光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

この手順の全体的な目標は、光ファイバーを使用した液滴マイクロ流体蛍光検出の簡単なアプリケーションを実証することです。この方法は、希少な表現型の同定や酵素の指向性進化など、ハイスループットの生物学的スクリーニングにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、液滴マイクロ流体工学における蛍光検出を簡単かつ安価に応用できることです。

まず、事前に洗浄された直径3インチのシリコンウェーハをスピンコーターの真空チャックに置きます。次に、ウェーハの中央にSU-8 3050を1ミリリットル塗布し、ウェーハを回転させて厚さ80マイクロメートルのフォトレジストの層を作ります。コーティングされたウェーハをスピンコーターから取り出し、摂氏135度に予熱したホットプレートに置きます。

30分後、ウェーハを取り出し、室温まで冷まします。次に、ウェーハを平らな面に置き、最初のレイヤーマスクをウェーハに合わせます。コリメートされた190ミリワット、365ナノメートルのLEDの下にウェーハを3分間露光します。

露光後、ウェーハを摂氏135度のホットプレートに1分間置き、室温まで冷まします。冷めたら、ウェーハをスピンコーターに戻し、チャックに貼り付けます。ウェーハの中央にSU-8 3050を追加ミリリットル塗布し、500rpmで20秒間回転させます。

5, 000 r.p.m. で 30 秒が続きます。次に、ホットプレートでウェーハを焼きます。室温まで冷ましてから、マスクの位置合わせ面に戻します。

解剖スコープを使用して、2番目のレイヤーマスクをウェーハ上のパターン化されたアライメントマークに手動で位置合わせします。適切に位置合わせされたら、コーティングされたウェーハを以前と同じ条件で4-1 / 2分間露光します。露光後、ウェハを135°Cのホットプレートに1分間置き、ウェハを冷却してスピンコーターに再度貼り付けます。

SU-8 3050を1ミリリットルのウェーハに3回目に塗布し、回転させてさらに100μmのフォトレジストを追加します。ウェーハを取り出し、摂氏135度のホットプレートで30分間焼きます。その後、室温まで冷却し、整列面に置きます。

3 番目のレイヤー マスクを前のジオメトリに位置合わせし、コーティングされたウェーハを前の条件で 9 分間露光します。露光後、ウェーハを摂氏135度のホットプレートに1分間置き、室温まで冷却します。冷めたら、ウェーハを現像液の攪拌槽に30分間浸してマスクを現像します。

最後に、ウェーハをイソプロパノールで洗浄し、最後にもう一度、摂氏135度のホットプレートで1分間焼きます。開発したマスターは、100mmのシャーレに成形するまで保管します。プラスチックカップに50gのシリコンベースと5gの硬化剤を混ぜ合わせて、PDMSを10:1で混合します。

回転工具で内容物を混合し、デシケーター内で30分間、またはすべての気泡が除去されるまで混合物を脱気します。脱気したPDMSを準備したマスターに注ぎ、厚さ3mmにします。次に、ペトリ皿をデシケーターに戻し、さらにガス抜きします。

すべての気泡を取り除いたら、デバイスを摂氏80度で80分間焼きます。冷却したら、メスを使用してデバイスを型から切り取り、120マイクロメートルと220マイクロメートルの両方のテレジオメトリがデバイスの側面からアクセスできるようにします。次に、0.75mmの生検パンチで流体の入口と出口を打ち抜きます。

プラズマ処理は、300ワットのプラズマクリーナーで、事前に洗浄されたスライドガラスと1ミリバールの酸素プラズマとともに、機能面を上にしてデバイスを処理します。PDMSデバイスのパターン面をスライドガラスのプラズマ処理面にしっかりと配置して、デバイスを接着します。次に、デバイスを摂氏80度のデバイスオーブンに入れ、組み立てたデバイスを40分間戻します。

ベーキングしたら、シリンジを使用してフッ素化表面処理液でデバイスを洗い流し、チャネルを疎水性にします。次に、すぐにデバイスを摂氏80度で10分間焼き、溶媒を蒸発させます。光ファイバーの最後の5ミリメートルから絶縁体を剥がすことにより、2本のレーザー励起ファイバーを準備します。

また、より大きな光ファイバーの最後の5ミリメートルから絶縁体を剥がすことにより、蛍光信号を収集するためのファイバーを準備します。顕微鏡ですべての繊維の先端を検査します。先端が平らな面で終わらない場合は、ファイバースクライブで端をクリートします。

次に、50ミリワット、405ナノメートルのレーザーにレーザーファイバーカプラーを取り付け、105マイクロメートルのコアファイバーの1つをレーザーに取り付けます。レーザーパワーメーターのセンサーの剥がれた端を向け、レーザーカプラーの微調整を使用してレーザーパワーを最大化します。同じプロセスを実行して、50ミリワット、473ナノメートルのレーザーを使用して他のファイバーを調整します。

次に、レンズチューブを使用して光増倍管にクワッドバンドパスフィルターを取り付け、レーザー光を遮断して放出された蛍光を透過します。光がフィルターを通過してから光増倍管に当たるように、ファイバーカプラーを取り付けます。次に、集光ファイバーをファイバーカプラーに取り付けます。

作製したマイクロ流体チップを倒立顕微鏡のステージに置き、デジタルカメラと100マイクロ秒以上のシャッタースピードを実現します。側面から慎重に作業しながら、473ナノメートルレーザーに結合されたファイバーを最も遠い上流の120マイクロメートルチャネルに挿入します。メインフローチャネルに穴を開けないように注意してください。

次に、405ナノメートルのレーザーに結合されたファイバーを最も下流の120マイクロメートルのハイサイドチャネルに挿入し、300マイクロメートルのファイバー間隔を提供します。最後に、大きい方の光電子増倍管結合ファイバーを、2つのレーザー励起ファイバーに垂直な高さ220マイクロメートルのチャネルに挿入します。2%イオン性フッ素界面活性剤を含むHFE 7500を充填した5ミリリットルのシリンジに充填し、PE2チューブを使用して検出デバイスのスペーサーオイル入口に取り付けます。

次に、FITCと青色染料の混合エマルジョンをシリンジに充填し、PE2チューブを使用して液滴再注入インレットとしてデバイスに結合された垂直配向シリンジポンプに取り付けます。デバイスの出口から廃棄物容器にPEチューブの長さを接続します。次に、各ポンプを1時間あたり1, 000マイクロリットルで運転して、油と液滴の両方が装置内で規則的に結合して下流に流れているのが見えるまで、装置をプライミングします。

スペーサーオイルが毎時6, 000マイクロリットルで、液滴が毎時100マイクロリットルで動作するように流量を調整し、検出領域を通過する液滴間の大きな間隔を提供します。次に、レーザーをオンにして、データ取得プログラムを開始します。次に、光電子増倍管のゲインを調整して、ベースラインのノイズフロアの100倍を超える信号を提供します。

最後に、すべてのダブレットピークが単一の直線的にスケーリングされた時間トレースではっきりと見えるように、レーザー出力を調整します。検出チャネルを流れる液滴は、レーザー結合された各光ファイバーの前で離散的な励起領域に遭遇します。検出ファイバーは、液滴が1つの励起領域から次の励起領域に移動するのにかかる時間と相関するピーク分離を伴う時間シフトで放出された蛍光を記録します。

これにより、さらなる光フィルタリングや個別の光増倍管が不要になります。検出スキームの有効性は、405ナノメートルおよび473ナノメートルで励起する色素を含む液滴の混合エマルジョンを検出することによって試験された。このグラフは、約50ヘルツで流した場合に再注入された4種類の液滴が明確に分離されていることを示しています。

検出器のダイナミックレンジと絶対感度は、フルオレセインのみの液滴を測定することによって調査しました。このデータは、0.1〜100ナノモルの範囲の染料濃度を検出するシステムの能力を示しています。このビデオを見れば、挿入された光ファイバーの配列と単一の光検出器を利用して、シンプルでコンパクトな蛍光検出システムを実装する方法を十分に理解できるはずです。