タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析

この手順の全体的な目的は、Saccharomyces cerevisiaeにおける特定のタンパク質の定常状態の集団の分解を可視化することです。この手法を用いることで、目的タンパク質の分解に必要な遺伝的要因や、環境による影響を決定できます。本手法の主な利点は、タンパク質分解の可視化に用いられるパルス追跡法とは異なり、放射性同位体や長時間の免疫沈降ステップを必要としないことです。

この手順は、酵母の内因性タンパク質またはプラスミドから発現させたタンパク質のいずれかを解析するために使用できます。後者の場合、標準的な酵母形質転換プロトコルに従い、目的のタンパク質をコードするプラスミドを酵母株に形質転換させます。その後、酵母を5 mLの適切な培地に接種します。

30 °Cで回転させながら一晩インキュベートします。翌朝、各 overnight 培養液の600 nmにおける吸光度（OD600）を測定します。新鮮な培地 15 mLを用いて、培養液をOD600 0.2まで希釈します。

細胞が対数増殖期の中期に達するまで、30 °Cで振盪培養します。酵母細胞の増殖中に、シクロヘキシミド・チェイス操作の準備を行います。シクロヘキシミド存在下で細胞をインキュベートするため、15 mLコニカルチューブを設置可能なヒートブロックを30 °Cに設定します。

培養液に効率的に熱を伝達させるため、15 mLコニカルチューブを挿入した際に水位がウェルの縁まで上昇し、かつ溢れない量まで、ヒートブロックの各ウェルに水を加えます。細胞溶解後のタンパク質変性用に、1.5 mLマイクロ遠心チューブに対応した2つ目のヒートブロックを95 °Cに設定します。新鮮な増殖培地を30 °Cに予熱しておきます。

分析対象となる培養物1検体につき、1タイムポイントあたり1.1 millilitersの培地が必要です。あらかじめラベルを貼ったマイクロ遠心チューブに、20x Stop Mixを50 microliters加えます。分析対象となる培養物1検体につき、1タイムポイントあたり1本のチューブを準備してください。

チューブを氷上に置きます。酵母細胞が対数増殖期の中期に達したら、解析する各タイムポイントにつき、各培養液から2.5 OD600ユニット分を回収します。1 OD600ユニットは、OD600が1.0のときの培養液1 mL中に存在する酵母の量に相当します。

回収した細胞を15 mLコニカルチューブに入れ、室温で3,000 ×gで2分間遠心分離します。上清を除去します。細胞ペレットを、細胞2.5 OD600単位あたり1 mLの30 °Cに温めた新鮮な増殖培地で再懸濁します。

シクロヘキシミド・チェイスを開始する前に、酵母細胞懸濁液を30 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、平衡化させます。この手順で最も困難な点は、各サンプルのシクロヘキシミド添加と細胞回収のタイミングです。シクロヘキシミドの添加および細胞回収のタイムスケジュールを策定し、それに厳格に従うことで、確実に成功させます。

シクロヘキシミド・チェイスを開始するために、タイマーの「Start」を押します。迅速かつ慎重に、1番目の酵母細胞懸濁液にシクロヘキシミドを最終濃度 250 µg/mL になるように加え、ボルテックスで短時間混ぜ合わせます。直ちに、シクロヘキシミドを加えた酵母細胞懸濁液 950 µL（約 2.4 OD600 ユニット）を、氷冷した 20x Stop Mix 50 µL が入ったラベル付きマイクロ遠心チューブに移します。

マイクロ遠心チューブをボルテックスし、すべてのサンプルの回収が完了するまで氷上に置きます。残りの酵母細胞懸濁液について、実演に従い、一定の時間間隔でシクロヘキシミド追跡を開始します。以降の各タイムポイントにおいて、酵母細胞懸濁液をボルテックスし、あらかじめ冷却した20x Stop Mixを50 µL含むラベル付きマイクロ遠心チューブに950 µL分注します。

ボルテックスし、回収した細胞を氷上に置く。酵母細胞の沈殿を防ぐため、チェイス期間中は15 mLコニカルチューブ内の細胞懸濁液を約5分おきにボルテックスする。すべてのサンプルを回収した後、室温で6,500 ×g、30秒間の遠心分離により回収した細胞をペレット化する。

ピぺッティングまたは吸引により上清を除去します。これで細胞をアルカリ溶解させる準備が整いました。各細胞ペレットに100 µLの蒸留水を加え、ピぺッティングにより再懸濁して、アルカリ溶解の準備をします。

各サンプルに0.2 Mの水酸化ナトリウムを100 µL加えます。ボルテックスで混合します。細胞を室温で5分間インキュベートします。

この段階では、酵母細胞は溶解しておらず、タンパク質は放出されていません。次に、室温で18,000 ×gにて30秒間遠心分離し、細胞をペレット化します。ピペッティングまたは吸引により上清を除去してください。

細胞を溶解させるため、各細胞ペレットに100 µLのLaemmli Sample Bufferを添加します。ピペッティングにより再懸濁してください。その後、タンパク質を完全に変性させるため、95 °Cで5分間インキュベートします。

溶解物を18,000 ×g、室温で1分間遠心分離し、不溶性物質をペレット化します。可溶化した抽出タンパク質である上清は、SDS PAGEによる分離およびその後のウェスタンブロット解析に使用可能です。あるいは、溶解物を-20 °Cで保存することもできます。

酵母の小胞体関連分解（ERAD）基質のモデルであるDeg1-Sec62の安定性を、シクロヘキシミド・チェイス法を用いて解析しました。Deg1-Sec62タンパク質はSDS-PAGEにおいて複数の種として泳動され、野生型細胞では速やかに分解されます。Pgk1はローディングコントロールであり、解析条件下でその発現量は変動しません。

ER局在のユビキチンリガーゼhrd1またはユビキチン結合酵素ubc7のいずれかを欠損させると、Deg1-Sec62タンパク質が著しく安定化しました。これにより、Deg1-Sec62の分解におけるこれらのタンパク質の役割が、先行研究と同様に確認されました。Cue1は、ubc7をER膜に固定し、その酵素活性を促進する膜貫通タンパク質ですが、Deg1-Sec62の分解におけるcue1の必要性については、これまで直接的な調査が行われていませんでした。本研究において、cue1の欠損によりDeg1-Sec62が安定化したことが観察されたことで、Deg1-Sec62のER関連分解におけるcue1の役割が確認されました。

ウェスタンブロットの結果をイメージングソフトウェアを用いて定量しました。サンプル間でのDeg1-Sec62タンパク質の存在量を比較するため、各サンプルについてPgk1に対するDeg1-Sec62の補正信号強度の比を算出しました。この手順は、標的タンパク質の定常状態における集団の分解キネティクスを最も直接的に報告するものである点に留意することが重要です。

目的タンパク質の新生集団の分解を可視化するには、パルス・チェイス実験などの他の手法を用いることができます。シクロヘキシミドとアジ化ナトリウムは極めて毒性が強いため、本手順の実施中はこれらの化学物質に直接触れないよう十分な注意を払ってください。