腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング
2016年6月12日
このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。
この手順の全体的な目標は、高解像度の生体内多光子ミルクロスピーを介して腫瘍微小環境内の動的イベントを視覚化することです。この方法は、血管透過性や多細胞相互作用に関与する動的イベントなど、腫瘍微小環境に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、腫瘍微小環境におけるイベントの動態を観察および測定できることです。
手順を開始する前に、2つの光子レーザーと検出器を含むすべての顕微鏡とレーザーコンポーネントの電源を入れます。そして、ヒーティングボックスを摂氏30度に設定して、ステージを予温します。顕微鏡ステージとステージインサートを70%エタノールで拭きます。
ステージが乾いたら、25 x 1.05 NA顕微鏡対物レンズに大量の水滴を当ててカバーガラスとの光学的接触を維持し、厚さ1.5のカバーガラスをインサートイメージングポートの上に置きます。次に、30センチメートルのポリエチレンチューブをカットします。ラバーパッドをカバーガラスの上に置きます。
鉗子を使用して、31ゲージの針をプラスチックフィッティングから切り離し、針ハブの鈍い端をチューブに挿入します。31ゲージの針をPEチューブのもう一方の端に挿入して取り付けます。次に、1 ccのシリンジに滅菌PBSを充填し、シリンジを31ゲージの針に取り付けます。
PBSを使用して、チューブとニードルからすべての空気を洗い流します。次に、適切な血管標識の200マイクロリットルと適切な注射可能なタンパク質を含む別の1ccシリンジ。手術を開始する前に、つま先のつま先つまみに反応しない適切な麻酔を確認し、麻酔をかけたマウスに眼軟膏を塗布します。
次に、動物をヒートランプの下の手術台に置き、尾の循環を促進します。2分後、尾部を70%エタノールで滅菌し、31ゲージカテーテルの先端を2〜3ミリメートル外側尾静脈に挿入します。次に、長さ1cmのラボテープをカテーテルに貼り付けて、針を尾の長さに沿って静脈と平行に保持します。
カテーテルが固定されたら、腹側と腫瘍の表面を70%エタノールで綿棒で拭きます。腹部の上で皮膚を持ち上げ、滅菌ハサミを使用して腹部の腹側正中線に沿って約1センチメートルの皮下切開を行い、腹膜に穴が開かないように注意します。乳腺と腫瘍を接着している結合組織を腹膜からそっと切って腫瘍を露出させます。
次に、はさみと鉗子を使用して、腫瘍の露出した表面から筋膜と脂肪をそっと取り除きます。腫瘍が露出したら、マウスを予温イメージングステージに移します。ラボテープを使用してカバーガラスを固定し、顕微鏡対物レンズのカバースリップを覆うゴムパッドの穴に腫瘍を置きます。
動物が所定の位置にあるときは、ゴム製のパッドチャンバーにPBSを充填して、組織の水分を保ち、カバースリップとの光学的接触を維持します。パルスオキシメータプローブカラーセンサーを首に巻いて動物のバイタルサインを監視し、ヒーティングボックスを動物の上に置きます。次に、顕微鏡IPを使用して、腫瘍の表面と血管が流れる領域にある蛍光腫瘍細胞に焦点を合わせます。
関心領域を選択したら、顕微鏡を多光子イメージングモードに切り替え、フォーカスアジャスターを使用して対物レンズを目的の開始位置に移動します。次に、Z位置の上部ボタンをクリックしてz級数の上限を設定し、第2高調波発生チャネルの腫瘍表面のコラーゲン線維ネットワークを視覚化します。次に、対物レンズを目的のイメージング深度に移動し、z位置下部ボタンをクリックしてzシリーズの下限を設定します。
次に、ステップサイズフィールドに目的の値を入力します。次に、タイムラプスパネルに切り替えて、適切なラプス時間を入力します。イメージングパラメータが決定されたら、カテーテルに取り付けられたシリンジを血管標識染料のシリンジと交換し、溶液が静脈に入るように注意しながら、最大200マイクロリットルの色素溶液をゆっくりと投与します。
注射後、PBSシリンジをカテーテルに戻し、zステップタイムラプスイメージングを開始します。すべての画像を取得したら、PBSのシリンジを注射用タンパク質の入ったシリンジに交換し、ラインに気泡が入らないように注意してください。次に、タンパク質懸濁液をマウスにゆっくりと注入し、シリンジをPBSを含むシリンジと交換します。
マクロファージは、貪食性ミクロファージに蓄積する蛍光標識70キロダルトンとデキストランで追跡できます。腫瘍細胞とマイクロファージを二重標識することで、これら2つの細胞タイプとの直接的な相互作用をリアルタイムで視覚化できます。腫瘍の血管透過性の変化を視覚化するために、量子ドットを使用して血管空間を標識することもできます。
それらは十分に大きいため、動脈間空間を通じて容易に拡散しません。連続的な高解像度イメージングにより、血管透過性のイベントの捕捉と、デキストランの血管外漏出とクリアランスの速度論の定量化が容易になります。この例の視野では、血管外TMR信号によって証明されるように、血管のジ血管外漏出のピークは29分から34分の間に観察されます。
血管透過性を誘導するために追加の血管色素またはタンパク質を注入することで、血管透過性を調節するシグナル伝達イベントについての洞察を得ることができます。実際、注射の最初の数秒以内に、10キロトンのデキストランFITCが血管系から血管外漏出するのを観察できますが、デキストランTMRの155キロダルトンは血管腔に限定されたままです。.このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了することができます。
この手順を試みるときは、腫瘍の表面を損傷することなく結合組織を穏やかに除去し、腫瘍表面を水分補給しておくことを忘れないでください。この手順の細胞ダイナミクスに従うと、このような腫瘍細胞の移動を視覚化して、腫瘍細胞の移動と血管内投与の方向性に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、生体間多光子顕微鏡法によって腫瘍微小環境における動的な細胞イベントを視覚化する方法を十分に理解しているはずです。
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概要
本プロトコルでは、腫瘍微小環境内の動的なイベントをリアルタイムで可視化するための多光子顕微鏡の使用方法について説明します。この手法により、単一細胞レベルの解像度で長時間のタイムラプスイメージングが可能となり、血管透過性や多細胞間相互作用に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 顕微鏡法
背景
- マルチフォトン顕微鏡により、高解像度のイメージングが可能になります。
- これは特に、生体組織の研究に有用です。
- 腫瘍微小環境は複雑でダイナミックです。
- 細胞間の相互作用を理解することは、がん研究において極めて重要です。
研究目的
- 腫瘍微小環境における動的なイベントを可視化する。
- 血管透過性のキネティクスを測定する。
- 生体内で多細胞間の相互作用を観察する。
使用した方法
- 生体内多光子顕微鏡観察。
- 長時間タイムラプスイメージング。
- 単一細胞解像度技術。
- 顕微鏡および試料ステージの準備。
主な結果
- 腫瘍微小環境における動的なイベントの可視化に成功した。
- 血管透過性の変化をリアルタイムで観察した。
- 多細胞間相互作用を高解像度で記録した。
- 本手法により、イベントのキネティクスを測定できることが示された。
結論
- マルチフォトン顕微鏡法は、がん研究における強力なツールです。
- リアルタイムイメージングにより、腫瘍生物学に関する貴重な知見が得られます。
- この技術は、がんのダイナミクスに対する理解を深めることができます。
よくある質問
産業界における重要性
腫瘍微小環境における多細胞ダイナミクスのリアルタイム可視化により、血管透過性や腫瘍細胞の運動性といった一過性のイベントを直接観察することが可能となり、これらは転移や血管新生を理解する上で極めて重要です。このアプローチは、エンドポイントアッセイでは捉えられない速度論的データを提供し、オンコロジーの標的検証におけるメカニズム的なリスク低減をサポートします。ストロマと腫瘍の相互作用の時間的分解能を捉えることで、本手法は前臨床モデルにおける予測の信頼性を高め、治療候補物質の優先順位付けを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 腫瘍の進行を促進するストローマと腫瘍の相互作用をリアルタイムで可視化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 生体組織における多細胞イベントの直接観察を通じて、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 予測的価値： 血管透過性と細胞運動性のキネティクスを測定し、パスウェイのデリスキングおよびポートフォリオの優先順位付けに役立てる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：腫瘍微小環境におけるベースラインのダイナミクスを確立することで、ダウンストリームスクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 運用の価値：デキストランの血管外漏出および時間経過に伴う消失の定量的な読み取りにより、アッセイの標準化を可能にします。
- 拡張性の価値：縦断的研究のための標準化された手術準備およびイメージングパラメータを通じて、プラットフォームの再利用を支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的価値： 生体マウスモデルにおいてヒトに近い多細胞相互作用を捉えることで、疾患との関連性を維持します。
- 前臨床の連続性： 血管透過性の速度論的バイオマーカーを提供することで、創薬研究と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定： 腫瘍微小環境調節のリアルタイムな機能的リードアウトに基づいた、Go/No-go判定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットのバリデーションから前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに組み込むことができ、作用機序研究の機能的リードアウトとして、血管透過性と細胞運動性のキネティクス解析を可能にします。
- 探索生物学：腫瘍細胞の移動方向および血管内浸入イベントをリアルタイムで可視化することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：29–34分の間のデキストラン血管外漏出ピークなどの定量的かつ時間分解された出力を提供し、化合物による効果の比較を可能にします。
- 分析：血管透過性と細胞クリアランスの速度論的曲線を生成し、用量反応およびターゲットエンゲージメントの分析を促進します。
- トランスレーショナルリサーチ：薬理学的調節後の血管動態における測定可能な変化を通じて、前臨床検証へと繋げます。
- 企業内での再利用：標準化された標識および手術プロトコルにより、オンコロジープロジェクト全体で繰り返し使用可能な生体内イメージングプラットフォームを構築します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：腫瘍-間質シグナル伝達経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、予測の信頼性を提供します。
- 運用的価値：標準化された血管標識、外科的処置、およびタイムラプス撮影パラメータにより、再現性を確保します。
- 戦略的価値：効果のないモジュレーターを早期に検出することを可能にし、後期段階での失敗リスクを低減させることで、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：リアルタイムの血管透過性変化を通じてターゲットエンゲージメントを定量化し、リスク調整後の開発推進をサポートします。
実施上の検討事項
- マルチフォトンの顕微鏡観察、生体内心手術、および蛍光標識戦略における専門知識が必要です。
- マルチフォトン対応の顕微鏡、波長可変レーザー、および第2高調波・蛍光チャネル用の高感度検出器に依存します。
- 標識プロトコル（例：血管用量子ドット、マクロファージ用デキストラン）およびイメージングパラメータのチーム間での標準化が必要です。
- 腫瘍モデル間での適応検討が必要であり、外科的アプローチの妥当性と光学窓の適合性の検証が求められます。
- 長時間のイメージングにおける光毒性のリスクによる制限があり、出力の最適化および動物のバイタルサインのモニタリングが必要です。
