腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

この手順の全体的な目的は、高解像度の生体内多光子顕微鏡を用いて、腫瘍微小環境内の動的なイベントを可視化することです。この手法は、血管透過性や多細胞間相互作用にどのような動的イベントが関与しているかなど、腫瘍微小環境に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、腫瘍微小環境におけるイベントのキネティクスを観察および測定できることです。

手順を開始する前に、2光子レーザーおよび検出器を含む、すべての顕微鏡およびレーザーコンポーネントの電源を入れます。また、ステージを予熱するため、ヒーティングボックスを30 °Cに設定します。顕微鏡ステージとステージインサートを70% ethanolで拭き取ります。

ステージが乾燥している状態で、カバーガラスとの光学的な接触を維持するために、25 x 1.05 NAの顕微鏡対物レンズに水の一滴を大きく滴下し、インサートイメージングポートの上に厚さ1.5のカバーガラスを配置します。次に、ポリエチレンチューブを30 centimeterの長さに切断します。カバーガラスの上にラバーパッドを置きます。

ピンセットを使用して、31ゲージの針をプラスチック製継手から切り離し、針ハブの鈍端をチューブに挿入します。PEチューブのもう一方の端に31ゲージの針を挿入し、取り付けます。次に、1 ccシリンジに滅菌PBSを満たし、そのシリンジを31ゲージの針に取り付けます。

PBSを使用して、チューブと針からすべての空気を押し出します。次に、1 ccシリンジ1本に200 µLの適切な血管ラベルを、もう1本のシリンジに適切な注入用タンパク質を充填します。手術を開始する前に、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことで適切な麻酔状態であることを確認し、麻酔下にあるマウスに眼軟膏を塗布します。

次に、動物を加熱ランプの下の手術台に置き、尾の血行を促進させます。2分後、尾を70% ethanolで滅菌し、31ゲージのカテーテルの先端を外側尾静脈に2〜3 mm挿入します。その後、1 cmのラボテープをカテーテルに貼り、針が尾の走行に沿って静脈と平行に保持されるようにします。

カテーテルを固定した後、腹側および腫瘍表面を70% ethanolでスワブします。次に、腹部の皮膚をかき上げ、滅菌剪刀を用いて腹側正中線に沿って約1 cmの皮下切開を行い、腹膜を穿刺しないよう注意します。乳腺および腫瘍を腹膜から切り離すように結合組織を慎重に切断し、腫瘍を露出させます。

次に、鋏とピンセットを用いて、腫瘍の露出面から筋膜と脂肪を慎重に取り除きます。腫瘍が露出したら、マウスをあらかじめ温めておいたイメージングステージに移します。ラボテープを使用してカバーガラスを固定し、顕微鏡対物レンズ上のカバースリップを覆っているラバーパッドの穴に腫瘍を配置します。

動物を定位置に配置した後、組織の保湿を維持し、カバーガラスとの光学的な接触を保つため、ラバーパッドチャンバーにPBSを満たします。動物のバイタルサインをモニタリングするため、パルスオキシメータープローブのカラーセンサーを首に装着し、ヒートボックスを動物の上に設置します。次に、顕微鏡のIPを使用して、腫瘍表面の蛍光腫瘍細胞および血流のある血管が存在する領域に焦点を合わせます。

関心領域を選択した後、顕微鏡をマルチフォトンイメージングモードに切り替え、フォーカス調整器を使用して対物レンズを目的の開始位置まで移動させます。次に、「Z position top」ボタンをクリックしてzシリーズの上限を設定し、第二高調波発生（SHG）チャンネルで腫瘍表面のコラーゲン繊維ネットワークを可視化します。その後、対物レンズを目的のイメージング深さまで移動させ、「z position bottom」ボタンをクリックしてzシリーズの下限を設定します。

次に、ステップサイズのフィールドに希望の値を入力します。その後、「Time Lapse」パネルに切り替え、適切なタイムラプス時間を入力してください。イメージングパラメータが決定したら、カテーテルに取り付けられたシリンジを血管標識染料のシリンジに交換し、染料溶液が静脈に入っていることを確認しながら、最大 200 µL の染料溶液をゆっくりと投与します。

注入後、PBSシリンジをカテーテルに戻し、zステップタイムラプスイメージングを開始します。すべての画像が得られたら、ライン内に気泡が入らないように注意しながら、PBSシリンジを注入用タンパク質を含むシリンジに交換します。その後、タンパク質懸濁液をマウスにゆっくりと注入し、シリンジをPBSを含むシリンジに交換します。

マクロファージは、食細胞であるマクロファージ内に蓄積する蛍光標識された70 kilodaltonおよびデキストランを用いて追跡することが可能です。腫瘍細胞とマクロファージの両方を二重標識することで、これら2種類の細胞の直接的な相互作用をリアルタイムで可視化できます。また、腫瘍の血管透過性の変化を可視化するために、量子ドットを用いて血管腔を標識することも可能です。

これらは、動脈間隙を容易に拡散しない十分に大きなサイズであるためです。連続的な高解像度イメージングにより、血管透過性の事象を捉え、デキストランの血管外漏出および消失のキネティクスを定量化することが可能になります。この例の視野では、血管外のTMRシグナルによって示されるように、血管外漏出のピークが29分から34分の間に観察されます。

血管透過性を誘導するために追加の血管染料またはタンパク質を注入することで、血管透過性を制御するシグナル伝達事象に関する知見を得ることができます。実際に、注入後の数秒以内に、10 kilodaltonsのdextran FITCが血管外に漏出するのが観察される一方で、155 kilodaltonのdextran TMRは血管内にとどまります。この手法を習得すれば、適切に実施することで1時間で完了させることが可能です。

この手順を行う際は、腫瘍の表面を傷つけないように結合組織を慎重に除去し、腫瘍表面を常に湿潤状態に保つことが重要です。この細胞ダイナミクスの手順に従うことで、腫瘍細胞の遊走や血管内浸潤といった現象を可視化し、腫瘍細胞の遊走方向や浸潤に関するさらなる疑問を解明することができます。このビデオを視聴することで、生体多光子顕微鏡を用いて腫瘍微小環境におけるダイナミックな細胞イベントを可視化する方法について、十分に理解できるはずです。