Name: 鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぶ単一細胞のタイムラプス顕微鏡法を用いた抗がん治療薬応答の長期観察法。HT1080細胞を用いて異質な治療応答と細胞運命をリアルタイムで追跡し、がん治療の効果と耐性メカニズムの理解を深める。

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技術サポートを提供してくださったJoshua Marcus氏と、技術的なアドバイスを提供してくださったRichard J. McIntosh光学顕微鏡コア施設のディレクターであるJolien Tyler博士に感謝します。この研究は、コロラド大学ボルダー校とコロラド大学ボルダー大学院からJ.D.O. R.T.B.への資金提供によって支援されました。これは、NIHからの博士課程前研修助成金(T32 GM008759)によって部分的にサポートされています。セリネクサーについてはKaryopharm Therapeutics, Inc.、キネシン-5阻害剤についてはMerck Seronoに感謝します。FUCCIプラスミドは、宮脇淳氏(理化学研究所、日本)からMTA経由で提供されています。mCherry-BP1-2はAddgeneのものでした。H2b-mCherryとβ-tubulin-EGFPを発現するHeLaは、Daniel Gerlich氏(IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria)によるものです。

以下のプロトコルは、取得の設定や実験条件について、 図4、図 6の実験によって定義されたパラメータを使用しています。これらのパラメータの多くは、他の実験に適合するように修正することができる（ すなわち、露光時間、ビニング、蛍光チャネルなど ）。すべての手順は、制度ガイドラインと規則を遵守しなければならないと制度バイオセーフティ委員会によって承認されます。顕微鏡メーカーのウェブサイトでは、ライブセルイメージングのための優れた情報が含まれています。 1.顕微鏡およびイメージングソフトウェア<ol><li>倒立顕微鏡の多種多様でライブセルイメージングを実行します。最も一般的な顕微鏡は、落射蛍光とスピニングディスク共焦点を広視野ています。ここでは、200ワットのメタルハライド光源を用いて自動化された電動式広視野落射蛍光顕微鏡を使用しています。 </li><li>ステージ上部または顕微鏡環境室を入手します。ここで、ステージトンを使用オペアンプ環境室。 </li><li>タイムラプス顕微鏡を実行するためのユーティリティで顕微鏡を操作する商用ソフトウェアを使用してください。 </li><li>画像解析用の市販のソフトウェアまたはImageJのを使用してください。他の多くの分析ツールが市販されており、8,18を公開されているの多くのカスタムメイドのプログラムがあります。 </li></ol> 2.細胞プロセスおよび表現型応答の可視化<ol><li>明視野顕微鏡で細胞を可視化します。微分干渉コントラスト単独位相コントラストは、抗癌薬の応答に対する応答を研究するために非常に有益であることができます。これらのプロセスは、有糸分裂、細胞運動性およびアポトーシスを含むことができます。 </li><li>蛍光バイオセンサーを用いて細胞構造、細胞小器官およびプロセスを視覚化します。蛍光プローブは、特定の細胞内のプロセスを追跡するのに有益です。これらは、微小管ダイナミクス、ミトコンドリアと小胞体のダイナミクス、タンパク質の蓄積および局在化を含むことができ、分子シグナル（ 例えば 、リン酸化、カルシウム）。 </li></ol>試料の調製<ol><li>標準の加湿細胞培養インキュベーター（ 例えば、37 O C、5％CO 2、相対湿度80％）で細胞培養認定皿で細胞を増殖させます。 <ol><li> EBSSとMEMでHT1080細胞を成長させます。 10％v / vのFBS、1％v / vのペニシリン/ストレプトマイシン、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、1％v / vの非必須アミノ酸を含む培地を補います。 </li></ol></li><li>イメージングの2日前に、認定された無菌層流フード内で12ウェル＃1.5ガラスボトムディッシュの3ウェルにプレート50,000 HT1080 FUCCI細胞。実験の開始のための〜60％のコンフルエンスを達成するために播種した細胞の数を調整します。実験の細胞株および性質に応じて、セル密度が小さくてもよいです。 注：細胞密度は、細胞株の成長を、実験結果に大きな影響を有していてもよいです。実験間variabilitを最小限にするために、細胞を数えます密度に起因するyの。 <ol><li>環境室や実験に必要な条件、単一ウェル皿中のプレート細胞（典型的には、35-または60ミリメートル）、4も35-mmディッシュ、6、12または24ウェル細胞培養プレート、またはに応じて、様々なフォーマットでカバースリップスライド。細胞培養プラスチックを通して＃1.5ほとんどの対物レンズは、ガラスのこの厚さのために最適化されているように、ガラス、およびイメージングのガラス底プレートを使用して、非常に悪いです。 注：一部の細胞株が成長し、ガラス上に生存しません。これらの場合において、ガラスは、細胞接着（ 例えば 、ポリリジンまたはコラーゲン）を高めるためにコーティングすることができます。一部の企業は、光細胞培養プラスチックを製造し、これは実行可能なオプションである場合、それは経験的に決定されなければなりません。 </li></ol></li></ol> 4.環境チャンバーセットアップ<ol><li>前のいずれかの実験に、セットアップ環境室を37°Cのそれは80％の湿度〜で動作し、そのように試料位置での温度となるように。ほとんどの培養細胞は、培地中の重炭酸ナトリウム緩衝液を5％CO 2 /バランス空気雰囲気中で成長します。セットアップに応じて、いずれかの5％CO 2の環境制御装置を設定し、それが空気で100％のCO 2を混合し 、または5％CO 2 /バランスエアガス認定、プレミックスを使用します。ガス流速については、製造元の指示に従ってください。 注：一部の細胞系は、それらがCO 2なしで維持することができ、その場合にCO 2非依存性培地中で増殖します。具体的に設計された画像形成媒体は、自家蛍光化合物の添加を制限することも可能です。所望の細胞型のための論文媒体の成長は事前に実験的に決定されなければなりません。 </li><li>撮影の前に、水溜りを滅菌蒸留水で（製造者の指示に従って）満たされていることを確認します。所望の温度設定に環境室をオンにして、顕微鏡ステージの挿入図に配置します。ガスを保存するには、この時点でフローを開始しないでください。 注意：ステージトップチャンバーとステージインセットおよび/またはそれが実験に運動アーチファクトを導入することができるチャンバへの接続コード上の任意のテンションとの間の空きスペースがある場合。 <ol><li>ステージに結合するように、その中にチャンバを、チャンバを挿入する前段階のはめ込み開口部の縁の上にパラフィンフィルムの断片を置き、そして何の接続は、チャンバを引いていないことを確認してください。 </li></ol></li><li>チャンバーは37℃。に平衡することを許可します細胞生理学に影響を与えるとドリフトを導入することができる撮像中の温度変動を防止するための安定した温度を維持します。温度平衡に到達すると、通常の環境に応じて、1時間に30分を必要とします。 <ol><li>温めながらチャンバー内に井戸内の水と「ダミー」の料理を挿入します。室を確保する手助け水模倣でサンプルを充填したイメージング皿は、十分に温め、安定化されます。予め温めた滅菌水でチャンバーを充填温度安定化に必要な時間を短縮し、実験試料の添加時に温度低下を最小限に抑えます。 </li></ol></li></ol> 5.顕微鏡セットアップ<ol><li>顕微鏡、関連するコンピュータ、および任意の必要な周辺機器の電源を入れます。 <ol><li>光源に応じて、必要になるまでこれをオンにするのを待つ（ 例えば 、LED）。 </li></ol></li><li>低い位置にある対物レンズタレットを使用すると、使用する20X 0.7 NAの対物レンズを選択します。 </li><li>目的以上のサンプルを置きます - これは、試料がチャンバー内にあるときに、それが簡単に細胞を見つけることになります。 </li><li>彼らは以前の実験から知られている場合は、この時点で撮像パラメータを定義します。 </li></ol> 6.顕微鏡にし、チャンバー内に細胞を輸送<ol><li>環境室にインキュベーターから撮像される細胞をトランスポートします。これは比較的低いCO 2の効果を制限するために迅速に行われていることを確認してください</サブ&gt;大気中および細胞上の温度を低下させました。サンプル輸送及び流出した場合のクリーンアップのためのすべての機関のバイオセーフティガイドラインに従ってください。 <ol><li>大きな環境変化を避けるために密封された発泡スチロールの容器または絶縁された袋に細胞を置きます。 </li></ol></li><li>製造元の指示に従ってチャンバー内に試料イメージング皿を挿入します。 </li><li>細胞は、環境チャンバ内に固定された後、安定した環境を維持し、すぐに雰囲気ガスの供給源（複数可）をオンにするために、チャンバをシール。 <ol><li>いくつかの環境室はタイトな、密封された蓋を利用しないように、成長培地の上に蒸着、無菌層、胚認定鉱物油を遅延させます。ガラス撮像領域を妨げないように注意しながら試料皿の周囲のエッジの周りにガス透過性パラフィンフィルムを包みます。ローカライズされた、二次加湿方法を採用することができます。試料皿の蓋に結露がperforを減少させることができます明視野顕微鏡のマンス。 </li></ol></li><li>初期の実験中の熱ドリフトの影響を最小限にするために、時間経過を開始する前に30分待ちます。所要時間は、イメージング皿のサイズやその他の要因によって異なります。経験的に決定します。 </li></ol> 7.イメージングを設定します<ol><li>最良のデータを表現する撮影条件を選択します。 、露光時間を制限する低い強度の光を使って光の長い波長によって励起されたプローブを選択することにより、光毒性を避けるための予防措置を講じてください。 </li><li> X、Y、および画像化される各位置に対するz平面と所望の波長（複数可）を定義します。時間分解能は、位置と波長の数によって制限されます。ほとんどの細胞プロセスの長期タイムラプスについては、すべての10 1つの画像を取得 - 20分。より高い時間分解能（短い間隔、 例えば 、1分）、より多くのデータポイントを提供し、したがって、より強固な細胞追跡だけでなく、複数の集積をもたらします露光、大きなデータセット。 <ol><li> - 50ミリ秒、テキサスレッド/ TRITC - 40ミリ秒、明視野 - 20ミリ秒FITC / GFP：HT1080 FUCCIが動的緑色と赤色蛍光タンパク質を持っているように（代表的な結果を参照）、以下の露光時間を使用します。 2×2のビンを使用してください。 </li></ol></li><li>高度な設定の下で、デフォルトパラメータを使用して、ソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。推奨ステップサイズで10μmのオートフォーカス範囲を定義します。タイムラプスを開始する前にこれを実行してください。光毒性および光退色を低減するために、蛍光と明視野画像と決してとオートフォーカス。 <ol><li>電動ステージで任意の顕微鏡上でソフトウェア制御オートフォーカスシステムを使用し、直接サンプルに焦点を当てます。しかし、それらは、実験の取得速度を制限することができます。ハードウェア制御の連続フォーカシングシステムは、タイムラプス顕微鏡検査のためにうまく機能し、それ以上の位置に結像するか、買収の高いレートを可能にする、速度を向上させます。しかしながら、それら空気 - ガラス界面の検出に依存しているとよく全体のガラスの厚さの変化にサンプルのフォーカスを失う可能性があります。 </li></ol></li><li>メディアは37℃。に温めてきた所望の薬物濃度を含有する培地の半分を交換してください部分的なメディアの交換は、熱ドリフトを低減することができます。この実験における条件は、車両（DMSO）、1μMのselinexorと10μMのPD0332991です。 注：このステップは、実験を一時停止し、再起動することにより、買収を開始した後もを行うことができます。これは、単一の細胞の前および後の薬物応答の長手追跡を可能にします。薬物安定性や代謝が懸念される場合は、一時停止と交換するメディアが同じ方法で行うことができます。薬剤分解または代謝を試験するために、処理された細胞からの培地はまた、薬物の作用を試験するためにナイーブな細胞上に配置することができます。 </li><li>タイムラプスを開始します。 </li><li>タイムラプスを実行すると、撮像されたフィールドがフォーカスとchambeに残っていることを確認してくださいrは湿度の高い37℃。を維持します<ol><li>時点間の時間のギャップの間に取得を一時停止することにより、必要に応じてフォーカスを調整します。 </li></ol></li><li>必要に応じて、より長い実験中にチャンバに水を追加します。 37 O℃で予熱した、滅菌蒸留水を添加することにより、チャンバを冷却する避けます</li></ol> 8.タイムラプスエンディング<ol><li>実験が完了するまで実行したとき、それが自動的に停止するように設定されていない場合、取得を停止します。 </li><li>正常に完了していないデータが失われる可能性があれば、ほとんどのソフトウェアパッケージを自動的に取得中に保存しているが、時間経過は、ハードドライブに正しく保存されていることを確認してください。 </li><li>顕微鏡からチャンバーを外し、承認機関バイオ安全手順に従ってバイオハザード廃棄物への細胞の処分。 </li></ol> 9.縦の追跡と分析時系列データの<ol><li>ある分析のための方法論を選択します。関心の生物学的プロセスのための適切な。 ImageJの、MATLABを使用したプログラム、およびカスタム・プラットフォームのための多くのプラグインは、特定の用途のために製造されています。 図4、図 5に示されているように、以下の方法論は、核と核の蛍光プローブの分析の追跡をカバーしています。 </li><li> ImageJの中で利用されるチャネルのための.tif画像スタックを開きます。また、Bioformatsプラグインを使用して、ImageJの中で直接取得プログラムからネイティブファイルを開きます。 </li><li> （使用する場合）明視野画像または核ラベルチャネルを使用して、1つの細胞の核内に関心領域（ROI）を描き、ROIマネージャーに追加します。注：画像化された細胞は核ラベルを持っている場合（ 例えば 、ヒストンH2B-EGFP。）、その後自動細胞追跡は時間を通じて興味（ROIを）個々の核を表すの領域を作成するために利用することができます。 </li><li>次の時点に進み、同じnucleu内のROIを配置秒。 ROIマネージャーにROIを追加します。 </li><li>追跡し、細胞事象（有糸分裂、アポトーシス、 など 。）又は細胞がもはや追跡することはできませんがあるまで、個々の細胞のためのROIを作り続ける（ すなわち 、フレームの外に移動するか、実験は終了）。 </li><li> ROIは、彼らがフィールドにいる時間を介して細胞のために確立されている場合には、関心の蛍光チャネルにそれらを重ね合わせます。すべての時点について、各チャネルにおける蛍光の平均強度を測定します。後で使用するためにROIのリストを保存します。 <ol><li>種々の測定は、異なる実験における用途のためのROI内で行うことができます。分析→設定の測定をクリックして...分析方法を選択するメニューを表示する（ 例えば 、ROI内の平均強度、積分強度、 等 。）。 </li></ol></li><li>追跡しながら、個々の細胞（ 例えば 、アポトーシス、分裂、生存）のための細胞の運命に注意してください。これは、生存曲線とfurtheを作成できますrの人口分析。 </li><li>両方のチャネルの平均強度で、治療（ 図5B、C）に応答して細胞周期動態を表示する散布図を作成します。 注：プロットは、経時的に個々のセルのために作成または追跡細胞集団にわたって平均化することができます。定量的イメージングは​​、癌治療に応答して、複雑な応答と細胞の関係を確立するために重要になる場合があります。長期タイムラプス顕微鏡、縦追跡およびデータ分析は、顕微鏡および分析ツールのタイプのための多くのオプションで、多段階のプロセスであり、 図1に提供される一般的な概要を次の。 </li></ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

タイムラプス顕微鏡と縦トラッキングのメリット それは研究者が個々の細胞とその運命だけでなく、全人口を追跡することを可能にするよう顕微鏡は、薬剤応答の縦断的研究のための理想的な楽器です。細胞の集団内で薬物応答における変動は、抗癌治療設計のための主要な問題です。単一細胞の長手方向の追跡は、研究者がこの変動を観察し、それが細胞集団に関連した根底にあるメカニズムと影響を理解し始めることができます。蛍光プローブの様々な利用することは一般的で、まれ両方の応答の表現型を観察し、理解するための多くの方法を提供します。タイミングと異なる細胞運命の寄与人口の応答に、特定の表現型と運命の間の関係、および処理時の細胞株または状態間の応答の違いを学ぶことができるものの例です。多くの癌関連プロセスを研究することができます。この記事で強調表示されていないいくつかは、アポトーシス、オートファジーと細胞死、および壊死記者39-42、細胞浸潤43,44、および細胞運命決定27を決定したp53のダ...

単一細胞の生細胞の顕微鏡縦追跡は新しい技術ではありません。最古の顕微鏡から、愛好家や科学者は、単一の細胞および生物、彼らの行動、および開発1-3を観察し、研究しています。 1950年代のバンダービルト大学の後期のデビッド・ロジャースからの有名な例は、 黄色ブドウ球菌の菌と食作用4の最終的過程を追いかけて血液塗抹標本中のヒト好中球を示しています。化学勾配の検知、力学および細胞運動性、細胞の形状のダイナミクス、接着、および病原体の食作用の速度：この生細胞ムービーは、単一の実験で観察され、相関させることができるか、複数のプロセスの優れた説明図です。 完全に自動化された顕微鏡や高感度デジタルカメラの出現がfの範囲の細胞生物学の基本的な質問をするために顕微鏡を用いて研究者数の増加をもたらしました細胞は5,6を移動し、ダイナミクスや膜輸送9-11をオルガネラする7,8分割の仕方ROM。 1953年にフリッツ・ゼルニケのためのノーベル賞を獲得し、位相コントラスト（PC）を含む非蛍光、明視野顕微鏡、、、および微分干渉コントラスト（DIC）は、微小管の束を含む細胞および核だけでなく、サブ細胞構造の観察を可能に、染色体、核小体、細胞小器官ダイナミクス、太いアクチン繊維12。遺伝的にコードされる蛍光タンパク質や細胞小器官に対する蛍光色素の開発が飛躍的にタイムラプス顕微鏡13-15に影響を与えています。この記事の焦点ではないが、共焦点および多光子顕微鏡を用いて細胞スフェロイドにおけるその場 （生体顕微鏡） で撮像がアプローチの別の拡大を表しており、使用してこれらのアプローチを16-19を議論する優れた記事があります。 抗CANCに対する細胞の応答えー薬または天然物は、分子や細胞スケールで決定されます。治療後の細胞応答と運命を理解することは、多くの場合、免疫蛍光検出に人口平均化アッセイ（ 例えば 、免疫ブロット法、全ウェル対策）、または固定の時点を含み、単一の細胞を測定する、フローサイトメトリー。集団内の薬物への単一細胞応答の不均一性は、腫瘍において特に飽和で同じ薬物で処置された細胞株および腫瘍全体で見られる応答の変動のいくつかを説明することができます。指定された単一の細胞または細胞の集団を追跡する縦のアプローチ長期的には、分子応答経路の直接的な研究を可能にするあまり一般的ではないが、非常に強力なアプローチである、の異なる表現型（ 例えば 、細胞死や細胞分裂）、観察細胞と細胞の集団内で変動し、どのようにこれらの要因は、人口の応答ダイナミクス20-22に貢献しています。楽観的、できること単一細胞の反応を観察し、定量化するためには、薬物は、彼らが時々失敗する理由、仕事、そしてどのように最高のそれらを使用する方法の我々の理解を向上させるのに役立ちます。 長期的タイムラプス顕微鏡、縦追跡、および薬物応答の解析の手法は、多くの研究者に利用可能であると表現型の応答20,21を観察する透過光のみを使用して、シンプルにすることができます。アプローチの主なコンポーネントは以下のとおりです。目的の細胞の適切な準備、環境室と自動顕微鏡、画像を取得し、保存するためのコンピュータと一体化したカメラ、および時間経過と対策を検討し、細胞を分析するためのソフトウェアを任意の蛍光バイオセンサー。私たちは、明視野および/または広視野落射蛍光顕微鏡を使用している限り、数日間培養した細胞のタイムラプス顕微鏡検査を行うための多くのヒントを詳細なプロトコルを提供します。このプロトコールは、培養で増殖させることができる任意の細胞株のために使用することができます抗癌治療への応答を研究します。我々は、取得したデータの例を提供し、複数の異なる遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーおよび位相差顕微鏡の例を用いて分析し、簡単に何をすることができ、プローブの異なる種類の、長期の時間経過、縦トラッキングの長所と短所を議論します非直接アプローチ、そして我々はアプローチを使用して考えていない経験の浅い研究者、および経験豊富な研究者に興味や価値があることを願っていますいくつかのバリエーションから理解することは困難である。このアプローチを学びました。

<table><tbody><tr><td>タキソール(パクリタキセル)</td><td>シグマ</td><td>T7191</td><td>微小管安定化薬</td></tr><tr><td>エトポシド</td><td>セレックケム</td><td>S1225</td><td>トポイソメラーゼII阻害剤</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1 / CRM1阻害剤、ギフト</td></tr>キ<tr><td>ネシン-5阻害剤</td><td>メルクセローノ</td><td>na</td><td>ギフト、アメリカンカスタムケミカルズコーポレーションからも入手可能です。CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>細胞増殖培地</td><td>HyClone(フィッシャー)またはMediatech</td><td></td><td>多くの企業が利用可能</td></tr><tr><td>5% CO2/バランス空気、認定</td><td>エアガス</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mmディッシュ、20 mmガラス底</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>多くの企業が利用可能</td></tr><tr><td>35 mm 4ウェルディッシュ、20 mmガラス底</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>多くの企業が利用可能</td></tr><tr><td>35 mm皿、格子ガラス底</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>多くの会社が利用可能</td></tr><tr><td>マルチウェル、ガラス底</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>多くの会社が利用可能</td></tr><tr><td>オリンパスIX81 倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリンパスIX2-UCBコントローラー</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III電動ステージ</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV chamber</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>環境コントローラーユニット</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECUです。HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>浜松 オルカ R2 CCD コントローラー付</td><td>浜松</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン レーザー打ち上げ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA ライトエンジン</td><td>ルーメンコール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT inclubation chamber</td><td>東海ヒット</td><td>ティッシュ</td><td></td></tr></tbody></table>

鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

抗癌剤への単一細胞の応答は、集団の応答を決定する際に有意に寄与し、したがって、全体的な結果の主要な要因です。イムノブロッティングは、フローサイトメトリーおよび固定細胞実験は、多くの場合、細胞が抗がん剤への対応方法を研究するために使用されています。これらのメソッドは重要ですが、彼らはいくつかの欠点を持っています。癌細胞と正常細胞の間で、異なるがん由来の細胞、および過渡希応答の間の薬物応答における変動性は、集団平均化アッセイを使用して直接追跡し、長手方向にそれらを分析することができることなく理解することは困難です。顕微鏡は、画像の生細胞に特に適しています。技術の進歩だけでなく、細胞の追跡だけでなく、様々な細胞応答の観察を可能解像度で日常画像セルに私たちを有効にします。私たちは、の連続タイムラプスイメージングを可能にする詳細なアプローチについて説明します基本的に限り、一般的に96時間まで、所望のようにのための薬剤応答中に細胞。アプローチのバリエーションを使用して、細胞が週間モニターすることができます。遺伝的にコード化された蛍光バイオセンサーの採用により多数のプロセス、経路および応答が続くことができます。我々は、追跡し、細胞増殖および細胞周期進行、染色体ダイナミクス、DNA損傷の定量化、および細胞死を含む例を示します。我々はまた、技術とその柔軟性のバリエーションを議論し、いくつかの一般的な落とし穴を強調表示します。

長期タイムラプス顕微鏡と直接縦トラッキングは、薬物応答の間に多くの抗がん効果の研究を可能にします。 図1の概要に続いて、細胞の複数の例は、抗がん剤で処理し追跡し、異なるアプローチを用いて分析することを検証した蛍光レポーターを発現して示されています。 単独の位相差顕微鏡は、非常に有益であるとロバスト有糸分裂、有糸分裂期間および停止、異常な細胞分裂、および細胞死21,23,24対間期に報告します。細胞分裂を標的とする薬剤、多くの場合、抗有糸分裂薬と呼ばれる、開発され続けている。彼らのp53の状態が異なるだけでマッチした乳癌由来MCF7細胞株のペアの2 作品1及び図2の例を図 、500で処理されましたその標的抗がん剤の種類のnMのそして長引く有糸分裂20で得られた有糸分裂モータータ...

ここでは、抗がん治療薬に応答して単一細胞を縦断的に追跡する長期のタイムラプス顕微鏡法について説明します。

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

この手順の目的は、培養された単一細胞における抗がん剤治療への応答を観察することです。この手法は、不均一な治療応答や細胞の運命など、がん研究分野における重要な課題に対する回答を導き出すことができます。まず、認証済みの無菌ラミナーフローフード内で、テキストプロトコルに従って培養認証済みディッシュにHT1080細胞を調製し、加湿された細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。イメージングの2日前までに、12ウェル、No. 1.5ガラスボトムディッシュの必要な数のウェルに、HT1080 FuGENE細胞を1ウェルあたり50,000個ずつ播種します。実験開始時にコンフルエンシーが約60%になるよう、細胞の増殖速度や使用するディッシュに応じて播種細胞数を調整してください。環境チャンバーを湿度約80%に設定し、サンプル位置の温度を37°Cに設定します。メーカーの指示に従い、ウォーターリザーバーに滅菌蒸留水が満たされていることを確認してください。その後、環境チャンバーの電源を入れ、希望の温度設定にしてから、顕微鏡ステージに配置して固定します。ステージトップチャンバーとステージインセットの間に隙間がある場合は、チャンバーを挿入する前に、ステージインセットの開口部の縁にパラフィンフィルムを敷き、チャンバーをステージに固定します。チャンバーを引っ張る接続部がないことを確認してください。これらのいずれもモーションアーティファクトの原因となります。水を入れたダミーディッシュをチャンバーに挿入し、チャンバーを37 °Cまで平衡化させ、安定した温度を維持します。イメージングの準備として、顕微鏡、コンピューター、および必要な周辺機器の電源を入れます。光源の種類に応じて、使用するまで点灯を待機してください。対物レンズターレットを低位置にし、20x 0.7開口数対物レンズを選択します。次に、サンプルを対物レンズの上に配置します。これにより、サンプルをチャンバーに入れた際に細胞を見つけやすくなります。テキストプロトコルに従い、イメージングする細胞を環境チャンバーに移動させた後、チャンバーを密閉して安定した環境を維持し、雰囲気ガスをオンにします。次に、露光時間を制限し、低強度の光を使用することで、光毒性を防止するイメージング条件を選択します。X、Y、Z平面、およびイメージングを行う各ポジションで必要とされる波長を決定します。ほとんどの細胞プロセスの長期タイムラプス観察では、10〜20分ごとに1枚の画像を撮影してください。時間分解能を高めれば、より多くのデータポイントが得られ、細胞トラッキングの堅牢性が向上しますが、積算光量が増加し、データセットが大規模になります。HT1080 FuGENEは動的な緑色および赤色の蛍光タンパク質を有しているため、以下の露光時間を適用し、2×2ビニングを使用します。詳細設定において、デフォルト設定を用いてソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。推奨されるステップサイズで、10 µmのオートフォーカス範囲を設定してください。熱ドリフトを軽減するため、実験用ディッシュ内の培地の半分を、37 °Cに温めた目的の薬剤を含む培地と交換します。最後に、タイムラプス撮影を開始し、テキストプロトコルに従って画像を収集します。これらの動画は、p53の状態のみが異なる、乳がん由来のMCF7細胞株のペアの例を示しています。これらの細胞にキネシン-5を阻害する抗がん剤を投与した結果、有糸分裂停止が引き起こされました。この図で示されているように、安定的なp53ノックダウンによってp53が除去されると、細胞は有糸分裂を抜けた後に停止するのではなく、停止せずに2回目の有糸分裂に入るというサイクルを繰り返し、細胞分裂を伴わずに有糸分裂を終了します。ここでは、クロマチンマーカーであるHistone 2b-mCherry融合タンパク質およびbeta tubulin-EGFP融合タンパク質を安定的に発現させた子宮頸癌由来のHela細胞を示しています。微小管安定化薬であるpaclitaxolで処理すると、有糸分裂中の染色体の整列と分離が妨げられ、その結果、DNA損傷が起こりやすい核の膨起や微小核が形成されます。この細胞株は、CDT1（オレンジ色）とgeminin（緑色）の2つの蛍光ユビキチン細胞周期インジケーターを安定的に共発現しており、正常に細胞周期を進行します。これらの細胞をCDK46阻害剤で処理すると、細胞はG2期を通過して正常に分裂しますが、その後G1期で強力に停止し、増殖中の腫瘍に対して有効な細胞静止効果を持つ可能性が示されます。本手法の主な利点は、単一細胞の応答を推測するのではなく、数日間にわたって直接リアルタイムで追跡できることです。

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このビデオは、マウスモデルで腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送を追跡する方法を示しています。ルシフェラーゼ形質導入エフェクターT細胞を、皮下腫瘍細胞異種移植片を有するマウスに注入する。次に、二重特異性抗体が導入され、T細胞と腫瘍細胞に結合します。T細胞の局在は、生物発光イメージングを使用して追跡され、シグナルの大きさは腫瘍へのT細胞浸潤の程度を示します。...

二重特異性抗体誘導性T細胞の腫瘍への輸送を追跡するためのin vivo技術

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。...

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このプロトコルでは、イメージの居住者腫瘍浸潤 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍スライス内結合蛍光抗体で標識する方法について説明します。この手法は、共焦点顕微鏡を用いた CD8 T...

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。...

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。...

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。...

M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin...

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

この研究は、小児びまん性正中線グリオーマ細胞株に適用される生3D細胞免疫細胞化学のプロトコルを提示し、3D細胞の浸潤や遊走などの動的プロセス中の原形質膜上のタンパク質の発現をリアルタイムで研究するのに役立ちます。...

小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ

ここでは、抗腫瘍効果とT細胞関与二重特異性抗体のメカニズムを評価する研究において、腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の in vivo 追跡を容易にするために、ルシフェラーゼでヒトT細胞を形質導入する方法について説明します。...

ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

このプロトコルは、細胞膜タンパク質のナノスケール空間的組織を解消するための単一抗体標識(SAL)を記述しています。抗体とエピトープの累積相互作用を単一分子レベルで活用することで、膜SAL(mSAL)は局所的なエピトープ分布をマッピングしつつ、同時にネイティブ細胞環境における抗体結合挙動を捉えます。...

膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

学ぶ単一細胞のタイムラプス顕微鏡法を用いた抗がん治療薬応答の長期観察法。HT1080細胞を用いて異質な治療応答と細胞運命をリアルタイムで追跡し、がん治療の効果と耐性メカニズムの理解を深める。

鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

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