個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

LAM（レーザーキャプチャー・マイクロダイセクション）を用いた本プロトコルの全体的な目的は、転写解析用の高純度なRNAを生成するために、特定の植物細胞を単離することです。特に、有性生殖および無融合種子形成を行うBoechera属の卵細胞のような、採取が困難な細胞に焦点を当てています。この手法は、種子による植物の有性生殖および無性生殖の根底にある転写基盤など、植物発生遺伝学分野における重要な問いへの回答に寄与します。

この手法の主な利点は、特定の種類の特異的なスタイルを実行できることです。これにより、動脈硬化組織の解析において、希少な細胞型の転写物が遮蔽される影響を克服できます。この手順を開始するには、ブロッキングステーションを使用して、56 °Cで溶融させたパラフィンワックスを、あらかじめ温めておいた新しいプラスチック製バランシングトレーに満たします。

パラフィンバスの蓋を開け、カセットを1つずつ取り出します。サンプルをバランシングトレイ内の56 °Cの液体パラフィンワックスへ移します。カセットを操作している間にサンプルの周囲でワックスが凝固するのを防ぐため、迅速に作業を進めてください。

次に、準備用針を用いて、実験設計に従ってサンプルを配置します。すべてのサンプルを転送するまで、この手順を繰り返します。LAM用の薄切片を準備するために、ライトテーブル上で、プラスチックトレイからサンプルを用いてパラフィンワックスを取り除きます。

RNaseフリーのカミソリを使用して、蕾や花などのサンプルを含むワックスブロックを切り出します。次に、スパチュラの先端で少量のパラフィンワックスを溶かします。そして、その熱いワックスを使用して、サンプルが埋め込まれたブロックを支持台に固定します。

カミソリでサンプルの周囲の余分なワックスを取り除き、ブロックの表面が正方形で辺が平行であることを確認します。次に、加熱プレートを42°Cに設定します。サンプルをマイクロトームに安全に取り付けます。

Boecheraの成熟配偶体細胞について、厚さ7 µmの切片を作成します。その後、長さ10～15 cmのパラフィンリボンを、底面に黒いカードボードを敷いたプラスチックボックスに移し、LAMスライド上に配置します。LAM用のスライドを準備するには、5～10枚のメタルフレームスライドを、平坦な面を上に向けて加熱プレート上に置きます。

スライドのプラスチック部分にRNaseフリー水を1〜2 mLピペッティングします。カミソリを使用して、パラフィンリボンを4〜5 cmの短い断片に切り分けます。これは、スライドのプラスチックウィンドウをカバーするのに十分な長さです。

次に、ピンセットと作製用針を用いて、パラフィンストリップをスライドのプラスチックウィンドウ上に互いに平行に配置します。スライドの一端を慎重に持ち上げて水を取り除き、元の位置に戻します。スライドに触れないようにプラスチック製の蓋で加熱プレートを覆い、その蓋が空気交換を可能にしていることを確認してください。

スライドを42°Cで一晩乾燥させます。化学薬品用フード内で、キシロルを用いてスライドの脱パラフィン処理を10分間ずつ2回行います。このとき、スライドのプラスチック部分のみを浸し、取り出す際に保持するため、各スライドの金属フレームの幅の広い端は乾燥したままにしておいてください。

LAMを行う前に、スライドを化学薬品用フード内で10分間乾燥させます。この手順では、LAM用のコンピュータと顕微鏡の電源を入れます。その後、顕微鏡とレーザーを制御するプログラムを起動してください。

レーザーコントロールボックスの電源を入れ、コントロールボックス上の対応するボタンを押してレーザーをオンにします。次に、キャップホルダーにキャップをセットします。LAMスライドを顕微鏡用ガラススライドの上に置き、組織が付着しているスライドの平坦な面がガラススライド側を向くようにしてください。

次に、ガラススライドを下に敷いた状態で、スライドを装置にセットします。最後に、キャップを入れたキャップホルダーを装置に配置します。4倍の対物レンズを選択してください。

プログラム内でキャップを上昇位置に移動させます。その後、スライドのスキャンを行ってください。スライド内を探索し、目的の構造を特定します。

切断ステップで正確な位置に戻れるよう、スライド上の位置を特定して保存します。次に、適切な対物レンズを選択してください。レーザーショットボタンを1回押し、レーザーの位置を確認します。

理想的には、組織のない膜の部分で行います。キャップを下向きにした状態で、ハンドペンツールを使用して、目的の細胞型または組織の境界をマークします。例えば、卵細胞などです。

Cutを押して、レーザーで切断します。個々の細胞を単離するためには、適切な切片内でそれらを明確に識別することが極めて重要です。また、細胞種特異的な転写解析を可能にするため、細胞の直径は少なくとも 8 µm 必要です。

細胞の周囲の境界が完全に切り出されていない場合は、セクショニングを繰り返す必要があることに注意してください。これは通常、スクリーン上で確認できます。この場合、標準設定として、ソフトウェアでセクションの繰り返し回数を自動的に2回に設定することを推奨します。その後、キャップを持ち上げ、目的の構造がある次の保存位置に移動し、1枚のスライドから目的のすべての細胞が回収されるまで、次の細胞セクションを切り出します。

キャップの新しいセクションが、キャップ上の空いている位置に付着するように配置してください。すべてのスライドから目的の細胞型が分離された後、装置からスライドを取り出します。キャップホルダーを下端まで下げ、キャップ表面を目視で確認してください。

次に、4倍対物レンズを使用して、サンプルの非特異的な汚染がないかを確認します。その後、キャップを閉めます。そして、凍結乾燥切片をさらに使用するまで−80 °Cで冷凍保存します。

成熟した雌配偶体（雌配有組織）の模式図です。これらは boechera divaricarpa の雌配偶体を含む胚珠の薄切片であり、雌配偶体の特徴的な形態により、卵細胞を明確に識別することができます。対照として同じスライドから採取したより広い組織領域と比較して、卵細胞の切片から解析したRNAも同等の品質が得られました。

得られたRNAの品質は細胞型特異的なRNAシーケンシングに適しており、その結果、アポミクティック卵細胞では発現しているが、アポミクティック中心細胞、助細胞、またはアポミクティック始細胞では発現していない236個の遺伝子が同定されました。これらは、arabidopsis thalianaの成熟した有性配偶体細胞においても発現していませんでした。発生遺伝学におけるさらなる疑問に答えるために、異なる種の他の細胞や組織型のプロファイリングを行うことが可能です。

植物種子の胚乳および胚におけるインプリントの分子基盤などの解析が挙げられます。本手法の開発により、発生遺伝学および植物生殖分野の研究者がBoechera属における無融合種子形成の転写基盤を探索する道が開かれます。このビデオを視聴することで、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて、細胞型特異的な転写解析のための高品質なRNAを抽出する方法を十分に理解できるはずです。