マウスレンズの圧縮剛性を評価するために、ガラスカバースリップの逐次適用：ひずみと形態計測分析
2016年5月3日
加齢に伴う眼の硬さの増加は老眼に関連しています。このプロトコルは、マウスのレンズの剛性を測定するためのシンプルで費用対効果の高い方法を説明しています。マウスのレンズは、人間のレンズと同様に、年齢とともに硬くなります。この方法は正確で、より大きな動物のレンズにも適応できます。
この手順の全体的な目標は、シンプルで安価なアプローチを使用してマウスレンズの圧縮剛性と形状を評価することです。この方法は、レンズ分野の重要な質問に答えることができます。例えば、遺伝的および実験的摂動の違いが水晶体の生体力学的特性にどのように影響するかなどです。
この手法の主な利点は、正確で再現性があり、高価で特殊な機器を必要としないことです。この方法は、マウスのレンズの特性に関する洞察を提供し、ラットやウサギなどのより大きなモデル生物への応用が期待できます。レンズの解剖とカバースリップの適用手順はデモンストレーションなしでは習得が難しいため、メソッドの視覚化は非常に重要です。
その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるCatherine Chengです。湾曲した鉗子を使用して解剖を開始し、安楽死させたマウスの目の周りの組織を押し下げ、眼窩から眼球を引き出します。次に、眼球を取り出し、新鮮なPBSを含む解剖皿に解剖顕微鏡で入れます。
視神経をできるだけ眼球の近くで切断します。そして、視神経が臓器の後部から出る穴を通して、細いまっすぐなピンセットを眼球に優しく慎重に挿入します。レンズを傷つけないように注意しながら、角膜の後部から端までハサミで慎重に切開します。
角膜と強膜の間の接合部に沿って、少なくとも眼球の半分まで切開を続けます。そして、角膜をそっと押して、開口部からレンズを目から取り外します。次に、先端が細いまっすぐな鉗子を使用して、レンズにまだ付着している大きな破片を慎重に取り除きます。
また、レンズに損傷がないことを視覚的に確認します。剛性測定を開始する少なくとも2時間前に、分析天びんを使用して、同じボックスから少なくとも10枚のカバースリップを計量します。カバースリップの平均重量を決定します。
次に、カバースリップと直角ミラーを室温PBSで事前に濡らします。材料が水和されている間に、測定チャンバーに65〜75ミリリットルのPBSを充填します。そして、チャンバーを30倍に設定された解剖顕微鏡の下に置き、下から照明を当て、左側と右側に光ファイバー光源を置きます。
カバースリップの準備ができたら、レンズを保持するために使用されるディボットから一定の距離で、直角ミラーをチャンバーに配置します。次に、湾曲した鉗子を使用して、解剖したレンズを慎重に測定チャンバーに移します。パワーオプティック電源を最大光強度の80%に設定し、必要に応じて周囲の照明、ユーザーの好み、画質に基づいて電源出力を調整します。
アンロードされたレンズの上面画像をチャンバーの真上から取得します。次に、ピントが合ったミラーエッジの写真を撮り、続いてディボットの外側のミラーを通してアンロードされたレンズの側面図の画像を撮ります。次に、レンズをディボットに置き、レンズが前極または後極のディボット内にしっかりとまっすぐに装着されていることを確認します。
鏡に映ったレンズの写真を撮ります。次に、カバースリップをレンズにそっと置きます。2分後、ロードされたレンズの別の側面図の画像を撮ります。
各カバースリップの追加から2分後に、合計10枚のカバースリップが適用されるまで、サイドビュー画像を取得しながら、カバースリップの追加を続けます。次に、すべてのカバースリップを取り外し、最後の2分間待って、ディボットの内側と外側のレンズの側面図画像を取得します。そして、ディボットの外側のレンズの上面図画像。
レンズの核サイズを決定するには、PBSで満たされた清潔なペトリ皿にレンズを置き、細いまっすぐな鉗子を使用してレンズのカプセル化を穏やかに解除します。皮質線維細胞を取り外すには、手袋をはめた指の間でレンズを転がします。次に、PBSで水晶体核をやさしくすすぎ、核を測定チャンバーに戻します。
直角ミラーを通してレンズ核の画像を取得します。最後に、画像を解析するには、適切な画像解析ソフトウェアを使用して、各ロードステップの前後にレンズの赤道径と軸径を測定します。各レンズ核の直径も測定します。
この代表的な実験では、生後2か月、4か月、8か月齢のマウスレンズの剛性と寸法を測定し、軸方向と赤道方向のひずみを計算しました。軸方向のひずみは、最大適用荷重の下で軸方向および赤道方向のひずみが統計的に有意な年齢依存の減少を伴う、加えられた荷重の対数関数であり、マウスのレンズが年齢とともに硬化することを示しています。この実験で収集された画像データは、他のいくつかのレンズの形態学的特性を決定するためにも使用されました。
予想通り、軸径と赤道径、およびレンズの体積は、年齢とともに増加しました。アスペクト比は、レンズの赤道径が軸径よりもわずかに大きいことを示しています。そして、このパラメータは年齢とともに変化しませんでした。
水晶体核の直径、体積、および分率は経年変化とともに増加するため、水晶体が経年劣化に伴って水晶体核が相対的に大きくなるように再モデル化されることを示唆しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、レンズあたり30〜45分で完了できます。この手順を試行するときは、レンズをディボット内に均等に配置し、追加のカバースリップごとにレンズのストレスを2分間緩和することが重要です。
このビデオを見れば、カバースリップの逐次適用を使用してマウスレンズの圧縮剛性とモルフォメトリクスを評価する方法について十分に理解できるはずです。この正確でシンプル、かつ安価な技術は、レンズ研究者がマウスの遺伝子変異の生体力学的影響を調査する道を開きます。
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概要
このプロトコルは、年齢とともに硬さが増す人間のレンズと同様に、マウスのレンズの硬さを測定するための簡単で費用対効果の高い方法を概説しています。この技術は正確で、より大きな動物のレンズにも適応できます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- バイオメカニクス
背景
- 年齢に関連するレンズの硬さの増加は、老視と関連しています。
- レンズの生体力学的特性を理解することは、視覚関連の問題に対処するために重要です。
- マウスのレンズは、レンズの硬さとその影響を研究するためのモデルとして機能します。
- この方法は、より大きなモデル生物にも適用でき、その関連性を高めています。
研究の目的
- マウスのレンズの圧縮硬さと形状を評価すること。
- 遺伝的および実験的要因がレンズの特性にどのように影響するかを調査すること。
- 高価な機器を必要としない再現可能な方法を提供すること。
使用された方法
- マウスのレンズの圧縮硬さの測定。
- レンズの形状の評価。
- 簡単で安価なアプローチの適用。
- レンズの解剖とカバースリップ適用技術の視覚化。
主要な結果
- この方法は、レンズの硬さを測定する際の精度と再現性を示しています。
- 得られた洞察は、異なる種にわたるレンズの特性に関する研究に情報を提供できます。
- 視覚化は、複雑な解剖技術の理解を助けます。
- 潜在的な応用は、より大きな動物モデルにまで及びます。
結論
- この方法は、レンズの生体力学に関する貴重な洞察を提供します。
- これは、分野の研究者にとって費用対効果の高いツールです。
- さらなる研究は、このアプローチを活用して、レンズの特性に対する遺伝的および実験的影響を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of lens compressive stiffness using sequential glass coverslips enables precise biomechanical characterization in genetically engineered mouse models. This reproducible, scalable method supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular disease research. Its cost-effectiveness and adaptability position it as a reusable capability for preclinical R&D pipelines focused on lens pathologies and age-related biomechanical changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and experimental perturbations on lens biomechanics.
- Supports functional target validation by quantifying age- and mutation-dependent changes in lens stiffness.
- Facilitates mechanistic de-risking for ocular disease models by providing direct biomechanical readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ex vivo lens systems for downstream compound or genetic screening.
- Delivers standardized, quantitative strain and morphometric outputs for assay reproducibility.
- Supports scalability and platform reuse across different animal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by modeling age-related biomechanical changes relevant to human lens pathologies.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical validation in lens research.
- Provides predictive confidence for advancing lens-targeted interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational modeling.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical effects of genetic or experimental manipulations in mouse lenses.
- Screening: Offers reproducible, quantitative strain and morphometric measurements for assay development.
- Analytics: Provides statistical outputs for comparing age groups, genotypes, or interventions.
- Translational Research: Models age-related lens stiffening, informing biomarker alignment for human disease.
- Enterprise Reuse: Adaptable for larger animal models, supporting cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lens biomechanics.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biomechanical assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ocular portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and interventions for lens pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lens dissection and precise application of compressive loads.
- Needs basic imaging and analytical infrastructure for morphometric analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across studies and models.
- Adaptable to larger animal models with protocol adjustments.
- Dependent on careful handling to avoid lens damage and ensure data quality.
