Name: 創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ神経幹細胞を用いた上皮間葉転換（EMT）のin vitroモデル。非遊走性細胞の遊走誘導と創薬化合物の同定に適した手法です。がん浸潤メカニズムの解明に貢献します。

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研究は、MHSとAG（SNF IZLIZ3_157230）への助成金によってバーゼル科学財団の大学、スイス国立科学財団によってサポートされていました。私たちは感謝：博士タニアリナルディBurkatを寛大にインフラを提供するため。議論やコメントのBettlerグループのすべてのメンバー。我々は、フルHD MC170ビデオカメラ（ライカマイクロシステムズ、スイス）の専門的かつ有能なインストールのためのゲルハルトDorne（ライカマイクロシステムズ、スイス）をお願いいたします。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この研究でのNSCを用いたEMTの分析のための標準化されたシステムは、（ 補足図3にまとめた）に記載されています。標準化は、再現性（ 表1および2）を保証します。 NSCを現像皮質、通常はEMTを受けない組織に由来します。これは、EMTにおける初期段階の分析のために有利です。 EMTにおける最初のステップは、十分に遺伝的変化を蓄積してきたし、既にEMTの機能を採用していることが、腫瘍細胞で研究することはできません。ほとんどの悪性腫瘍が異種の侵襲性および非侵襲性細胞の両方を含有しているので、一次腫瘍サンプルは、EMTを理解することが理想的ではありません。提示されたプロトコルは、EMT誘導の初期段階を研究するための新規モデルとEMTの研究者を提供します。ここでは、ゼブとツイスト・ファミリーのキーEMT誘導因子が順次活性化されていることを示しています。最初の段階の間にZEB1とZEB2がアップレギュレートされ、第二段階Twist2中に（FigurE 6）。以前、我々はSnail1はすでにBMP4-暴露8の数時間後にアップ...

胚発生のいくつかの段階では、上皮細胞は互いに（ 例えば、タイトジャンクション）への強い接着性を失い、間葉移行（EMT）に上皮と呼ばれるプロセスで渡り鳥の表現型を獲得する1。 EMTは、間葉系、神経堤細胞のような追加の細胞型、神経上皮2から分離する集団の形成に必要とされます。 EMTは、胚の段階ではないだけに不可欠であるだけでなく、創傷治癒3および中枢神経系（CNS）病変4脱髄における再生などの成体生物における生理学的プロセスを、維持するために、成人期の後の段階で必要。 上皮性腫瘍は、最終的に癌の進行1,3につながる、移動、浸潤や転移の開始段階として、EMTを再活性化することが知られています。 EMTは確かに集中強いマイグレーション1,3にリンクされています。 Cのセルラーステップonditioning、開始受けるとEMTを維持することは十分に理解し、さらなる調査を必要としていません。 ここでは、定義された成長因子とメディア（無血清および無酵素の使用量）とのNSCに基づいて標準化されたin vitroで EMTモデル系は、提示されています。このモデル系は、EMTの作業科学者のための関連性です。カタツムリ、ゼブとツイストのタンパク質ファミリーは、両方の開発や病気1におけるEMTのために重要であることが示されています。カタツムリ、ゼブとツイスト家族も提示システムに関与しています。システムは、通常、EMTは、EMT誘導中の初期の事象の研究のために特別な利点を提供受けない前脳の特定の領域に基づいています。 このようなカタツムリ、ゼブとツイストタンパク質などのキーEMT誘導剤は、また、CNS外の組織・システムにおけるEMT中に発見されているので、モデルシステムは、潜在的に、CNS外の上皮にEMTを研究するために適用することができます。このモデルのystemは、一般、特にEMTにおける幹細胞の機能を研究するために開発皮質からNSCの標準化された単離を可能にします。このシステムを使用して、我々は、NSCを単離し、誘導されるEMTとFGF2及びBMP4の影響下で、その後の移行を検討しました。そこで我々は、モデル系の検証、FGF-およびBMPシグナリングは、細胞遊走を促進するTGFβシグナル伝達と相互作用することを観察しました。

<table><tbody><tr><td>BMP4, rhBMP4</td><td>RnDシステム&nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓インスリン</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>ボイデンチャンバー、CytoSelect 細胞浸潤アッセイ</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110</td><td>24 ウェルプレートシステム</td></tr><tr><td>グリッド付き細胞培養ディッシュ</td><td>イビディ 500 mm ディッシュ、35 mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>原形質膜染料、1:1,000 で使用。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>5 mg/mlで保存 1:10,000で使用。癌性。適切な保護具(手袋、コート、ゴーグル)が必要です。</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 中瓶</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD Systems</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン、ウシ</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックスサプリメント&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ピクセル測定機能を備えたグラフィックソフトウェア</td><td>フィジー</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>バージョン2.0.0-rc-30 / 1.49s</td></tr><tr><td>HBSSメディア</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>ヒト apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>肺刺激性の可能性があります。吸入を避けてください。適切な保護を使用してください。</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ネスチン、マウス抗ネスチン抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>1:100、4% PFA 固定、Triton X100 0.1%</td></tr><tr><td>Olig2、ウサギ 抗 Olig2 抗体</td><td>Hirohide 竹林</td><td>個人株</td><td>1:2,000、4% PFA 固定、Triton X100 0.1%</td></tr> <tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンジゾン</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>ポドプラニン、マウス抗ポドプラニン抗体</td><td>アクリス</td><td>DM3614P</td><td>1:250、4% PFA 固定で使用し、Triton X100</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma</td> を避けてください。<td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>プトレシン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P5780</td><td>皮膚と目を刺激します。適切な保護が必要です。</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10、ウサギの抗Sox10抗体</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td>で<td>使用、1:200、4%PFA固定、0.1%</td></tr><tr><td>TGFb1、rhTGFb1</td>でTriton X100 <td>RnDシステム</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>コーティングされていないペトリ皿</td><td>Falcon Corning</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

創薬に適していemt調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

間葉移行（EMT）に上皮は、上皮が間葉への分化転換のプロセスについて説明します。 EMTはまた、一般的に最も頻度の高い悪性脳腫瘍、神経膠芽腫で発生胚発生時の基本的な過程です。 EMTは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌などの脳外の複数の癌において観察されています。 EMTは中心部に移動、浸潤や転移形成を促進することにより、悪性腫瘍にリンクされています。 EMT誘導のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、皮質の神経幹細胞（NSC）の標準化された単離およびその後のEMT誘導のためのin vitroの系を記述しています。このシステムは、単一細胞または移植片培養のいずれかを使用するための柔軟性を提供します。このシステムでは、ラットまたはマウス胚前脳NSCは、定義された培地で培養し、血清酵素を欠いています。 NSCはOLIG2及びSOX10、oligodendrocで観察された2つの転写因子を発現しましたYTE前駆細胞（OPCの）。このシステムを使用して、ZEB1、ZEB2、およびTwist2を含むFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間の相互作用は相乗BMP-/TGFβ-相互作用を示唆し、TGFβ活性化大幅に強化された細胞遊走を観察しました。結果は、FGF-、BMP-のネットワークを指し、EMTの誘導および維持に関与することがTGFβシグナリング。このモデル系は、in vitroで EMTを調査するために適切です。これは、コスト効率で、高い再現性を示しています。また、それらの移動応答（定量的な距離測定）に対する異なる化合物の比較を可能にし、EMTを阻害または増強する化合物のハイスループットスクリーニング（定性的測定）。モデルは、したがって、EMTに影響を与える物質の薬物ライブラリをテストするのに適しています。

このEMTモデル系は、単一の細胞として、または開発神経管の特定の領域、中央の皮質（ 図1および図 2）からの外植片の両方NSCの標準化された単離に基づいています。定量的評価のために、外植片を、500μmの格子培養皿（ 図3）の中央に右を播種しました。中央の皮質からの外植片は、第1の成長因子（ 表1）の異なる組合せでさらに2日間、続いて二日間FGF2に暴露しました。私たちは、発展途上の神経管の他の領域よりも大きい皮質から始まりました。我々は、BMP4で培養唯一の外植片が移動応答（ 表1と補足図2）を示したことを観察しました。 次ポドプラニン（PDPN）式が定義された条件の下で分析しました。 PDPNは貫通sであります複数...

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

本手順の全体的な目的は、通常は遊走しない細胞に遊走を誘導し、遊走を活性化または阻害する特定の化合物を同定することです。この手法は、細胞の遊走および浸潤の分野における重要な疑問を解決するのに役立ち、特に神経幹細胞を研究している科学者にとって有用であると考えられます。本技術の主な利点は、非遊走性および非浸潤性の細胞が、遊走性および浸潤性を獲得する過程で分析できることです。この手法の意義は、神経幹細胞由来と考えられているヒトの高グレードグリオーマで起こる、上皮間葉転換（EMT）を阻害する新規化合物の同定へと広がります。本手法はEMTや神経幹細胞に関する知見を提供できるだけでなく、乳癌、肺癌、大腸癌などの他の上皮性癌の研究にも応用可能です。胎生14.5日目に、ラット前肢における指の形成が始まり始めていることを確認し、ラット胚の週齢が正しいことを確認してください。次に、ステレオ顕微鏡下に配置し、氷冷したPBSを満たした個別の非コーティングペトリ皿に胚を移します。先みのピンセットを使用して、胚殻を取り除きます。胚は氷上の拡大培地内に保持してください。オートクレーブ滅菌した2本の精密ピンセットを使用し、発達中の終脳と間脳の接点から始めて、前方および後方に同時に引っ張ることで、頭部の皮膚と頭蓋骨を除去します。次に、中脳と後脳を分ける中脳後脳境界を特定し、その境界線上または直下で後脳を切断します。中脳のブロックをピンセットで保持しながら、頭蓋底における終脳・間脳と顔面骨との接続部位を切断し、終脳、間脳、中脳のブロックを、氷上のコーティングされていないペトリ皿に入れた拡大培地の中に浸します。すべての神経ブロックを同様の手法で採取した後、顕微鏡下で終脳、間脳、中脳のブロックを、冷却した新鮮なPBSへと移します。中脳を間脳から分離するために、まず間脳と終脳の間の組織を切断します。次に、2つの終脳半球を分離し、将来の間室孔を通じて視認できる内側および外側神経節丘を特定します。内側および外側神経節隆起と前方の皮質が交差する箇所に沿って直線的に切開し、続いて皮質、海馬、および脈絡叢を通る直線的に切開します。次に、尾側神経節隆起と後方の皮質が交差する箇所で、皮質、海馬、および脈絡叢を通る2本目の直線的な切開を行います。その後、終脳を平らに広げ、海馬と脈絡叢を含む皮質半球を特定します。皮質裾（cortical hem）を皮質から分離し、皮質の大きさが神経節丘（ganglionic eminences）の大きさと同一になるようにします。皮質と神経節丘のブロックを反転させ、脳室側をディッシュの表面に接し、髄膜が上を向くようにします。片手で神経節丘をディッシュの表面に固定し、もう一方の手でピンセットを用いて髄膜を剥がします。次に、各皮質を外側神経節丘の径の約半分ほどの深さで、外側神経節丘に沿って切断します。外植え培養を準備するため、必要に応じて解剖皿の下に400 µmのグリッドを基準として置き、皮質を直径400 µm未満の外植え片に切り出します。その後、すべての外植え片を、氷冷した新鮮な拡張培地が入ったペトリ皿に移します。次に、あらかじめコーティングした35 mmの組織培養ディッシュから過剰なフィブロネクチンを除去し、ディッシュを乾燥させます。その後、フィブロネクチンでコーティングしたディッシュを10 by 10 mmのグリッドの上に置き、ディッシュの中央に1 mLの冷えた拡張培地を加え、培地が球状の滴となるようにします。最大8つの外植片を、組織間に少なくとも3 mmの間隔を空けて、滴の中央に配置します。次に、外植片がフィブロネクチンでコーティングされた表面に付着するように、ディッシュを揺らさないよう注意して細胞培養インキュベーターに入れます。1時間後、増殖因子または目的の試験物質を添加した拡大培地を、最終容量が2 mLになるまでディッシュに満たし、プレートをインキュベーターに戻します。本実験では、外植片を500 µmグリッド培養ディッシュの中央に播種し、異なる増殖因子を用いて培養しました。コントロール群およびTGF Beta 1単独処理の外植片では、強い増殖が観察された一方で、遊走はほとんど見られませんでした。しかし、BMP4は細胞遊走と増殖の中間的な反応を誘導しました。BMP4とTGF Beta 1を併用した場合、全群の中で最も強い遊走と増殖が誘導されました。習得すれば、10～15個の胚から神経幹細胞を約2時間で単離することができます。この手順を行う際は、すべての胚と細胞外植えを氷冷した培地内で維持することが重要です。この費用対効果が高く再現性の高いシステムにより、単一細胞または外植え培養のいずれかを選択して、in vitroでの細胞の遊走および浸潤を研究できる柔軟性が得られます。大型のマルチウェルプレートで細胞を培養することで、さまざまな化合物が遊走および浸潤に及ぼす影響を並行して解析することが可能になります。さらに、このシステムは新規化合物のハイスループットスクリーニングに容易に適応させることができます。このビデオを視聴することで、発達中の皮質の適切な領域から、EMTを起こす可能性のある神経幹細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。

an-enzyme-serum-free-neural-stem-cell-culture-model-for-emt

Research

JoVE Journal

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生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

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ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

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