鏡の国のアリス：単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

この手順の目的は、培養された単一細胞における抗がん剤治療への応答を観察することです。この手法は、不均一な治療応答や細胞の運命など、がん研究分野における重要な課題に対する回答を導き出すことができます。まず、認証済みの無菌ラミナーフローフード内で、テキストプロトコルに従って培養認証済みディッシュにHT1080細胞を調製し、加湿された細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。

イメージングの2日前までに、12ウェル、No. 1.5ガラスボトムディッシュの必要な数のウェルに、HT1080 FuGENE細胞を1ウェルあたり50,000個ずつ播種します。実験開始時にコンフルエンシーが約60%になるよう、細胞の増殖速度や使用するディッシュに応じて播種細胞数を調整してください。

環境チャンバーを湿度約80%に設定し、サンプル位置の温度を37°Cに設定します。メーカーの指示に従い、ウォーターリザーバーに滅菌蒸留水が満たされていることを確認してください。その後、環境チャンバーの電源を入れ、希望の温度設定にしてから、顕微鏡ステージに配置して固定します。

ステージトップチャンバーとステージインセットの間に隙間がある場合は、チャンバーを挿入する前に、ステージインセットの開口部の縁にパラフィンフィルムを敷き、チャンバーをステージに固定します。チャンバーを引っ張る接続部がないことを確認してください。これらのいずれもモーションアーティファクトの原因となります。水を入れたダミーディッシュをチャンバーに挿入し、チャンバーを37 °Cまで平衡化させ、安定した温度を維持します。

イメージングの準備として、顕微鏡、コンピューター、および必要な周辺機器の電源を入れます。光源の種類に応じて、使用するまで点灯を待機してください。対物レンズターレットを低位置にし、20x 0.7開口数対物レンズを選択します。

次に、サンプルを対物レンズの上に配置します。これにより、サンプルをチャンバーに入れた際に細胞を見つけやすくなります。テキストプロトコルに従い、イメージングする細胞を環境チャンバーに移動させた後、チャンバーを密閉して安定した環境を維持し、雰囲気ガスをオンにします。次に、露光時間を制限し、低強度の光を使用することで、光毒性を防止するイメージング条件を選択します。

X、Y、Z平面、およびイメージングを行う各ポジションで必要とされる波長を決定します。ほとんどの細胞プロセスの長期タイムラプス観察では、10〜20分ごとに1枚の画像を撮影してください。時間分解能を高めれば、より多くのデータポイントが得られ、細胞トラッキングの堅牢性が向上しますが、積算光量が増加し、データセットが大規模になります。

HT1080 FuGENEは動的な緑色および赤色の蛍光タンパク質を有しているため、以下の露光時間を適用し、2×2ビニングを使用します。詳細設定において、デフォルト設定を用いてソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。推奨されるステップサイズで、10 µmのオートフォーカス範囲を設定してください。

熱ドリフトを軽減するため、実験用ディッシュ内の培地の半分を、37 °Cに温めた目的の薬剤を含む培地と交換します。最後に、タイムラプス撮影を開始し、テキストプロトコルに従って画像を収集します。これらの動画は、p53の状態のみが異なる、乳がん由来のMCF7細胞株のペアの例を示しています。これらの細胞にキネシン-5を阻害する抗がん剤を投与した結果、有糸分裂停止が引き起こされました。

この図で示されているように、安定的なp53ノックダウンによってp53が除去されると、細胞は有糸分裂を抜けた後に停止するのではなく、停止せずに2回目の有糸分裂に入るというサイクルを繰り返し、細胞分裂を伴わずに有糸分裂を終了します。ここでは、クロマチンマーカーであるHistone 2b-mCherry融合タンパク質およびbeta tubulin-EGFP融合タンパク質を安定的に発現させた子宮頸癌由来のHela細胞を示しています。微小管安定化薬であるpaclitaxolで処理すると、有糸分裂中の染色体の整列と分離が妨げられ、その結果、DNA損傷が起こりやすい核の膨起や微小核が形成されます。

この細胞株は、CDT1（オレンジ色）とgeminin（緑色）の2つの蛍光ユビキチン細胞周期インジケーターを安定的に共発現しており、正常に細胞周期を進行します。これらの細胞をCDK46阻害剤で処理すると、細胞はG2期を通過して正常に分裂しますが、その後G1期で強力に停止し、増殖中の腫瘍に対して有効な細胞静止効果を持つ可能性が示されます。本手法の主な利点は、単一細胞の応答を推測するのではなく、数日間にわたって直接リアルタイムで追跡できることです。