複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

この手順の目標は、オプトジェネティクスと凍結骨折レプリカ免疫標識技術を組み合わせたもので、マウス扁桃体のシナプスにおけるイオン型グルタミン酸受容体の密度を、シナプス前後の要素が同定された状態で解析することです。その凍結骨折レプリカ免疫標識技術の高い再現性と汎用性は、オプトジェネティクスと組み合わせることで、シナプスの構造的および機能的特性の相関解析に非常に強力なアプローチを提供します。この手順の主な利点は、シナプス前およびシナプス後の要素の平面図、およびこれらの特殊なマイクロドメイン内のタンパク質の定量分析です。

さまざまな手法をさまざまな組織に適合させて、内在性膜タンパク質の分布と組織を研究することができます。一般的に、この組み合わせた光遺伝学的FRILアプローチは、必要なさまざまな装置や機械が多岐にわたるため、初心者にとっては困難です。他のいくつかのステップは習得が難しいため、異なる方法で変調を開始することが重要です。

凍結標本の破砕や複製など この手順を開始するには、マウスの脳の冠状ブロックをバイブロスライサーのホルダーに接着します。新皮質が振動するブレードに面するように組織ブロックを向けます。次に、扁桃体を含む冠状切片を140マイクロメートルの厚さでゼロ点1モルの氷冷PBでスライスします。そして、それらを同じバッファー内の6ウェル皿に集めます。

実体顕微鏡下で、シリコンエラストマーでコーティングされ、ゼロポイント1モルPBで満たされたペトリ皿で、スライスから関心領域を切り取ります。次に、トリミングしたブロックを凍結保護溶液に移し、摂氏6度で一晩保管します。このステップでは、FRIL手順の連続した段階で使用する銅キャリアを、変色除去剤としてシャミースキンのシートで研磨することにより、準備します。顕微鏡下で、両面テープのリングを銅キャリアに取り付けます。これは、トリミングされたブロックの保持ウェルとして機能します。

次に、トリミングしたブロックをプラチナワイヤーループを使用して両面テープの穴に置きます。濾紙またはブラシを使用して余分な凍結保護液を取り除きます。その後、保持キャリアを別のキャリアで覆います。

ティッシュブロックが2つのキャリアの間に挟まれるようにします。試料を凍結するには、キャリアサンドイッチを試料ホルダーに挿入します。続いて、試料ホルダーを高圧凍結ユニットに挿入します。

ジェットオートボタンを押して凍結サイクルを開始し、すぐに試料ホルダーを取り外し、先端を液体窒素の入った断熱ボックスに沈めます。次に、キャリアサンドイッチを試料ホルダーから慎重に取り外し、事前に冷却したクライオバイアルに入れます。キャリアを含むクライオバイアルは、複製されるまでクライオタンクに保管します。

電子ビーム銃を挿入する前に、偏向板でシールドを取り外してください。フィラメントをセンタリングするための設定ゲージを、下部カソードカバーを介してコレットチャックに配置します。次に、圧力層がフィラメントの端をクランプするまで、新しいフィラメントをゲージの上にスライドさせます。

次に、セッティングゲージを取り外し、カーボンロッドを挿入します。エバポレーターロッドホルダーのコレットチャックを締めて固定します。ロッドの端の高さが下から2番目のコイルの中央にあることを確認します。

その後、デフレクタープレートを交換し、電子ビームガンを凍結破壊ユニットに挿入します。この手順では、蒸発の電流と電圧を調整します。次に、凍結したキャリアサンドイッチを液体窒素中のダブルレプリカテーブルに挿入します。

次に、ダブルレプリカテーブルをデュワー容器に移し、45度の角度で試料ステージレシーバーに固定します。テーブルマニピュレーターでダブルレプリカテーブルをピックアップします。それをコールドステージの凍結破砕ユニットに挿入し、ダブルレプリカテーブルの温度が摂氏マイナス115度に調整されるまで約20分待ちます。

その後、ダブルレプリカテーブルの上のシュラウドに接続されているホイールを手動で反時計回りに回転させて組織を骨折します。シュラウドが回転すると、ダブルレプリカテーブルが強制的に開き、その結果、組織が骨折します。90度の角度からのカーボンの層が、破砕された面に適用されます。

その後、複製した標本をダブルレプリカテーブルから取り出し、TBSを充填したセラミック12ウェルプレートに移します。白金ループワイヤーロッドを使用して、複製した組織を試料キャリアから取り出します。SDS消化の場合は、1ミリリットルのSDS消化バッファーで満たされた4ミリリットルのガラスバイアルにレプリカを移します。

振とうしながら摂氏80度で18時間消化します。免疫標識のために、レプリカを新鮮なSDS消化バッファーで10分間洗浄します。次に、2%BSA-TBSで希釈した一次抗体および二次抗体と、摂氏15度の湿ったチャンバーで24〜72時間インキュベートします。

その後、レプリカをフォームファーコーティングされた100本の平行棒グリッドに取り付けます。80キロボルトまたは100キロボルトの透過型電子顕微鏡でレプリカを画像化します。次に、CCDカメラでデジタル画像を取得します。

オフラインの場合は、レプリカから画像上の対応する領域を、さまざまなランドマークを使用して検索します。AAV 注射の 4 週間後、視床後核群でチャネルロドプシン-2 を発現させるために、チャネルロドプシン-2 は視床軸索に沿って前方に効果的に輸送され、扁桃体に挿入された細胞塊に到達します。グルタミン酸作動性シナプスのシナプス後特殊化は、原形質膜のE面上の膜内粒子のクラスターとしてレプリカで認識でき、多くの場合、そのシナプス前要素のP面を伴います。

ここでは、チャネルロドプシン-2とグルタミン酸受容体を、二次抗体に結合した異なるサイズの金粒子を用いて可視化しました。それは、シナプス後膜が挿入されたニューロンに属していたかどうかを同じレプリカで検出するための構造的または分子的なツールがないためです。対応するレプリカは、これらのニューロンのマーカーであるミューオピオイド受容体について標識されました。

これらのシナプスにおけるグルタミン酸受容体密度の定量分析の例として、アンパ受容体の金粒子の数とスパインおよび樹状突起のシナプス領域の散布図を以下に示します。これは、両方の構造で正の相関関係を示しています。この手順を試行する際には、個々のステップが相互依存性が高いことを覚えておくことが重要です。

したがって、ステップの1つを間違えると、手順全体が危険にさらされる可能性があります。レプリカの2次元表面で原形質膜の特殊化の大部分を見ることで、連続アルトロフィン切片の面倒で時間のかかる再構築なしに、関心のある分子の空間分布と物理的連続性を検査することができます。このアプローチは、神経回路の特定のシナプスの構造と機能の関係についての洞察を得るために、他の研究者が使用することができます。

入力の起源とシナプス後要素の性質を解きほぐすところ。これは非常に重要ですが、問題があります。