有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

このアプローチの全体的な目標は、インピーダンスベースのリアルタイムセルアナライザーとハイコンテントスクリーニングベースのプラットフォームを組み合わせたもので、有効用量、毒性、および生物学的影響に関する情報を提供し、試験した化合物のToxプロファイルを取得することです。このアプローチは、毒物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、細胞毒素、遺伝毒性、細胞ストレス応答などに対処します。

さらに、複数の生化学的および形態学的パラメータに関する情報を同時に提供するだけでなく、さまざまな細胞タイプや細胞培養モデルにも適用できます。管轄権と制限により、アプローチ全体は、短い化合物のみを評価しながら実行されます。同じ理由で、ハイコンテントスクリーニング評価を実証するためのプロトコルは1つだけ表示されます。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるStefano AcaliとAlexander Laurentです。正常なヒト気管支上皮細胞(NHBE細胞)を見るには、インピーダンス測定の数と期間を定義するように装置をプログラムします。この研究では、データは15分ごとに48時間記録されます。

50マイクロリットルの予熱した培地を96ウェルRTCAプレートの各ウェルにピペッティングして、プレートの背景を測定します。このステップは、セルベースの計算のベースライン基準として使用する媒体電気抵抗を装置が計算するための技術要件を表しています。次に、RTCAプレートの各ウェルにすでに存在する培地に、1ミリリットルあたり144,000細胞の濃度で50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加します。

細胞が加熱されたら、プレートを室温で40分間放置して、細胞が付着し、均一な細胞分布を得ることが非常に重要です。インキュベーターのクレードルでRTCAプレートをインキュベートし、投与前に次の24時間プラスマイナス2時間分のデータの記録を開始します。ポジティブコントロールでは、10ミリモルのスタウロスポリンストック溶液をDMSOで1〜10に希釈します。.

希釈液の5マイクロリットルを195マイクロリットルの培地に加えて、5倍の作業溶液を得ます。有害な成分と潜在的に有害な成分については、それぞれを車両に溶解して、1モルのストック溶液を生成します。次に、各被験物質原液を1〜10個を培地で希釈して、100ミリモル溶液を生成します。

最初にBからFまでのウェルに培地と10%ビヒクルを加え、ウェルAに100ミリモル溶液を添加してコンパウンドマスタープレートを生成します。5ステップ、1〜10の段階希釈を行い、5倍の作業溶液を得ます。投与するには、RTCA装置を一時停止し、クレードルを開いて露光プレートを取り外し、プレートをRTCA温度ツールに置いて、インピーダンス測定に影響を与える可能性のあるセルの冷却を回避します。コンパウンドマスタープレートから25マイクロリットルの5倍溶液を細胞に三重に添加し、コンパウンドマスタープレートと同じ投与順序を維持します。

既存の細胞培養培地は取り出さないでください。次に、既存の培地を取らずに、25マイクロリットルの5倍ポジティブコントロール溶液を下段の右半分の細胞に加えます。同様に、25マイクロリットルの培地を一番下の行の左半分のセルに追加します。

プレートシーラーでプレートをシールした後、プレートをRTCAクレードルに戻し、ロックします。希望の露光時間でデータ記録を再開します。データ記録後、RTCA細胞の生存率データを解析し、HCS解析に使用する試験物質を決定します。

この実験では、1-アミノナフタレン、ヒ素、クロム、およびクロトンアルデヒドをHCS分析用に選択します。NHBE細胞を見るためには、1ミリリットルあたり120, 000細胞で細胞懸濁液の100マイクロリットルを96ウェルブラックプレートの各ウェルに加える。HCSプレートを室温で30分間放置した後、細胞をウェルに付着させるために、摂氏37度、5%CO2で24時間、±2時間インキュベートしてから投与してください。

ポジティブコントロールの場合、各ポジティブコントロールのストック溶液40マイクロリットルをカラム2に分注します。次に、3列目と5列目に車両の20マイクロリットルを分配します。そして、4列目の車両の40マイクロリットル。

2列目のウェルから12マイクロリットルを引き出し、3列目のウェルに分注し、混合します。各ポジティブコントロール化合物の3回の投与とビヒクルによる最終的な段階希釈が得られるまで続けます。.ポジティブコントロールプレートを生成するには、3回分とビヒクルの媒体で1〜40希釈液を調製します。

コンパウンドマスタープレートを作成するには、各試験物質ストック溶液を1〜10の培地で100ミリモルの濃度で再懸濁して希釈します。10%ビヒクルの媒体を使用して希釈を行い、各試験物質に対して選択された5倍の用量を得る。これで、ポジティブコントロールとコンパウンドプレートの両方を曝露プレートに投与する準備が整いました。

次に、コンパウンドマスタープレートから25マイクロリットルの5倍溶液を細胞に三重に添加し、コンパウンドマスタープレートと同じ投与順序を維持します。既存の細胞培養培地は取り出さないでください。次に、ポジティブコントロールプレートから25マイクロリットルの5倍溶液を下段のセルに加え、ポジティブコントロールプレートと同じ投与順序を維持します。

テキストプロトコールに記載されている十分な量の生細胞染色溶液を調製します。次に、ミトコンドリア色素と膜透過性色素の両方を、ベンダーの指示に従って生細胞染色溶液で希釈します。50マイクロリットルの生細胞染色溶液を、Cytotoxicity Assayと名付けられたプレートの各ウェルに加えます。

細胞培養培地を取り除かず、摂氏37度、5%CO2で30分間インキュベートします。培地と染色溶液を穏やかに吸引し、各ウェルに100マイクロリットルの固定溶液を加えます。次に、プレートを室温で20分間、暗所でインキュベートします。

インキュベーション後、固定溶液を穏やかに吸引し、洗浄バッファーのウェルあたり100マイクロリットルで1回洗浄します。洗浄バッファーを取り外し、1ウェルあたり100マイクロリットルの1x透過化バッファーを各ウェルに加えてから、室温で10分間、暗所でインキュベートします。透過化緩衝液を吸引し、1ウェルあたり100マイクロリットルの洗浄緩衝液でプレートを2回洗浄します。

次に、洗浄バッファーを吸引し、各ウェルに100マイクロリットルの1x Blockingバッファーを加えます。その後、暗所で室温で15分間インキュベートします。抗シトクロムC抗体を一次抗体溶液で1〜250に希釈します。

次に、ブロッキングバッファーを吸引し、各ウェルに1ウェルあたり50マイクロリットルの一次抗体溶液を加えてから、室温で暗所で60分間インキュベートします。抗マウス抗体を二次抗体と核溶液で1:500に希釈します。また、核色素を二次抗体と核溶液で1対1, 000に希釈します。

一次抗体溶液を吸引した後、プレートワッシャーを使用して、1ウェルあたり100マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。洗浄バッファーを吸引し、プレートの各ウェルにウェルあたり50マイクロリットルの二次抗体と核溶液を加えます。次に、プレートを室温で60分間、暗所でインキュベートします。

二次抗体と核溶液を吸引した後、プレートワッシャーを使用して、1ウェルあたり100マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。次に、1ウェルあたり100マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。これで、プレートをHCS装置で評価する準備ができ、取得が開始されます。

被験物質処理の代表的なRTCA細胞生存率結果を示します。1-アミノナフタレン、ヒ素、クロム、およびクロトンアルデヒドのみを使用して 24 時間の曝露で毒性の用量依存的な効果が得られ、これらはすべて 20 ミリモル未満の計算 LD50 を示しました。他の化合物では毒性作用は得られませんでした。

1-アミノナフタレン治療のみの代表的なHCS結果を示します。1-アミノナフタレンの毒性作用は、細胞膜の深刻な損傷を誘発しており、4時間の曝露後には、用量依存的に細胞膜透過性が増加します。この化合物はミトコンドリアにも影響を及ぼし、4時間の曝露後に質量の増加を誘発し、シトクロムCの放出とともに、4時間および24時間の曝露後に核内で検出可能になります。

この手法を習得すると、2〜3日で実行できますが、ほとんどの手法では、設定と投与に1日あたり約1時間のハンズオン時間が必要です。選択したプロトコルにもよりますが、ハイコンテントスクリーニングでは、染色手順全体の実行に最大3時間半かかります。この手順を試行する際は、より広範なエンドポイントを選択してもワークフローが複雑になりますが、時間が大幅に増加するわけではないことに注意してください。

実際、最適なワークフローにより、複数のプレートを並行して評価することができます。全自動の細胞設定、化合物の希釈、投与と染色、新たなエンドポイントの追加など、ハイコンテントスクリーニングプラットフォームの継続的な開発により、毒物学的プロファイリングの強力なツールとしてのハイコンテントスクリーニングプラットフォームの能力がさらに拡大します。さらに、このような高いスループットで複数の単一の毒物学的エンドポイントを組み合わせることで、動物での化学試験を減らすための取り組みをさらに一歩進めることができます。