクターのマルチクローニングサイト内の制限エンドヌクレアーゼ部位です。 注：消化部位の配列は、制限酵素を生産する企業の商品カタログから入手可能です。 </li><li>このようなDNA5などのソフトウェアプログラムを使用してE1UエクソンとE1Uの2キロバイトの5 &#39;領域内のすべての消化部位を特定します。 E1Uまたは2キロバイト上流地域で発見されていないのpGL3-Basicのマルチクローニングサイト内の少なくとも2つの消化部位を特定します。 注意：そのインサート・ウィルを保証するために、逆方向プライマーのために選択された1の上流にあるフォワードプライマーのためのマルチクローニングサイトの制限部位を選択してくださいlは適切な方向にあります。 </li></ol></li><li>前方に準備し、（材料および装置のリストを参照してください）​​商業遺伝子/プライマー合成サービスまたはプライマーの選択ソフトウェアを使用して、選択したpGL3-基本的なマルチクローニングサイトの制限エンドヌクレアーゼ部位のための配列を含むPCR用リバースプライマー。 E1UシーケンスとE1U配列内リバースプライマーから〜2キロバイト上流に位置するフォワードプライマーを選択します。著者で使用されるプライマー「前作はフォワードプライマーでSacI部位、およびリバースプライマーでNheI部位を組み込み、最初の5と64に約-1906からゲノム領域を増幅した」として指定されたE1Uのヌクレオチド+ 1（上記ステップ2.1.1を参照）、および参照16に設けられています。 <ol><li> PCRは0.01 BACμgの1に、これらのプライマーを用いてE1Uゲノム領域を増幅し、PCRマスターミックスはで変性した高忠実度のTaqポリメラーゼを（材料および機器のリストを参照してください）を含みます使用したプライマーの融解特性に基づいて、30秒間95℃、その後35〜40 72℃（2分）での伸長によるPCRのサイクル、アニーリングおよび融解温度。 注：高忠実度Taqポリメラーゼの使用は、高いGC含量を有する配列決定プロモーター領域のために不可欠です。そのようなテンプレートとしてBACとして大きなゲノムDNA断片を用いる場合には、ゲノムDNAの二次構造は、それが困難なPCRプライマーが結合するために作ることができます。この問題が発生した場合、長いゲノムDNA鋳型は、PCR反応の前に超音波処理することによって穏やかに剪断された場合に、より良好なPCR結果を得ることができます。 </li><li> 0.8％TAEアガロースゲル電気泳動を使用して、1kbのDNAラダーと比較することにより、増幅されたPCR産物の長さを確認します。 </li></ol></li><li>得られたPCR産物とのpGL3-Basicベクターを消化、制限を使用すると、前方に導入された制限消化部位に対して特異的なエンドヌクレアーゼおよびインごとにリバースプライマー制限消化酵素で供給tructions。 <ol><li>キットのプロトコール21以下、（材料および機器のリストを参照してください）商業SVジェルを使用して消化反応やPCRクリーンアップシステムキットを精製します。 <ol><li>アガロースゲル電気泳動を使用して未切断ベクターに対してそれを比較することにより、ベクターの消化および線形化を確認し、その後切断し、消化したベクターDNAバンドを精製します。 （材料および機器のリストを参照してください）​​精製したPCR産物およびUV分析法を用いて精製したベクターの濃度を測定します。 </li></ol></li></ol></li><li>精製し、制限酵素を連結することによりE1Uレポーター構築物を準備したPCR産物とのpGL3-Basicのホタルルシフェラーゼレポーターベクター消化（レポーターアッセイキットに含まれているが、材料および装置のリストを参照してください）​​インサートで：11、21および31のベクトル比を、これによりE1U rを生成し、キットの指示書22に従って「T4 DNAリガーゼ迅速ライゲーションキット」を用いてpGL3-E1Uという名前eporter構築物。 <ol><li> （材料および機器のリストを参照してください）​​クローンTAクローニングキットの指示に従ってたpGL3-E1Uを展開する細菌を形質転換するためのpGL3-E1Uプラスミドを使用してください。 </li><li>配列分析により、インサートの向きと忠実度を確認してください。 </li></ol></li><li>記者がE1U用と同様の方法論を用いてE1A、E1BとE1Cのために構築する準備をします。セクション2.1.5.2のように配列決定によるインサートの忠実度を確認してください。 注：E1Aのプロモーターの挿入は、E1BとE1Cは、約-1875 / + 10、-1847 / + 60、およびE1A、E1Bの（1として指定された）最初の5 &#39;ヌクレオチドへ-1904 / + 83の相対的でなければなりませんまたはそれぞれE1C、。 </li></ol></li><li> レポーターアッセイ法 注：レポーターアッセイの一般的な戦略：遺伝子の推定プロモーター（5 &#39;上流領域）」reporteが含まれている空の「レポーター」、ベクターのマルチクローニングサイトに挿入され、多重クローニング部位の下流R遺伝子」（ 例えば 、ホタルルシフェラーゼ）。ベクターは、次いで、目的の遺伝子を発現する真核細胞にトランスフェクトされる。活性化する必要があり、これらの細胞中の目的の遺伝子の発現を促進するトランス作用因子トランスフェクトされたレポーターベクター中のプロモーター、容易に発光アッセイを用いて定量することができるホタルルシフェラーゼの発現を引き起こします。 <ol><li>レポーターアッセイのために使用する適切な細胞株を選択します。 注：E1U代替プロモーターレポーター構築物の活性を評価するために、それがE1Uプロモーターの制御下にBcrp1発現する細胞への構築物トランスフェクトすることが必要です。 TM4マウスのセルトリ細胞株は、（材料および機器のリストを参照してください）Bcrp1タンパク質とBcrp1のmRNA E1Uを含むだけでなく、E1A、E1B、およびE1C 5を表現します 。陰性対照として、Bcrp1タンパク質またはmRNAを発現しない細胞株を使用することを検討してください。 </li><li> TM4 CEの文化1で200,000細胞/ウェルの初期密度で24ウェルプレート中でLLS：1ハムF12培地の混合物1.2グラム/ Lの重炭酸ナトリウムとのダルベッコ改変イーグル培地、15mMのHEPESは、5％のウマ血清を2.5％補充し​​ました以前5に記載のように、37°C、5％CO 2で、ウシ胎児血清、ペニシリン（100 IU / mlで）、およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）、。 </li><li>六時間培養中の細胞を配置した後、空のpGL3-basicベクター0.2μgの持つまたは-1906 / + 64 E1Uまたは-1875 / + 10 E1Aまたは-1847 / + 60 E1Bを含むのpGL3ベクター0.2μgので細胞をトランスフェクトまたは-1904 / + 83 E1C BCRP 1削除は、市販のDNAトランスフェクションキット及び製造業者のプロトコル23を使用して、内部対照としてのpRL-TK（ ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター）の4 ngのと一緒に構築（材料および機器のリストを参照してください） 。 </li><li>トランスフェクションの30時間、culturから増殖培地を除去edは、細胞をトランスフェクトしました。 200μlのPBSで細胞を1回洗浄し、洗浄液を除去します。 <ol><li>ホタル測定し、 ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコール24に従って市販のキットを使用して。 </li></ol></li><li>内部（ ウミシイタケルシフェラーゼ）の制御によって分割ホタルルシフェラーゼ活性の比として、各チューブのための活性を発現。全体的な結果は、通常、1の値が与えられ、空のpGL3ベーシックベクターでトランスフェクトした細胞のそれに各レポーター構築物の相対活性として表現さ​​れます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+transcriptional+modulation%3A+large-scale+identification+and+characterization+of+putative+alternative+promoters+of+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes.</a> Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Doyle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidrug+resistance+transporter+from+human+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).</li>
<li>Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+breast+cancer+resistance+protein+%28BCRP%2FABCG2%29+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance.</a> Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).</li>
<li>Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+resistance+protein+%28Bcrp%29+and+the+testis--an+unexpected+turn+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events.</a> Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcrp1+transcription+in+mouse+testis+is+controlled+by+a+promoter+upstream+of+a+novel+first+exon+%28E1U%29+regulated+by+steroidogenic+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).</li>
<li>Maliepaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+distribution+of+the+breast+cancer+resistance+protein+transporter+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues.</a> Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).</li>
<li>Fetsch, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+ABCG2+mitoxantrone+resistance-associated+protein+in+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues.</a> Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+breast+cancer+resistance+protein+in+microvessel+endothelium+of+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain.</a> Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).</li>
<li>Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+ABCB1+and+ABCG2+in+human+placental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue.</a> Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).</li>
<li>Xiong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2+is+upregulated+in+Alzheimer%27s+brain+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+may+act+as+a+gatekeeper+at+the+blood-brain+barrier+for+Abeta%281-40%29+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides.</a> J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).</li>
<li>Woodward, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+urate+transporter%2C+ABCG2%2C+with+a+common+functional+polymorphism+causing+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).</li>
<li>Huls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+resistance+protein+transporter+ABCG2+is+expressed+in+the+human+kidney+proximal+tubule+apical+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane.</a> Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+5%27+untranslated+region+variants+of+BCRP+mRNA+are+differentially+expressed+in+drug-selected+cancer+cells+and+in+normal+human+tissues%3A+implications+for+drug+resistance%2C+tissue-specific+expression%2C+and+alternative+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage.</a> Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).</li>
<li>Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+alternative+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by alternative promoters.</a> FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).</li>
<li>Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mouse+Abcg2+mRNA+during+hematopoiesis+is+regulated+by+alternative+use+of+multiple+leader+exons+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).</li>
<li>Natarajan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+major+alternative+promoter+regulating+Bcrp1%2FAbcg2+expression+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine.</a> Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).</li>
<li>Ensembl Genome Browser. , 
 <a target="_blank" href="http://Ensembl.org">http://Ensembl.org</a> (2015).</li>
<li>Transcript-based Display from Ensembl. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822">http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822</a> (2015).</li>
<li>Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , 
 <a target="_blank" href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome</a> (2015).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information (NCBI). , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov">http://www.ncbi.nlm.nih.gov</a> (2015).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wizard%C2%AE+SV+Gel+and+PCR+Clean-Up+System+-+INSTRUCTIONS+FOR+USE+OF+PRODUCT%22">Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT</a>. , (2009).</li>
<li>New_England_Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Ligation+Kit+Protocol+-+M2200S%22">Quick Ligation Kit Protocol - M2200S</a>. , (2014).</li>
<li>Roche. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XtremeGENE+HP+DNA+Transfection+Reagent+Protocol+-+Manual+version+1.0%29%22">XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0)</a>. , (2010).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Protocol+for+the+use+of+the+Dual-Luciferase+Reporter+Assay%22">Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay</a>. , (2009).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>VanBuren, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+verification%2C+and+initial+annotation+of+the+NIA+mouse+7.4K+cDNA+clone+set%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set.</a> Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).</li>
<li>Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+subtraction%3A+two+approaches+to+facilitate+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery.</a> Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+mouse+transcriptome+based+on+functional+annotation+of+60%2C770+full-length+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs.</a> Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).</li>
<li>Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+controls%3A+the+role+of+alternative+promoters+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes.</a> Trends Genet. (11), 640-648 (2009).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
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ダグラスD.ロスとメリーランド大学、ボルチモアは、人間のBCRPに特許権を保持します。

提示された方法および代表的な結果の大部分は2013年5に出版された「マウス精巣におけるB CRP1の転写は上流のステロイド合成因子-1によって調節される新規の第一エキソン（E1U）、のプロモーターによって制御されている」と題された前作に記載されていますここで示されている代表的な結果に加えて、前の紙は、5&#39;-RACE PCRおよびRT-PCR法を用いた代替的な第一エクソンの利用の推定値を提供しました。また、上流E1Uからのプロモーターにおける推定SF-1応答エレメントのインシリコ識別が達成された、とクロマチン免疫沈降（チップ）アッセイは、SF-1が推定されるSF-1応答エレメントに結合することを実証しました。機能的研究は、マウスのセルトリ細胞において、BCRP 1転写がE1UプロモーターにおけるSF-1応答エレメントを介して、SF-1によって制御されることを明らかにしました。これらの機能の研究は、TRAによりTM4細胞におけるSF-1のアップレギュレーションを含まnsfectionまたはBCRP <em...

もっとヒト遺伝子の半分以上が、代替プロモーター1により調節されます。各代替プロモーターは、他の代替的なプロモーターのものと異なっていてもよい調節要素を含むことができます。つの組織に利用されるプロモーター（複数可）は、別の組織で使用されるものと異なってもよいです。例えば、所定のシグナル伝達経路の活性化はつの組織において利用遺伝子のための代替のプロモーターを誘発する、まだに影響を及ぼさない、または別の組織に利用されるのと同じ遺伝子についての別個の代替プロモーターを抑制することができる可能性があります。 Bcrp1遺伝子の発現は、別のプロモーターにより支配されます。 Bcrp1は、ヒト乳癌耐性タンパク質（BCRP）遺伝子のマウスオルソログです。 BCRPは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、正式に指定さABCG2 2、3です。頂端細胞膜タンパク質として、BCRP / Bcrp1機能は、天然および生体異物基質の広範囲を流出します<suP&gt; 3、4。 12 -ヒトとマウスでは、BCRP / Bcrp1は非常に、肝臓（毛細胆管）、腸、および腎臓、ならびに胎盤、脳や精巣2などの血液-組織障壁を持つ器官、5などの薬理学的に関連する器官で発現しています。がん幹細胞を含む造血細胞および他の幹細胞におけるBCRP / Bcrp1の発現は、生体異物および癌化学療法薬3に、これらの細胞の耐性を付与することができます。 初期の研究では、正常および新生物細胞におけるBCRP発現の調節を理解するために、BCRP mRNAの5 &#39;cDNA末端の迅速増幅（5&#39;-RACE）分析は、その正確な転写開始部位13を決定しました。だけでなく、見られる複数の転写開始部位がありました。また、BCRPで未翻訳である第一エクソン、の3つの代替の形態があったが発生しました。これらの代替最初のエクソン - 指定のE1a、E1bを、E1Cは - 人間の種々の組織において異なって発現させました。二つの追加の第1エクソン変異体は、BCRP 13の第2エクソンを用いてヒトESTデータベースのBLAST検索で発見されました。 4試合は、上流E1uと命名したエクソン2から第一エキソン&gt; 70キロバイトを明らかにしました。 4その他の試合ではE1- 13と命名した完全に第一エクソンを欠いていたBCRPのmRNAを、明らかにしました。 代替リーダーエクソンの存在は、代替的なプロモーターの使用14の現れであると考えられます。 マウスでは、Bcrp1の4代替最初のエキソンは異なるマウス組織におけるBCRP 1転写を支配する代替プロモーターに対応することができることが記載されています。これらのエキソン/プロモーターはE1U、E1A、E1BとE1Cを指定し、約70、58、15、および上流Bcrp1エクソン2 5、15から5キロバイトに位置しています。 E1A mRNAのアイソフォームはムリンで支配的であることが見出されましたE E1Bアイソフォームは、骨髄5、15マウス腸、胎児肝臓細胞、および赤血球前駆細胞において発現されたのに対し、造血幹細胞、心臓、肺、脾臓、および脳。上流E1Bからのプロモーターが、ホスホサイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質（P-CREB）とその代替に固有のCREB応答要素によって、少なくとも部分的に調節、マウス腸内Bcrp1転写を支配する主要な代替プロモーターであることが示されましたBcrp1プロモーター16。 E1CのmRNAアイソフォームは主として成体マウスの肝臓および腎臓5で表されます。 E1Uアイソフォームは、それが優勢なアイソフォームは5発現しているマウスの精巣を除き、試験したほとんどの組織では検出不能です。 （それは後期精子細胞4を保護することができる輸精内皮、中）体細胞（内皮タイトジャンクション、管周囲筋様細胞、およびセルトリ細胞）と生殖細胞の両方で発見されたBcrp1は、ラットの精巣で発現しました。 REGイオンは、上流E1Uからステロイド合成因子1（SF-1）5のための機能的応答要素が含まれています。 Bcrp1 mRNAおよびタンパク質は、著しくマウスセルトリ細胞におけるBcrp1発現はSF-1 5によって制御されることを示唆し、セルトリ細胞特異的SF-1ノックアウトマウスの精巣で低減されます。 プロトコルは、インシリコ Bcrp1の代替最初のエクソンを検出し、識別された代替最初のエクソンから上流の推定プロモーターのためのルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立するために、詳細な方法を提示しました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kit</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR kit</td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>このキットには、TOP10 化学的にコンピテントな E. coli 細菌が含まれています。</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼクイックライゲーションキット</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart高忠実度Taq-DNAポリメラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>ハイフィデリティのTaqポリメラーゼ酵素ブレンドを配合</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬</td><td>ロシュ</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット</td><td>プロメガ</td><td>E1910</td><td>pGL3-basicエンプティレポーターベクター(ホタルルシフェラーゼ)、pRLTKレニラルシフェラーゼ発現ベクター、その他のコントロールベクターが含まれています。</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td>プラス<td>ミドminiprepのために-細菌のコロニーpCR2.1ベクトルからのプラスミドDNAの分離そして浄化</td></tr><tr><td></td><td>TOPO TAのクローニングキット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のpGL3塩基性ルシフェラーゼを含んでいるベクトル</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renillaのルシフェラーゼ</td>はベクトル<td>Promega</td><td>E2241</td><td></td>を発現</tr>する<tr><td>細菌の人工的な染色体</td><td>BACPACリソースセンター、子供S Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 and RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg;SVゲル&PCRクリーンアップシステム&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>制限エンドヌクレアーゼによる消化後のPCR産物の精製に有用</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Ensembl project</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Ensemblプロジェクトは、脊椎動物やその他の真核生物のゲノムデータベースを作成し、この情報をオンラインで自由に利用できるようにしています。</td></tr><tr><td>ブラストソフト</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= ウェブ&PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 ソフトウェア</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI ヌクレオチドデータベース</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</strong</td></tr><tr><td>>TM4 murine Sertoli cells</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>これは比較的安価な手動操作のルミノメーターです。自動化システムは、96ウェルプレートを使用する同じメーカーからも入手できます。</td></tr><tr><td>NanoDrop分光測色計</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>NanoDrop 2000</td>分光<td>光度計は、非常に少量のサンプル</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS分光光度計と核酸分析IIソフトウェア</td><td>BeckmanCoulter Inc、Fullerton、CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr>を使用することができます</tbody></table>

代替プロモーターの使用およびマウスbcrp1の転写調節を発見する方法

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

通常非翻訳 - - 第一のエキソンの異なる組織における遺伝子発現は、しばしば、ユニークでmRNAの合成をもたらす代替的なプロモーターによって制御されます。 E1U、E1A、E1B、およびE1C：Bcrp1（ABCG2）、ABCトランスポーター乳癌耐性タンパク質（BCRP、ABCG2）のマウスオルソログは、生産対応する4つの代替最初のエクソンによって指定された少なくとも4つの代替のプロモーターを持っています。本明細書において、 インシリコプロトコルはBcrp1ための別のプロモーターの使用を予測するために提示されています。さらに、レポーターアッセイ法は、代替プロモーターのためのレポーター構築物を生成するために上流に同定されている代替の第一エキソンの推定プロモーターの機能性を決定するために記載されています。

リーダーエクソンの分析によって、マウス精巣における BCRP 1 代替プロモーターの使用率 の同定 NCBIでのESTデータベースは、議定書1に記載されている手順を使用して（2015年4月）をプローブしたときに、ESTは、ゲノム内での位置と一緒に、1 mRNAは、表1に示されているBCRPにおけるエクソン2の5 &#39;末端に隣接していたことがわかっBCRP 1 mRNA中に2エキソンに隣接しているC57BL / 6Jマウス精巣由来のエクソン2つのESTの開始までのDNAの相対E1U（ 表1）に対応する、70キロバイト上流エクソン2からのゲノ...

例として、マウスABCトランスポーターBcrp1（ABCG2）を用いて、 イン・シリコプロトコルは、マウス組織において発現される遺伝子に代替プロモーターの使用を検出するために、レポーターアッセイを用いて同定された代替的なプロモーターの機能性を評価するために提示されています。

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

この一連のプロトコルの全体的な目標は、Bcrp1などの遺伝子のmRNA中の代替的な第1エクソンを検出し、代替的に同定された第1エクソンの上流の推定プロモーターに対するルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを確立することです。使用されるインシリコ法は、さまざまな組織でmRNA発現がどのように制御されているかなど、転写および制御分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、公開されている遺伝データを使用して、目的の遺伝子のmRNA中の代替的な最初のエクソンを同定することであり、これは代替のプロモーターの使用を意味します。レポートコンストラクトを調製し、レポーターアッセイを実施するこの方法は、推定される代替プロモーターの機能活性など、遺伝子調節分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を開始するには、mRNA参照配列IDをEnsemblゲノムブラウザの検索ウィンドウに入力してマウスBcrp1エクソン2の配列を取得し、[Go]をクリックします。次に、16個のエクソンを含む完全長配列を選択します。「Download sequence」オプションをクリックします。次に、FASTA形式を選択し、[プレビュー]をクリックします。次の画面で、エクソン2のプレビューシーケンスをクリップボードにコピーします。NCBIのWebサイトのブラストホームページに移動します。[マウスゲノム] を選択します。クリップボードからエクソン 2 配列をクエリボックスに貼り付けます。その後、[データベース]ドロップダウンから[ESTs]を選択します。類似性の高いシーケンスに最適化し、BLASTを選択します。BLAST の実行が完了すると、結果ページが表示されます。結果ページの [説明] 小見出しの下で、[すべて]、[ダウンロード]、[FASTA] の順に選択して、ドロップダウンで [続行] を選択します。txtファイルが表示されます。ファイル全体を開いてクリップボードにコピーします。Bcrp1遺伝子の5プライムからエクソン2のEST配列の位置を特定するには、BLASTホームページのSpecialized BLAST小見出しで、Align two sequences using BLASTを選択します。クリップボードのテキストファイルをクエリボックスに貼り付け、[Subject Sequence] ボックスに「372099104」と入力します。Program SelectionでHighly similar sequencesに最適化し、BLASTを実行します。結果ウィンドウが表示されたら、[Alignments] ウィンドウの [Graphics] をクリックして、整列をグラフィカルに表示します。右矢印と左矢印を使用し、ズームして、Bcrp1/ABCG2 とシーケンスのアラインメントに焦点を合わせます。次に、[説明] ボックスで [すべて] を選択して、シーケンスのアラインメントを保存します。[ダウンロード] ドロップダウンで [ヒット テーブル] を選択し、[続行] をクリックします。エクソン2の5プライム末端の位置は、染色体6コンティグのヌクレオチド58、655、638に対応するので、これをプラス1と指定し、次いで、各ESTファイブプライムの部分配列の位置を58、655、638に計算する。この手順の重要なステップは、複数のファーストエクソンの予測です。したがって、代替プロモーターはここで特定されます。ESTデータベースから取得したE1Uの配列を使用して、E1Uの最初の5つのプライムヌクレオチドをプラス1として指定します。Bcrp1/ABCG2遺伝子配列と、Bcrp1/ABCG2遺伝子の少なくとも100キロベースの上流にある配列を含むマウス染色体の6番染色体のバッククローンを取得します。次に、ルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3-Basicなどの適切なレポーターベクターを同定します。レポーターベクター中の複数のクローニング部位を同定します。KpnI、SacI、MluI、NheI、SmaI、XhoI、BglII、およびHindIIIは、pGL3-Basicベクターのマルチクローニング部位における5プライムから3プライムへの配向における制限エンドヌクレア部位です。次に、E1Uエクソンの上流にある2キロベース領域を選択し、その配列をDNA5に貼り付けてから、プログラムを実行します。単一および複数の消化部位の詳細が表示されます。その後、E1U領域の消化部位のリストを、ExcelシートのpGL3-BasicベクターのMCSと比較します。その後、市販の遺伝子プライマー合成サービスまたはプライマー選択ソフトウェアを使用して、制限エンド核部位を含むPCR用のフォワードプライマーとリバースプライマーを調製します。E1U配列の約2キロベース上流に位置するフォワードプライマーと、E1U配列内のリバースプライマーを選択します。次に、これらのプライマーとPCR 01を使用して、1 μgのBakおよび高忠実度taqポリメラーゼを含むPCR Master MixにE1Uゲノム領域を増幅します。その後、0.8%TAEアガロースゲル電気泳動を用いて、増幅したPCR産物を1キロ塩基のDNAラダーと比較することにより、増幅されたPCR産物の長さを確認します。その後、得られたPCR産物とpGL3-Basicベクターを、フォワードプライマーとリバースプライマーに導入された制限酵素消化部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化します。次に、アガロースゲル電気泳動を使用してPCR産物の消化を確認します。アガロースゲルから消化したベクターDNAと2キロベースPCRバンドを切断します。次に、市販のSVゲルおよびPCRクリーンアップシステムキットを使用して、消化したベクターDNAと2キロベースPCRバンドをゲルスライスから抽出します。精製されたPCR産物と精製されたベクターの濃度をUV分光法を用いて測定します。続いて、精製された制限酵素消化されたPCR産物とpGL3-塩基性ホタルルシフェラーゼレポーターベクターをT4 DNAリガーゼクイックライゲーションキットを用いてライゲーションすることにより、E1Uレポーターコンストラクトを調製し、それによりpGL3 E1Uと名付けられたE1Uレポーターコンストラクトを作製する。このステップでは、24ウェルプレートでTM4細胞をウェルあたり200, 000細胞の初期密度で培養します。細胞を培養して6時間後、0.2マイクログラムのMP pGL3-Basicベクターまたは0.2マイクログラムのpGL3ベクターと4ナノグラムのpRL-TKを細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションの30時間後、トランスフェクションした細胞から増殖培地を取り出します。細胞をPBSで洗浄し、洗浄液を取り出します。その後、市販のキットを使用してホタルとレニラのルシフェラーゼ活性を測定します。各チューブの活性を、ホタルのルシフェラーゼ活性を内部制御で割った比率で表します。このステップでは、精巣特異的プロモーターの機能活性を確認します。以下は、球根中のBcrp1プロモーターE1U、E1A、E1B、およびE1Cのレポーターアッセイです。データは、ホタルのルシフェラーゼの発光をRenillaルシフェラーゼの発光に正規化したもので表されます。アスタリスクは、MP pGL3 ベクトル制御との大きな違いを示しています。このグラフは、Bcrp1 E1UレポーターコンストラクトのSF-1応答エレメントの変異がルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示しています。推定上のSF-1結合領域を有するBcrp1レポーターコンストラクトを、SF-1の強制発現の有無にかかわらずTM4細胞にトランスフェクションしました。この図では、a は空のベクトル pGL3 コントロールとの大きな違いを示しています。bは、ベクタートランスフェクション細胞のE1Uプロモーターコンストラクトと比較して統計的に有意な差を示しています。この手順を試行する際には、レポーターアッセイに適した細胞株を選択することを忘れないでください。細胞株は、レポーターコンストラクト中のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現すべきである。この手順に続いて、複数の組織サンプルにおける代替プロモーターの使用の評価を容易にするために、定量的RT-PCRなどの他の方法を実施することができます。このビデオを見れば、目的の遺伝子の代替プロモーターの使用を予測する方法と、そのプロモーターの機能を判断する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP -...

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

遺伝子レポーターアッセイは、DNA配列とその遺伝子調節活性との関係を解剖するための確立された強力なツールです。候補の調節要素を、同定配列タグを持つレポーター遺伝子に結合させることで、これらのアッセイの大規模な並列化が可能になります。...

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

DNA 規制要素、エンハンサーなどは、物理的にゲノム長距離にまたがる長距離染色体相互作用を介して多くの場合、ターゲット遺伝子のプロモーターに連絡して遺伝子発現を制御します。プロモーターが PCHi ハをやあ-C...

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

このプロトコルでは、生きた動物の細胞強化lacリプレッサーとテト活性化システムを使用して興味の内因性遺伝子のトランスクリプションを条件付きで制御できるモデル...

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

ここでは、生体内B-1a細胞の移行および局在化を調べるマウスB-1a細胞のレトロウイルス過剰発現および導入導入の方法について説明する。このプロトコルは、ドナーB-1a細胞の局在化の定量化や、導入後のドナー細胞由来分泌因子の分析を含む、多様な下流機能アッセイに拡張することができる。...

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

学ぶマウスBcrp1の代替プロモーター検出と転写調節解析。インシリコ解析とルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、組織特異的な遺伝子発現制御メカニズムを解明する方法です。

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

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