タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析サッカロマイセス・セレビシエ

タンパク質の存在量は、タンパク質合成とタンパク質分解の両方の速度を反映しています。この記事では、シクロヘキシミドチェイスとそれに続くウェスタンブロッティングを使用して、モデル単細胞真核生物であるSaccharomyces cerevisiae(出芽酵母)のタンパク質分解を分析する方法について説明します。

この手順の全体的な目標は、出芽酵母の特定のタンパク質の定常状態集団の分解を視覚化することです。この方法は、目的のタンパク質の分解に対する遺伝的要件と、それに対する環境影響を決定するために使用できます。この技術の主な利点は、タンパク質の分解を視覚化するためにも使用されるパルスチェイス技術とは異なり、放射性同位元素や長い免疫沈降ステップが不要であることです。

この手順は、内因性酵母タンパク質またはプラスミドから発現するタンパク質のいずれかを分析するために使用できます。後者の場合、酵母株は、標準的な酵母形質転換プロトコルに従って、目的のタンパク質をコードするプラスミドで形質転換されます。酵母を5ミリリットルの適切な培地に接種します。

回転させながら摂氏30度で一晩インキュベートします。翌朝、各一晩の培養物の600ナノメートル(OD600)での光学密度を測定します。培養物を15ミリリットルの新鮮な培地で0.2のOD600に希釈します。

細胞が中対数成長段階に達するまで、振とうしながら摂氏30度でインキュベートします。酵母細胞が増殖している間に、シクロヘキシミドチェイス手順の準備をします。シクロヘキシミドの存在下で細胞をインキュベーションするために、15ミリリットルの円錐管を摂氏30度まで収容できるヒートブロックを設定します。

培養物への効率的な熱分布を確保するには、15ミリリットルの円錐形のチューブが水位をウェルのリップまで上昇させるが、ウェルのリップからオーバーフローしないように、ヒートブロックの各ウェルに水を追加します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブを摂氏95度まで収容できる2つ目のヒートブロックをセットし、細胞溶解後のタンパク質変性を実現します。摂氏30度までの新鮮な成長を温めます。

アッセイには、培養物ごとに1.1ミリリットルの培地が必要です。50マイクロリットルの20倍ストップミックスを標識済みのマイクロ遠心チューブに加えます。アッセイする培養物ごとに1本のチューブを準備します。

チューブを氷の上に置きます。酵母細胞が中対数成長に達したら、アッセイする各培養物ごとに2.5 OD600ユニットを収集します。1 OD600 ユニットは、OD600 が 1.0 の場合、1 ミリリットルの培養物中に存在する酵母の量に相当します。

収集した細胞を15ミリリットルの円錐管に3, 000倍g、室温で2分間遠心分離します。上清を取り除きます。各細胞ペレットを、細胞の2.5 OD600単位あたり摂氏30度の新鮮な増殖培地1ミリリットルに再懸濁します。

シクロヘキシミドチェイスを開始する前に、摂氏30度のヒートブロックで5分間インキュベートすることにより、酵母細胞懸濁液を平衡化します。この手順で最も難しいのは、各サンプルのシクロヘキシミドの添加と細胞の収集のタイミングです。私たちは、シクロヘキシミドの追加と細胞の収集のためのタイムテーブルを確立し、遵守することにより、成功を保証します。

シクロヘキシミドの追跡を開始するには、タイマーの「開始」を押します。迅速かつ慎重にシクロヘキシミドを最終濃度250マイクログラム/ミリリットルに添加し、最初の酵母細胞懸濁液とボルテックスで短時間渦巻いて混合します。シクロヘキシミドを添加した酵母細胞懸濁液の950マイクロリットル(約2.4 OD600単位)を、50マイクロリットルの氷冷20x Stop Mixを含む標識済みの微量遠心チューブに直ちに移します。

微量遠心チューブをボルテックスし、すべてのサンプルが収集されるまで氷の上に置きます。残りの各酵母細胞懸 ?? 液について示されているように、一定の時間間隔でシクロヘキシミドチェイスを開始します。.その後の各時点で、酵母細胞懸濁液をボルテックスし、950マイクロリットルを50マイクロリットルの予冷済み20x Stop Mixを含む標識マイクロ遠心チューブに移します。

ボルテックスし、収集した細胞を氷の上に置きます。酵母細胞の沈降を防ぐために、追跡の過程で約5分ごとに15ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液を渦巻かせます。すべてのサンプルが収集されたら、収集した細胞を6,500倍のgおよび室温で30秒間遠心分離してペレット

ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。これで、細胞はアルカリ溶解の準備が整いました。各細胞ペレットに100マイクロリットルの蒸留水を加えてアルカリ溶解用の細胞を調製し、ピペッティングで上下させて再懸濁します。

各サンプルに100マイクロリットルの0.2モル水酸化ナトリウムを加えます。ボルテックスで混ぜます。細胞を室温で5分間インキュベートします。

この段階では、酵母細胞は溶解されておらず、タンパク質は放出されていません。次に、室温で18,000倍gで30秒間遠心分離することにより細胞をペレット化する。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。

細胞を溶解するには、各細胞ペレットに100 μリットルのLaemmli Sample Bufferを加えます。ピペッティングで上下させて再懸濁します。摂氏95度で5分間インキュベートし、タンパク質を完全に変性させます。

溶解物を18, 000倍gで遠心分離し、室温で1分間、不溶性材料をペレット化します。抽出されたタンパク質を可溶化した上清は、SDS PAGEによる分離とその後のウェスタンブロット分析の準備ができています。あるいは、ライセートをマイナス20°Cで保存することもできます。

モデル酵母小胞体関連分解基質であるDeg1-Sec62の安定性を、シクロヘキシミドチェイス法によって解析しました。Deg1-Sec62タンパク質は、SDS PAGE上で複数の種として移動し、野生型細胞では容易に分解されます。Pgk1は、分析された条件で存在量が変わらないローディングコントロールです。

小胞体常在ユビキチンリガーゼhrd1またはユビキチン結合酵素ubc7のいずれかが失われると、Deg1-Sec62タンパク質は実質的に安定化し、Deg1-Sec62の分解におけるこれらのタンパク質の以前に観察された役割が確認されました。Cue1は、ubc7を小胞体膜に固定して酵素を活性化する膜貫通タンパク質ですが、Deg1-Sec62分解におけるcue1の必要性は直接的には調査されていません。この研究から、Deg1-Sec62がcue1の非存在下で安定化されたという観察結果から、Deg1-Sec62の小胞体関連分解におけるcue1の役割が確認されました。

ウェスタンブロットの結果は、イメージングソフトウェアを使用して定量化しました。サンプル間でDeg1-Sec62タンパク質の存在量を比較するために、各サンプルについてDeg1-Sec62とPgk1の調整されたシグナル強度の比率を決定しました。この手順は、目的のタンパク質の定常状態集団の分解動態を最も直接的に報告することを覚えておくことが重要です。

目的のタンパク質の新生集団の分解を視覚化するために、パルスチェイス実験などの他の手法を使用することができます。シクロヘキシミドとアジ化ナトリウムは非常に毒性が高く、この手順を実行する際にはこれらの化学物質と直接接触しないように予防策を講じる必要があることを忘れないでください。